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APPROCCIO STRUMENTALE ALLO STUDIO DELLA MATERIA VIVENTE
Le cellule e i tessuti si possono studiare sia dal punto di vista morfologico sia da quello biochimico e funzionale. L’analisi morfologica prende in esame l’organizzazione strutturale delle cellule e, allo scopo, si avvale dei microscopi.
L’analisi biochimica e funzionale ha lo scopo di studiare la natura chimica e le modalità di funzionamento delle cellule, delle loro parti e delle loro interazioni in ambito tissutale.
ANALISI MORFOLOGICA
Per conoscere l’organizzazione strutturale, ci si avvale dei microscopi. Esistono due tipi di microscopia, quella ottica e quella elettronica; ciò che le distingue è la natura del mezzo con cui si analizza l’oggetto, la luce o gli elettroni.
Microscopia ottica: viene definito limite di risoluzione R
𝑅 = (^) 2𝑛 𝑠𝑒𝑛𝛼𝜆 in cui
Il prodotto tra n e senα viene definito apertura numerica. Dato che l’indice di rifrazione dell’aria è pari a 1 e senα può anche essere approssimato ad 1, R risulta proporzionale a 1/2λ, cioè a metà della lunghezza d’onda della luce. Considerata ad esempio una lunghezza d0’onda di 400nm, il potere di risoluzione del microscopio ottico sarà 200nm, ossia 0.2μm. Per migliorare il potere di risoluzione di un MO, non potendo aumentare il valore di senα, una via è quella di aumentare l’indice di rifrazione del mezzo interposto, mediante una goccia d’olio in cui n=1.5 ed in questo caso si parlerà di osservazione microscopica a immersione.
In alternativa, si può utilizzare una luca ad una lunghezza d’onda minore, quale la luce ultravioletta (250- 350nm). Essendo la luce ultravioletta invisibile all’occhio umano, si fa ricorso a pellicole fotografiche sensibili all’ultravioletto per la cattura delle immagini. Il limite di risoluzione di 0.1μm può essere raggiunto utilizzando una lunghezza d’onda ancora minore, quali gli elettroni, ma che richiedono strumenti ancora più complessi dei microscopi ottici, cioè i microscopi elettronici.
λ è la lunghezza d’onda della luce n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra l’oggetto e la lente α è il semiangolo di apertura della lente obiettivo
Struttura di un microscopio ottico composto
Tubo paraottica sorregge gli oculari dal lato dell’osservatore e gli obiettivi dal lato del tavolino Gli obiettivi sono montati su una torretta girevole, detto revolver che consente una rapida sostituzione degli obiettivi. Tubo e tavolino sono montati insieme su un braccio ricurvo, il quale poggia su un basamento. Braccio e basamento vanno sotto il nome di stativo Per la messa a fuoco vengono utilizzate due dispositivi di spostamento, uno per i grandi spostamenti (vite macrometrica) e uno per i piccoli spostamenti (vite micrometrica).
cono di luce cavo; successivamente si trova un disco trasparente con una scalanatura circolare, posto nell’obiettivo, in modo date che i raggi di luce trasmessi vengono fatti passare nella scalanatura, mentre quelli diffratti passano dove il vetro è più spesso. I raggi diffratti vengono fatti congiungere. Il MO a contrasto di fase viene utilizzato per l’osservazione delle colture in vitro e delle cellule dei tessuti viventi. Esso infatti consente di evitare l’uso di coloranti nella maggior parte dei casi non possono essere utilizzati sui tessuti viventi, ma hanno bisogno di tecniche di manipolazione e uso di fissativi che possono provocare modificazioni chimiche e morte cellulare.
Microscopio ottico a luce polarizzata : la microscopia a polarizzazione utilizza, per l’illuminazione del preparato, una luce polarizzata, cioè una luce che vibra in un solo piano. Nel microscopio a polarizzazione vi sono due prismi aggiuntivi (detti Nicols): uno è il polarizzatore posto sotto il condensatore e l’altro, l’analizzatore, posto tra l’obiettivo e l’oculare. È utile per l’osservazione di preparati birifrangenti, cioè che presentano indici di rifrazione diversi.
Funzionamento: se i reticoli dei due prismi vengono incrociati tra di loro, si avrà nell’oculare un’immagine buia. In tale situazione, se viene inserito un preparato birifrangente, queste appariranno illuminate. Infatti queste strutture, allorché sono attraversate da luce polarizzata e scindono il raggio luminoso in un raggio ordinario e un straordinario. La vibrazione di quest’ultimo è ruotata di 90° per cui riesce a passare attraverso l’analizzatore dando una immagine luminosa. Ruotando l’analizzatore rispetto al polarizzatore e riscontrando a quanti gradi si verifica la massima luminosità, si riesce a dedurre l’orientamento delle strutture birifrangenti.
Microscopio ottico a interferenza : in questo microscopio, la luce emessa dalla sorgente è divisa in due raggi: l’uno è inviato direttamente al preparato, mentre l’altro segue un percorso differente. I due raggi si riuniscono in un secondo momento. Nei confronti del raggio diretto, quello che ha attraversato il preparato è ritardato, cioè ha subito un cambiamento di fase che è in funzione dello spessore dell’oggetto e dalla differenza tra l’indice di rifrazione dell’oggetto e quello dell’ambiente.
Microscopio ottico a fluorescenza : il preparato viene illuminato da una luce ultravioletta, la cui sorgente è una lampada a vapori di mercurio. La fluorescenza è il fenomeno per cui determinate sostanze, colpite dalla radiazione ultravioletta, emettono luce di lunghezza d’onda maggiore (e quindi sono visibili). Si possono avere due tipi di fluorescenza:
Fluorescenza naturale, prodotta dalle sostanze presenti nel tessuto come la vitamina A, la riboflavina, porfirine e clorofille Fluorescenza secondaria, indotta dalla colorazione con coloranti fluorescenti, detti fluorocromi. Al giorno d’oggi esistono svariati fluorocromi: o Arancio di acridina, che ha una particolare affinità per le nucleoproteine e gli acidi nucleici o Ioduro di propidio che colora in rosso il dna o Il dapi (diamidino-fenilindolo cloridrato) che da una intesa colorazione blu al dna, specie per i tratti ricchi in adenina e timina o Fluoresceina isotiocianato per la marcatura di anticorpi, utilizzati per l’identificazione di eventuali antigeni all’interno del tessuto.
Un tempo, la lampada ai vapori di mercurio, veniva posta al di sotto del condensatore. Per evitare danni alla vista, la luce ultravioletta veniva fermata prima che arrivasse all’oculare, da una serie di filtri di sbarramento, per cui all’occhio arrivavano solo i raggi emessi per fluorescenza. Tale sistema veniva definito
ipofluorescenza, ma che era poco sensibile a causa dell’elevata quantità di luce che veniva assorbita da parte dei dispositivi ottici.
Attualmente si utilizza la tecnica dell’epifluorescenza, nel quale il preparato viene eccitato dall’alto. Non tutti gli obiettivi sono adatti per la microscopia a fluorescenza, ma si devono utilizzare appositi obiettivi definiti obiettivi a fluorite e sono indicati con la sigla FLUOR.
Microscopio ottico confocale : nella microscopia ottica tradizionale, il preparato è ridotto in sottili sezioni: tanto più la sezione è sottile, maggiore sarà la qualità dell’immagine. Nl processo di sezionamento, si perde la tridimensionalità dell’oggetto da osservare; se poi si osserva la struttura biologica senza sezionarla, l’eccessivo spessore dà immagini confuse, dovute alla sovrapposizione del piano focale su cui è stato regolato il microscopio, con i piani immediatamente soprastanti o sottostanti. L’inconveniente può essere superato mediante il microscopio confocale il quale, mediante dispositivi elettronici, focalizza un solo piano per volta, eliminando le informazioni luminose che provengono dai piani soprastanti e sottostante, registrando una precisa sezione ottica sottile. Dall’unione delle immagini di tutte le sezioni ottiche sottili è possibili ricostruire l’immagine tridimensionale, mediante l’ausilio di un computer, anche se è di notevole spessore.
Allestimento dei campioni
I due principali procedimenti di analisi morfologica sono l’osservazione diretta di cellule e tessuti viventi e di tessuti uccisi con procedimenti che ne conservano le immagini il più a lungo possibile.
Alcune cellule isolate dall’organismo (cellule del sangue, cellule embrionali, cellule connettivali) possono restare in vita per un tempo breve e possono essere osservate al microscopio a contrasto di fase. In questo caso vengono utilizzati dei coloranti vitali, cioè coloranti capaci di colorare selettivamente alcune cellule, permettendone l’identificazione. La colorazione può essere effettuata in due modalità diverse:
Colorazioni vitali, se il colorante viene iniettato nell’animale intero Colorazioni sopravitali, se si immerge un pezzo di organo prelevato dall’animale nel liquido colorante
Alcuni coloranti vitali molto utilizzati sono:
Blu trypan Tionina Litiocarminio Inchiostro di china Alizarina, che viene incorporata nella sostanza fondamentale dell’osso in via di calcificazione, colorandola in rosso Verde Janus, colora selettivamente i mitocondri in virtù dell’ambiente ossidante all’interno di questi organelli citoplasmatici: il colorante viene ridotto diventando incolore nel citoplasma, mentre riamane nello stato ossidato nel mitocondrio, che risulterà colorato in verde
Tali tecniche sono limitate dalla poca sopravvivenza delle cellule, per cui si rende necessario un processo che impedisca le alterazioni post mortem delle cellule (fissazione), rendere il campione trasparente alla radiazione utilizzata (inclusione e sezionamento) e successivamente mettere in evidenza le varie strutture mediante colorazione istologica.
Vengono fagocitati dai macrofagi e accumulati sotto forma di vacuoli citoplasmatici.
definito vetrino copri oggetto, che viene fatto aderire con resine trasparenti che successivamente solidificano.
Colorazioni istologiche: si distinguono delle colorazioni dirette e colorazioni indirette. Le prime quando le sezioni prendono il colorante direttamente dalla soluzioni, mentre le seconde quando il preparato, ancor prima di essere colorato, deve essere sottoposto all’azione di sostanze preparatorie (mordenti), spesso soluzioni di sali di alluminio, di ferro o di cromo.
Le colorazioni possono esser semplici se si utilizza un solo colorante, oppure combinate se si utilizza vari tipi di colorante, in successione o simultaneamente.
I coloranti possono essere naturali o artificiali. I coloranti naturali sono estratti dagli animali (per esempio il carminio che si estrae dalle uova di cocciniglia) o da vegetali (come l’ematossilina che si estrae dal legno delle leguminacee). I coloranti artificiali appartengono per la maggior parte alla seria aromatica, in genere derivanti dall’anilina. La combianzione più comunemente utilizzata è l’ematossilina-eosina con la quale i nuclei assumono l’ematossilina colorandosi in bruno e tutto il resto si colora in rosa con l’eosina.
I metodi tricromici, oltre al colorante per nucleo contengono altri tipi di coloranti come:
Arancio G per il citoplasma Blu di anilina o di metile che colorano le fibre di collagene previo trattamento con mordente (acido fosfotungstico o molibdico)
Microscopia elettronica
Utilizzando una lunghezza d’onda minore, quale è il fascio di elettroni, e possibile superare il limite di risoluzione di 0.2μm della microscopia ottica. È noto da tempo che un fascio di elettroni, attraversando un campo magnetico, viene focalizzato secondo le stesse leggi dell’ottica convenzionale. Se tali particelle cariche negativamente viene sottoposta un’accelerazione, è possibile associarne una lunghezza d’onda del valore di
Dove V è la differenza di potenziale utilizzata per accelerare gli elettroni. Con tensioni dell’ordine di 50.000V, si ottiene una lunghezza d’onda pari a 0.05nm. Su queste basi fu costruito il primo microscopio elettronico, in cui la sorgente luminosa era data da un fascio di elettroni e le lenti costituite da elettromagneti. Gli elettroni, per essere usati come mezzo di analisi, una volta che hanno lasciato un filo di tungsteno incandescente, vengono accelerati mediante l’applicazione di una differenza di potenziale, lungo la colonna del microscopio; inoltre, gli elettroni, durante il loro percorso, non devono incontrare ostacoli, per cui, nella colona del microscopio, detta anche cannone viene creato il vuoto.
Gli elettroni attraversano il preparato: alcuni vengono assorbiti, altri deviati ed altri ancora continuano il loro percorso. In questo modo contribuiscono alla formazione dell’immagine su uno schermo fluorescente, che converte la radiazione elettronica non visibili, in una radiazione fotonica in luce verde visibile, oppure possono essere visualizzati su una lastra o ancora essere visualizzati in un monitor.
Le lenti sono di tipo elettromagnetico, cioè costituite da un solenoide che crea un campo, le cui linee di forza fanno convergere gli elettroni in un punto, detto fuoco.
Allestimento dei campioni
Poiché gli elettroni hanno uno scarso potere di penetrazione, i preparati devono essere ridotti in fette molto sottili, dell’ordine di 50-80nm.
- FISSAZIONE = il fissativo più utilizzato è il tetrossido di osmio o la glutaraldeide. Se viene utilizzata la glutaraldeide viene fatta seguire da una post fissazione con acido osmico, che agisce come colorante sia per il suo numero atomico elevato, per cui i costituenti a cui si lega diventano densi di elettroni e sia perché si lega come osmio ridotto alle lipoproteine.
- DISIDRATAZIONE = lavaggi in alcol etilico o acetone in concentrazioni crescenti
- CHIARIFICAZIONE = allontanamento dell’alcol e del residuo di acqua mediante l’utilizzo di ossido di propilene.
- INCLUSIONE E SEZIONAMENTO = per ottenere sezioni molto sottili si fa ricorso all’inclusione in resine epossidiche che impregnano il tessuto e poi vengono fatte polimerizzare mediante un catalizzatore. Per ottenere le sezioni di 50-80nm viene utilizzato un particolare microtomo, definito ultramicrotomo che utilizzano lame di vetro o diamante. Le sezioni così ottenute vengono stese su una lamina di collodio, di carbone o di qualche altra sostanza applicata su un retino metallico
- COLORAZIONE A CONTRASTO = per aumentare il contrasto dei preparato si fa ricorso ai coloranti elettronici, che sono sali di atomi pesanti, come l’acetato di uranile e il citrato di piombo, che si legano selettivamente ad alcune strutture del preparato aumentandone il contrasto. Una tecnica utile per lo studio delle macromolecole è detta tecnica del monostrato di Kleinschmidt, con la quale le molecole vengono raccolte su una pellicola di supporto, dopo che sono state distese su una interfaccia aria-acqua. Il contrasto e il rilievo di tali strutture biologiche, viene ottenuto con la cosiddetta ombreggiatura. In particolare l’ombreggiatura rotativa consiste nel far adsorbire le strutture in esame su un supporto liscio, che viene posto su un tavolino rotante posto in una camera in cui viene creato il vuoto. Nella camera si trova anche un filamento di tungsteno sul quale viene fissato anche il filo di un altro metallo pesante, di solito il platino. Mentre il campione ruota, il filo di tungsteno viene portato a incandescenza facendo evaporare il platino aderente ad esso, che viene spruzzato sulle strutture biologiche, ricoprendole con un film di platino estremamente sottile. Il film viene stabilizzato con un leggero strato di carbone e quindi staccato dal supporto e dalle strutture biologiche. Si ottiene così una replica che può essere osservata al microscopio elettronico.
Una tecnica impiegata per l’osservazione dei virus è quella della colorazione negativa, in cui la struttura da prendere in esame viene impregnata con una soluzione di sali di metalli pesanti, che penetra negli spazi vuoti delle macromolecole. Tali spazi appariranno neri, mentre lo spazio occupato dalle macromolecole apparirà bianco, come in un negativo fotografico. È possibile ricorrere anche a traccianti che si rendono visibili grazie alla loro opacità agli elettroni, utili per gli studi sulla pinocitosi, sulla fagocitosi e il trasporto delle sostanza attraverso le barriere cellulari.
Una tecnica di preparazione per lo studio di preparati al microscopio elettronico è quella del congelamento-frattura e del criodecappaggio. Il materiale in esame viene sottoposto a congelamento rapido a -150°C, trasferito nel vuoto e quindi fratturato con una lama. La superficie di rottura viene
avviene mediante l’utilizzo di coloranti liposolubili: Sudan nero B Sudan III Solfato di blu Nilo Poiché i lipidi si sciolgono facilmente nei rischiaranti, non si possono includere nella paraffina in quanto lo xilolo li scioglierebbe. Se si vuole osservare il grasso presente negli adipociti, dopo la fissazione, il pezzo deve essere tagliato al criostato e le sezioni devono essere trattate con uno dei coloranti appositi. Il colorante diffonde all’interno delle goccioline lipidiche, mettendole in evidenza. Il montaggio del copri oggetto avviene mediante gelatine idrosolubili. L’osservazione del grasso può avvenire anche mediante le tradizionali tecniche di fissazione, ma previa trattazione in acido osmico, che reagendo con gli acidi grassi insaturi, dà luogo a composti insolubili nello xilolo.
reazione di PAS (acido periodico di Schiff), usata per mettere in evidenza: Polisaccaridi neutri Glicogeno Amido Cellulosa Mucine Glicoproteine Il reattivo di Schiff utilizzato per questa reazione, consiste di fucsina basica ridotta e colorata con acido solforoso. Tramite una preventiva ossidazione con acido periodico, i gruppi glicolici, dove presenti, vengono convertiti in gruppi aldeidici che interagiscono con la fucsina ridotta (incolore) riossidandola e riportandola all’intensa colorazione rossa. I GAG acidi si colorano con Alcian blu o blu di toluidina. Dato il loro contenuto di gruppi acidi, sono basofili e intensamente metacromatici (metacromasia= il colore del colorante è diverso dal proprio quando si trova nei tessuti); data questa loro caratteristica, quando sono colorati utilizzando il blu di toluidina, il blu del colorante diventa rosso-viola.
rischiaranti esercita un’azione inattivante degli enzimi, il materiale deve essere preparato in maniera particolare; in molti casi si esaminano sezioni non fissate e ottenute al criostato; altri enzimi resistono alla fissazione in acetone a freddo o in formaldeide. In genere i metodo istologici per gli enzimi sono basati sull’incubazione in presenza del substrato per l’enzima: il substrato viene attaccato dall’enzima, con formazione di un prodotto di reazione insolubile che è già colorato o che può essere reso visibile al microscopio mediante procedimenti successivi; ciò che viene messo in evidenza non è l’enzima, ma il prodotto dell’azione dell’enzima stesso (ossidasi, deidrogenasi e fosfatasi).
RNA, data la presenza nelle loro molecole di un alto numero di gruppi fosfati, presentano un’alta affinità per i coloranti basici (blu di toluidina). Un metodo per lo studio degli acidi nucleici è quello di Brachet, un metodo che prevede l’utilizzo di verde di metile e la pironina; il verde di metile colora prevalentemente la cromatina nucleare, mentre la pironina colora soprattutto l’RNA. Pe la dimostrazione del DNA si ricorre spesso alla reazione di Feulgen: le sezioni da esaminare vengono trattate con idrolasi acide con HCl. Grazie a questo trattamento, dal DNA, vengono allontanate le purine a livello del legame glucosidico, mascherando i gruppi aldeidici del deossiribosio che reagiscono con il reattivo di Schiff, ossidandolo e riportandolo alla colorazione rossa; così le zone colorate contenenti il DNA vengono colorate in rosso, mentre le zone contenenti RNA restano incolore. Gli acidi nucleici possono essere identificati anche mediante fluorescenza, con l’utilizzo di fluorocromi (arancio di acridina)
Immunoistochimica
L’immunoistochimica permette l’identificazione di una ben precisa molecola. Tali sostanze fungono d antigene, per ciascuno dei quali si possono ottenere i rispettivi anticorpi. Gli anticorpi specifici vengono coniugati con una sostanza fluorescente (fluoresceina) o con una molecola opaca agli elettroni, quale la
ferritina. Le sezioni di tessuto sono poi esposte all’anticorpo, in modo che questo si leghi ai siti del tessuto in cui è presente il suo antigene. Se l’anticorpo marcato si lega all’antigene, allora si formerà un complesso anticorpo-antigene visibile al microscopio a fluorescenza; con la marcatura mediante ferritina, sarà possibile visualizzarlo al microscopio elettronico.
Quando si fa legare l’anticorpo marcato all’antigene, si parla di marcature diretta. Esiste anche un metodo indiretto, con il quale l’antigene viene fatto reagire prima con un anticorpo non marcato (anticorpo primario) e successivamente, una volta formato il complesso antigene-anticorpo, si fa reagire con un anticorpo marcato (anticorpo secondario). Più copie di anticorpo secondario si possono legare all’anticorpo primario con il risultato di dare un segnale più evidente. L’identificazione dell’anticorpo secondario, oltre che per fluorescenza, può avvenire anche con metodo colorimetrici, mediante l’utilizzo dell’enzima perossidasi: tale enzima può esser coniugato all’anticorpo secondario e successivamente rivelato per mezzo di una reazione con acqua ossigenata e diaminobenzidina (DAB). L’azione dell’enzima sul substrato determina la formazione di un precipitato di colore rosso che consente di localizzare l’antigene.
Si può anche localizzare l’anticorpo secondario, mediante l’utilizzo di isotopi radioattivi come ad esempio lo iodio oppure l’anticorpo può legare delle particelle di oro colloidale che hanno l’aspetto di sfere elettronopache e perciò si prestano bene all’osservazione al microscopio elettronico.
