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Spettroscopia NMR basata su interazione radiazione materia : eccitazione – assorbimento- emissione. Il rilassamento avviene rilasciando l’energia del reticolo. Ci interessa la differenza di energia tra lo stato eccitato e quello fondamentale che in NMR determina posizione e forma dei picchi che dipendono da:
- Struttura del sistema: connettività (chi è legato a chi) e vicinanza (chi è vicino a chi)
- Mobilità: fenomeni dinamici nel sistema (es. rotazioni della molecola o sue parti)
- Quantità: legata alla differenza di popolazione tra i due stati. L’NMR studia l’interazione tra lo spin nucleare e un campo magnetico esterno (statico). Si utilizzano le radio frequenze e bisogna usare la frequenza giusta ovvero quella che fitta la differenza di energia tra i due stati. NMR: Magnetical (campo magnetico) Nuclear (studiamo spin nucleare) Resonance (condizione di energia). SPIN NUCLEARE Lo spin nucleare (I) è il numero quantico del momento angolare nucleare totale; a cui è associato un numero quantico magnetico m che può assumere valori da +I a - I e che definisce l’orientazione dello spin. I può avere valore intero, frazionario o nullo; solo se l’atomo ha un numero dispari di protoni si avrà lo spin nucleare e si potrà fare l’NMR. Gli elementi che utilizziamo noi sono quelli che hanno spin = ½ (esistono quelli con spin > ½ ma gli spettri sono complessi e non li trattiamo) e in particolare usiamo il 13 C e 1 H. Allo spin nucleare è associato un momento angolare L definito per convenzione con una freccia, siccome lo spin ha solo valori discreti, il momento angolare è quantizzato. 𝐿 = 𝐼(𝐼 + 1 ) ħ Dato che il nucleo è carico perché ci sono i protoni, il momento angolare + la carica del nucleo, generano un momento magnetico μ che fa sì che i nuclei con uno spin si comportino come dei piccoli magneti. μ = γ L = γ 𝐼(𝐼 + 1 ) ħ γ, definita come rapporto giromagnetico, è un’altra proprietà del nucleo e specifica di ogni isotopo che ha valore maggiore di zero se momento magnetico e spin angolare hanno la stessa direzione e valore minore di zero quando hanno direzione opposta. INTERAZIONE TRA IL NUCLEO E IL CAMPO MAGNETICO Prima di inserire il campione nello spettrometro NMR, i nuclei hanno spin orientati casualmente. Una volta immersi nel campo magnetico, questi si comportano come magneti e si dispongono lungo l’asse del campo. Gli spin si orientano lungo l’asse del campo magnetico solo in direzioni preferenziali, che dipendono dal numero quantico magnetico; se lo spin vale + ½ , m = + ½ o - ½ e quindi le due orientazioni possibili sono parallela all’asse o antiparallela all’asse. Definiamo α lo stato orientato parallelamente quindi + ½ e β lo stato orientato in modo antiparallelo ovvero – ½. Dal punto vista energetico, l’orientazione parallela è favorita e quindi lo stato α sarà ad energia minore dello stato β. Effetto Zeeman = rimozione della degenerazione dei livelli ( fuori da B tutti a stessa energia). Con questa formula possiamo calcolare l’energia dei due livelli (sostituiamo m con + o – ½ ), e quindi possiamo ricavare il ΔE tra i due livelli. Una volta immersi nel campo magnetico ed dunque allineati, gli spin non stanno fermi (principio indeterminazione di Heisenberg) ma si muovono con un moto di precessione. la frequenza a cui precedono è detta precessione di Larmor e dipende da γ e da B. Siccome B è fissato e γ è specifica per gli isotopi, se cambia l’isotopo cambia la frequenza di precessione degli spin; questo apre le porte all’NMR multinucleare.
CONDIZIONE DI RISONANZA
Dobbiamo utilizzare un impulso di radiofrequenza che fitti esattamente la differenza di energia (γħB0) fra i due livelli energetici, tra lo stato fondamentale (α) e quello eccitato (β). Eguagliando l’energia dell’impulso alla differenza di energia tra i livelli troviamo che la frequenza di risonanza è la frequenza di Larmor. Quindi, quando la frequenza dell’impulso eguaglia la frequenza di Larmor si ha assorbimento di energia con conseguente cambio di orientazione dello spin. Gli spin si distribuiscono tra i due livelli secondo la distribuzione di Boltzmann che dipende dalla T. Al diminuire della temperatura aumenta la popolazione nello stato a e la differenza di energia. In generale i due stati sono similmente popolati, con un leggero eccesso di popolazione in a; questo fa sì che tutte le coppie di spin si annullino ma che rimangano degli spin spaiati in a che quindi genereranno una magnetizzazione macroscopica il cui vettore è orientato lungo l’asse z del campo magnetico. Anche la magnetizzazione macroscopica precede alla frequenza di Larmor. La differenza di energia che compare nella distribuzione di Boltzmann dipende da γħB 0 , considerando inizialmente solo la dipendenza da B 0 più è intenso il campo magnetico e maggiore è la differenza di popolazione. Usando 9.4 T la differenza di spin (quelli che usiamo) è di soli 64. Da questo si capisce che il primo problema dell’NMR è la sensibilità perché ci sono pochi spin che generano il segnale. Possiamo fare due considerazioni :
- Aumentando l’intensità del campo magnetico, aumenta la separazione tra i livelli energetici e quindi aumenta intensità del segnale e sensibilità;
- Siccome ΔE dipende da γħB0, a parità di campo i nuclei con un valore di γ maggiore avranno una maggiore separazione dei livelli energetici e di conseguenza una sensibilità maggiore. Quindi : l’intensità di un segnale NMR dipende dalla differenza di popolazione che a sua volta dipende da γ, B e T (legge di Boltzmann). Il nucleo 1 H è l’isotopo con il valore di γ maggiore quindi sarà uno dei nuclei più sensibili, esso ha un’abbondanza isotopica naturale del 99,9% quindi mettendo insieme questi due criteri, l’idrogeno è il nucleo più sensibile della tavola periodica L’ESPERIMENTO NMR Quando si invia un impulso a radiofrequenza che soddisfa la condizione di risonanza, le popolazioni dei due stati si eguagliano con conseguente annullamento della magnetizzazione netta che ora è orientata non più sull’asse z ma sul piano x-y dove è posizionato il ricevitore. Quando termina l’impulso si è in una situazione di eccesso di popolazione nello stato b dove alcuni degli spin rilassano e tornano allo stato a con conseguente riallineamento della magnetizzazione netta lungo l’asse del campo magnetico. Dopo il riallineamento della magnetizzazione lungo z si manda un nuovo impulso e così via per n impulsi fino a quando il rapporto S/N non sia soddisfacente.
Usiamo i ppm perché ci svincoliamo dalle frequenze di risonanza ovvero qualsiasi campo utilizziamo, l’acetilene lo troviamo sempre a 1.8 ppm e il TMS è sempre 0 ppm. Anche il chemical shift dipende dal campo perché è causato dalla circolazione degli elettroni nella molecola indotta dal campo magnetico, quindi con un campo più intenso la velocità con cui circolano è maggiore e viceversa. Quindi variando il campo, il chemical shift in frequenze varia mentre in ppm rimane sempre lo stesso. Dipendenza del chemical shift Dipende da 3 fattori :
- termine diamagnetico σd = dipende dalla circolazione degli elettroni negli orbitali s, è il termine più importante per l’^1 H che ha elettroni sono in s. Causa shift a basse frequente (schermante)
- termine paragmatico σp = dipende dalla circolazione degli elettroni negli stati eccitati e non degli orbitali p. è il termine che influisce maggiormente su tutti gli altri elementri della tavola periodica. Causa shift ad alte frequenza (deschermante)
- Anisotropia dei gruppi vicini σ’ = dipende dall’intorno chimico, non tutti i CH 3 o tutti i CH 2 danno lo stesso segnale. Causa uno shift di meno di un ppm, quindi, è importante del 1 H dove la scala dei ppm è molto corta mentre è insignificante per gli altri elementi. Scala 1 H dei chemical shift Gli spostamenti dei segnali sono dovuti a diversi fattori :
- effetto induttivo dei sostituenti elettronegativi = sostituenti elettron-attrattori come il Cl sottraggono densità elettronica, riducono il σd e quindi hanno effetto deschermante. I protoni via via più lontani (in beta e in gamma) risentono sempre meno di questo effetto. L’azoto e lo zolfo spostano il chemical shift intorno a 3-4 ppm mentre l’ossigeno è quello che descherma più di tutti perché è il più elettronegativo.
- effetto mesomero (anelli aromatici) = dipende dai gruppi legati all’anello. I gruppi detti orto e para direttori, sono delle specie reattive verso gli elettrofili e localizzano la carica sulle posizioni orto e para ma mai in meta. Un esempio è l’NH2 ; dalle strutture di risonanza si vede che la carica è localizzata due volte in orto e infatti nello spettro quelli in orto sono gli H più schermati. I gruppi meta direttori invece disattivano l’anello rispetto ad attacchi elettrofili (ovvero mettono carica +). Un esempio è l’NO2 per cui viene localizzata la carica + due volte in orto e una in para quindi il più deschermato in questo caso è l’idrogeno in meta perché non ha mai la carica positiva mentre orto e para sono invertiti rispetto al caso precedente.
- l’effetto legato al l’ibridazione del carbonio sp, sp^2 , sp^3 = dovuto al fatto che gli elettroni si avvicinano via via al nucleo di C e si allontanano da quello di H che quindi sarà deschermato. Secondo questa teoria i tripli legami dovrebbero cadere a ppm molto alti (7-9) mentre invece li troviamo a 2-3 ppm (più bassi dei doppi legami) questo è dovuto all’effetto dell’anisotropia magnetica perché a causa della particolare geometria del triplo legame, si genera un campo magnetico locale opposto a quello esterno che genera un cono di schermo lungo l’asse di legame ovvero dove si trovano gli H che quindi saranno schermati. Lo stesso effetto si osserva anche negli anelli benzenici, infatti, sono C sp^2 ma i segnali dell’anello li troviamo a
chemical shift molto più alti rispetto alle olefine proprio perché il campo magnetico locale che si genera si somma a quello esterno e quindi serve una frequenza maggiore per avere risonanza. Un caso molto accentuato di questo effetto è quello dell’annulene, una struttura ciclica con atomi di H interni ed esterni. Tutti gli H all’esterno sono deschermati e cadono ad alte frequenza (7ppm) mentre gli idrogeni interni sono in una zona di schermo e il loro segnale cade a - 3 ppm. Effetto del solvente Dovuto alla differenza tra legame intra e inter molecolare. Nel caso di un’aldeide, l’H forma un legame intramolecolare che è un legame abbastanza forte e quindi si forma a prescindere dalla presenza o meno del solvente. Nel caso dell’etanolo invece, l’H può formare un legame intermolecolare con le altre molecole di etanolo ma se è presente il solvente questo non succede. Nel caso di idrogeni che scambiano come OH o NH il chemical shift è difficile da determinare, nello spettro rosso in alto è l’OH da un tripletto mentre a bassi ppm dà un singoletto allargato (panettone) Accoppiamento scalare o indiretto – J coupling La forma dei segnali dipende dalla j coupling, un’interazione spin-spin mediata dagli elettroni di legame (non c’entra più il campo) e questo implica la presenza di legami covalenti tra i due spin che sono accoppiati tra loro. a) due nuclei senza spin = elettroni hanno stessa energia b) uno dei due nuclei con spin = abbiamo due livelli energetici, uno spin nucleare ha un’interazione più favorevole con uno spin elettronico di segno opposto. c) due nuclei entrambi con spin = possiamo avere diverse orientazioni, bb ( ↓↓) , aa( ↑↑) oppure uno ab( ↑↓) l’altro ba( ↓↑) , con diverse energie. Consideriamo due spin, uno di H e uno di C. nel caso in cui non siano legati covalentemente tra loro, la costante di accoppiamento scalare è zero. Possiamo avere 4 situazioni, entrambi in a, H in a e C in b, H in b e C in a oppure entrambi in b. Il salto per ottenere lo spin flip (A1 e A2) ovvero la frequenza di Larmor, è uguale per entrambe le transizioni, sia degli H che degli C. Se invece c’è un legame covalente tra i due e quindi ci sono due elettroni di legame, le energie cambiano: quando l’idrogeno è in a si avvicinano i due livelli di energia mentre si allontanano quando è in b. Se A1 è diverso da A2 si ottengono due segnali a una distanza pari a J e siccome H è accoppiato a C, J è uguale per entrambi. L’integrale del picco rimane 1 ma nel secondo caso le altezze sono dimezzate perché il segnale è sdoppiato.
Molteplicità dei segnali La regola della molteplicità è 2nI+1, dove I è lo spin nucleare, n è il numero di nuclei magneticamente equivalenti. Se non c’è accoppiamento n=0 e il segnale è un singoletto, se accoppia con un altro atomo n=1 e il segnale sarà un doppietto. Segue lo schema del triangolo di Tartaglia: la distanza tra i picchi è sempre uguale mentre l’altezza corrisponde ai numeri del triangolo. Quindi la molteplicità ci dà informazioni sulla connettività ovvero ci dice chi c’è vicino all’H del segnale che stiamo guardando. Accoppiamento con atomi equivalenti o non equivalenti Quando un H è accoppiato con degli H equivalenti, si ottiene un unico segnale che sarà un doppietto, tripletto o quartetto in base al fatto che l’H sia accoppiato con un CH, CH2 o CH3. Quando si ha un accoppiamento con atomi non equivalenti, ovvero non simmetrici, si ottengono diversi segnali:
- Nel primo caso si accoppia ad Ha e quindi genera un doppietto.
- Nel secondo caso, si accoppia sia con Ha che con Hb (non sono equivalenti, Jtrans > Jcis). Quindi si ha prima l’accoppiamento con Ha che genera un doppietto con distanza Ja e poi si ha un’ulteriore sdoppiamento del segnale dovuto al fatto che H vede anche Hb e quindi si ottiene un doppietto di doppietti.
- Nel terzo caso, H vede anche Hc (legato a C altrimenti sarebbero equivalenti) e quindi si ottiene un doppietto di doppietti di doppietti. CASI PARTICOLARI : Se nel secondo caso al posto di Hb avessimo un CH2 - > il primo accoppiamento è sempre il più grande quindi quello con Ha per cui si genera un doppietto (Ja più grande) dopodiché si ha un ulteriore accoppiamento con i due H del CH2 (J minore) che genera un tripletto per ognuno dei due segnali sdoppiati. Si ottiene un doppietto di tripletti. Se abbiamo un C accoppiato ad un atomo di D, ad esempio il CDCl 3 , in questo caso si segue sempre la regola della molteplicità 2nI+2 ma questa volta n=2 e I = 1 (non più ½) quindi la molteplicità viene 3 ma non si segue più il triangolo di Pascal; si ottiene un tripletto con segnali di uguale intensità perché la probabilità che il deuterio sia parallelo, antiparallelo o perpendicolare al campo magnetico è molto simile (I=1 vuol dire 3 possibili orientazioni). Se al posto del cloroformio mettiamo il diclorometano CD 2 Cl 2 , n=2 e I=1 quindi molteplicità = 5. Il carbonio si accoppia prima con un D dando come prima un tripletto si uguale intensità dopodiché si ha un ulteriore sdoppiamento legato all’accoppiamento con l’altro D che genera a sua volta per ogni componente un tripletto. Ma siccome i due D sono equivalenti, alla fine ritroviamo il triangolo di tartaglia per cui si ottiene un quintupletto con segnali si intensità 1 2 3 2 1. Dobbiamo considerare altri 3 fattori legati alla costante di accoppiamento scalare che sono :
- Equivalenza degli atomi (chimica e magnetica)
- Sistemi di spin e loro notazione
- Spettri del 1 e 2 ordine 1.CONCETTO DI EQUIVALENZA Nuclei chimicamente e magneticamente equivalenti non accoppiano tra di loro. Prendiamo come esempio la molecola di acetilene; teoricamente dovremmo vedere due doppietti che valgono 1 e invece vediamo un solo segnale. Questo perché considerando un idrogeno con uno spin in beta e uno in alfa, la situazione inversa è equivalente dal punto di
vista energetico. Quindi quando abbiamo una molecola completamente simmetrica è come se ne considerassimo solo metà. Equivalenza per chemical shift = se il sistema è simmetrico, l’intorno locale da una parte è uguale all’intorno locale dall’altra e quindi il chemical shift è uguale; lo stesso vale quando il sistema ruota o scambia gli idrogeni (sono sempre uguali). L’equivalenza per scambio chimico si verifica ad esempio per i protoni di un metile; essi sono rapidamente interconnettibili ossia possono passare facilmente uno al posto dell’altro perché si ha rotazione intorno al legame C-C. (isocronia = equivalenza chimica) Equivalenza magnetica = i protoni sono magneticamente equivalenti se hanno la stessa costante di accoppiamento con tutti gli altri idrogeni che stanno accoppiando. Nel caso del diflurometano i due H sono equivalenti per simmetria e anche magneticamente perché le costanti di accoppiamento dei due idrogeni con lo stesso atomo di fluoro sono uguali visto che lunghezza e angoli di legame sono identici. Quindi avremo un segnale che integra due ed è un tripletto perché accoppia con due F. Nel caso del 1,1-difluoroetilene i due H sono simmetrici ma le costanti di accoppiamento sono diverse perché uno è in cis e uno in trans. Quindi avremo due segnali che integrano 1 e sono due doppietti con due costanti di accoppiamento diverse.
2. SISTEMI DI SPIN E LA LORO NOTAZIONE Un sistema di spin è un insieme di spin accoppiati tra loro, non tutti devono essere accoppiati con tutti quindi all’interno di una stessa molecola si possono avere più sistemi di spin. Quando i nuclei sono chimicamente non equivalenti, vengono indicati con lettere dell’alfabeto diverse - > si usano lettere vicine per gli H che hanno chemical shift vicini mentre lettere più distanti tra loro nel caso di chemical shift molto diversi. Nel caso qua sotto, ad esempio, solo il CH2 legato al Cl viene shiftato a chemical shift molto alti rispetto agli H alifatici e quindi invece di assegnargli la lettera D (vicina a C), gli assegniamo X. Completa la notazione un pedice che indica il numero di idrogeni chimicamente equivalenti del gruppo. Nel caso di gruppi chimicamente equivalenti ma magneticamente non equivalenti, si usano le stesse lettere ma con l’apostrofo. Esempi sulla notazione del sistema di spin:
L’isomero in para è simmetrico quindi i due H in alto danno un segnale e i due in basso danno un segnale. Siccome si accoppiano tra loro avremo due doppietti (spettro 3) L’isomero in orto deve dare due doppietti e due tripletti (spettro 1) L’isomero in meta deve dare un singoletto, due doppietti e un tripletto (spettro 2). Per questi segnali complessi bisogna collassare le long-range ovvero, prendendo il primo segnale a destra del primo spettro, è un doppietto (J aromatica) di doppietti (J long- range) ma lo consideriamo solamente un doppietto. EFFETTO DELLA J-COUPLING SULLA MAGNETIZZAZIONE Se prendiamo in considerazione un doppietto, lo sdoppiamento del segnale significa che quel nucleo non è più descritto da un singolo vettore di magnetizzazione perché questo ruotando alla frequenza del chemical shift, passa davanti al ricevitore generando un segnale che è un singoletto. Quindi un doppietto si può descrivere attraverso due vettori di magnetizzazione che ruotano a frequenze leggermente diverse, è come se il vettore si dividesse in due con una componente che viaggia in senso orario e l’altra in senso antiorario con velocità +J/ e - J/ SPETTRO DEL 13 C Abbiamo un range di chemical shift più amplio (0-220 ppm) perché interviene solo il sigma para. Di conseguenza è molto più difficile avere picchi sovrapposti e il chemical shift diventa più sensibile agli intorni locali. Il chemical shift è influenzato da : elettronegatività dei sostituenti e ibridazione del carbonio. L’effetto dei sostituenti come per l’H si propaga lungo la catena andando a scemare. Il difetto degli spettri 13C è che non possiamo integrare quindi sono semi-quantitativi. C’è un trend comune con la scala per l’1H :
- 0 - 50 ppm : alifatici CH3, CH2,CH
- 50 - 80 ppm : alifatici legati a sostituenti elettronegativi
- 70 - 90 ppm : alchini
- 100 - 155 ppm : aromatici o alifatici (C sp2)
- 190 - 210 ppm : carbonili (carbossilici, esteri, aldeidi, chetoni) EFFETTO GAUCHE = Dobbiamo anche considerare il sostituente/atomo in gamma rispetto al C che stiamo osservando. L’effetto gamma è schermante, quindi sposta a chemical shift più bassi ed è dovuto ad na compressione sterica perché i raggi di VDW dei due atomi sono molto vicini quindi si ha uno spostamento degli elettroni di legame maggiormente verso il C in gamma. Conformazione SIN ha effetto maggiore rispetto ad ANTI. Lo stesso vale per gli alcheni sostituiti; se abbiamo un OH in trans rispetto al C in gamma il chemical shift sarà di 29ppm mentre se è in cis sarà a 21 ppm. In molto casi serve il confronto con lo spettro protonico: se abbiamo un segnale a 180 andiamo a vedere sull’1H se c’è un carbossile altrimenti è un estere. Nel caso in cui sia un estere dobbiamo controllare sul 13C che ci sia un carbonio alifatico shiftato a 70 ppm o un segnale benzenico intorno a 160. SENSIBILITA’ La sensibilità è molto inferiore rispetto all’1H perché l’abbondanza del 13C è l’1% e perché gamma è ¼ rispetto all’H e questo è un problema perché il rapporto segnale/rumore dipende da gamma. Quindi bisogna cercare di aumentare la sensibilità.
- Costante di accoppiamento scalare = l’accoppiamento C-C praticamente non esiste perché l’abbondanza è pochissima mentre esiste quello C-H che però aumenta il problema della sensibilità perché se abbiamo un C
singoletto che integra 1 e questo va ad accoppiare con un H, si genera un doppietto che avrà integrerà sempre a 1 quindi le intensità dei segnali si dimezzano (si dimezza S/N). Nonostante questo, la costante di accoppiamento è importante perché ci permette di capire se è un C- (singoletto), un CH (doppietto), un CH2(tripletto) o un CH3 (quartetto). Esistono 2 metodi per aumentare la sensibilità :
1. Eliminiamo le costanti di accoppiamento e collassiamo tutti i multipletti a singoletti. In questo modo aumentiamo l’intensità dei segnali e quindi il rapporto S/N ed evitiamo anche sovrapposizioni tra i segnali. Per fare ciò si usa il disaccoppiamento a banda larga con cui disaccoppiamento l’H dal C. Il disaccoppiamento ha una conseguenza che si chiama effetto Overhauser NOE - > rilassamento che arricchisce la differenza di popolazione fra stato alfa e beta e aumenta il segnale S/N. Quindi il rapporto è falsificato e perciò lo spettro 13C disaccoppiato non è più quantitativo. 2. utilizzare delle sequenze che trasferiscano la magnetizzazione dall’atomo di idrogeno (abbondante) all’atomo di carbonio. Il metodo di disaccoppiamento a banda larga è il più usato - > Quando abbiamo la costante di accoppiamento H-C, abbiamo la componente di atomi di carbonio legati all’idrogeno in alfa e la componente degli atomi di carbonio legati all’idrogeno in beta. Mandiamo un impulso sintonizzato alla frequenza del C (100 MHz) e mandiamo la magnetizzazione sul piano; durante l’acquisizione, irradiamo anche l’H che risuona a 400 MHz (gamma C ¼ di gamma H) in modo che i nuclei di H vadano di continuo tra alfa e beta molto velocemente ovvero saturiamo la transizione alfa-beta in continuazione. In questo modo eliminiamo la costante di accoppiamento e otteniamo un singoletto di intensità raddoppiata. EFFETTO NOE = variazione frazionaria dell’intensità del segnale NMR di uno spin (^13 C) quando un altro spin (^1 H) viene saturato. Il termine saturare, significa far fare alfa-beta velocemente ad un nucleo. Per avere effetto noi sono necessarie due condizioni : 1. I nuclei devono essere legati o vicini 2. Dobbiamo disaccoppiare uno dei due nuclei (saturare H). La variazione frazionaria dell’intensità di segnale è data dalla formula : W (omega maiuscola) = probabilità che si verifichi una transizione e sono legate ai fenomeni di rilassamento. Quando mandiamo un impulso gli spin passano da alfa a beta dopodiché per rilassamento ritornano in alfa. Ci sono diverse possibilità di transizioni :
- Singolo quanto (W1) = uno spin fa beta - > alfa
- Zero quanto (W0) = due spin passano contemporaneamente uno da alfa a beta e l’altro da beta ad alfa
- Doppio quanto (W2) = due spin fanno beta-> alfa Ritorniamo alle due condizioni necessarie per avere effetto NOE:
- Quando due spin sono vicini, possono trovarsi in 4 situazioni (4 livelli energetici) : Se sono vicini nello spazio, sono accoppiati dipolarmente. L’accoppiamento dipolare è tipico dello stato solido mentre in soluzione solitamente è mediato a zero me ci sono delle situazioni in cui agisce ed una tipica è quella dell’effetto NOE. L’accoppiamento dipolare è un’interazione diretta
L’effetto NOE dipende quindi dalla coppia di nuclei; per il C (omo-nucleare) l’effetto massimo è 0.5 mentre per il C-H sarà 0.5 x 4 = 2 à l’intensità è raddoppiata. Per questo lo spettro 13C disaccoppiato non è quantitativo, perché l’effetto NOE, che modifica le intensità, dipende dalla mobilità dei nuclei (distanza) che non possiamo calcolare. Anche se non possiamo integrare, se nello spettro C13 ho dei segnali molto intensi e dei segnali meno intensi, i segnali meno intensi probabilmente saranno legati ad atomi di carbonio quaternari (es. carbonili). Se abbiamo un segnale molto piccolo 90% è un atomo di C quaternario. Vediamo 3 casi in cui W1, W0 o W2 sono dominanti :
- W1 = Prendiamo due spin vicini A(carbonio) e X(idrogeno). La differenza di popolazione tra stato alfa e stato beta per entrambi è di 4; 6 in alfa e 2 in beta. Irradiamo X ed eguagliamo le popolazioni di X mentre A rimane inalterato. A questo punto avviene rilassamento W1 per cui X fa beta -
alfa e quindi la differenza di popolazione sarà 2 (5 in alfa e 3 in beta) Non c’è effetto NOE, infatti, non si ha alterazione dei livelli energetici di A
- W0 = stessa situazione di partenza di prima con differenza di popolazione pari a 4. Quando irradiamo X, come prima avremo 4 spin in stato alfa e 4 spin in stato beta. Quando avviene il rilassamento W0 si verifica una transizione 𝛼𝛽à 𝛽𝛼, quindi quando X da beta va ad alfa ( 5 alfa e 3 beta), A va da alfa e beta (3 beta e 5 alfa). Il risultato è che sia A che X daranno un segnale pari a 2 che per A è la metà del segnale che si avrebbe secondo la distribuzione di Boltzmann - > effetto NOE negativo
- W2 = partiamo sempre dalla stessa situazione e irradiamo X quindi eguagliamo le popolazioni. A questo punto si attiva il meccanismo 𝛽𝛽à 𝛼𝛼 per cui sia in A che in X uno spin beta passa in stato alfa. Abbiamo per X 3 beta e 5 alfa mentre per A 7 in alfa e 1 in beta - > la differenza di popolazione per A diventa 6 quindi abbiamo aumentato l’intensità del segnale.
COMBINARE EFFETTO NOE E DISACCOPPIAMENTO
Abbiamo 3 diverse opzioni :
- BB-decoupling - > disaccoppiamo durante il rilassamento, generiamo effetto NOE, diamo il 90° al C. a questo punto le popolazioni saranno già alterate quindi otteniamo una magnetizzazione maggiore. Continuiamo a disaccoppiare anche durante l’acquisizione. Si ottiene un ottimo S/N grazie all’effetto NOE ma si perde l’informazione quantitativa. Si risolve anche il problema della J-coupling perché stiamo saturando.
- Inverse gated decoupling - > vogliamo avere informazioni quantitativa (no effetto NOE) eliminando comunque la J-coupling. In questo caso accendiamo il disaccoppiamento solo dopo aver mandato la magnetizzazione sul piano; in questo modo non c’è il tempo per creare effetto NOE però eliminiamo la J.
- Gated decoupling - > disaccoppiamo solo all’inizio quindi generiamo effetto NOE, poi diamo l’impulso a 90° sul C e acquisiamo normalmente. In questo modo manteniamo l’informazione sulla J (capiamo che tipo di carbonio è) ma perdiamo l’informazione quantitativa (effetto NOE, non possiamo integrare). Ci sono delle altre possibilità che non riguardano solo dove si mette il disaccoppiamento ma come si applica. C) se abbiamo sia H alifatiche che aldeidi che risuonano a basse e ad alte frequenze, per disaccoppiare tutto lo spettro usiamo il disaccoppiamento a banda larga. Il BB-decoupling deve essere tale da comprendere tutte le frequenze tra i due segnali. B) si può avere un disaccoppiamento off resonance ovvero non in tutta la regione, disaccoppiamo solo a destra mentre a sinistra i segnali sono ancora sdoppiati (oppure viceversa) A) possiamo disaccoppiare solo prima della magnetizzazione in modo da avere effetto NOE ma mantenere l’informazione della costante di accoppiamento. C’) possiamo fare un disaccoppiamento selettivo in cui disaccoppiamento una regione molto piccola dello spettro, ad esempio, solo quella dell’H metilico (solo CH3 collassa) B’) non disaccoppiato, segnali poco intensi e J coupling. Vediamo degli spettri 13C disaccoppiati (quelli che ci troveremo all’esame). 2,2-dimetilbutano = 6 atomi di C, abbiamo solo 4 segnali perché uno è del solvente e uno è il segnale del tetrametilsilano. Quindi c’è una simmetria nella molecola perché ci sono 3 C equivalenti che danno un unico segnale. Non possiamo integrare ma possiamo capire che il segnale più intenso sarà quello che vale 3C mentre il più piccolo è quello che minor effetto NOE ovvero il C quaternario. Bromocicloesano = abbiamo tutti i segnali in zona alifatica, abbiamo 6 atomi di C ma 4 segnali perché la molecola è simmetrica. I segnali più intensi saranno quelli che valgono 2 mentre quello più shiftato è quello legato al Br. Se al posto del Br ci fosse stato un OH lo shift sarebbe stato ancora maggiore (70-80 ppm)
otteniamo il nostro spettro (in ppm/chemical shift ma in realtà sono frequenze). TEMPO DI RICICLO Consideriamo la situazione in cui arriviamo dalla scansione precedente, in cui avevamo mandato la magnetizzazione sul piano per acquisire il segnale; per poter ridare l’impulso doppiamo aspettare che la magnetizzazione ritorni all’equilibrio ovvero dobbiamo aspettare il tempo che si rigeneri la magnetizzazione sull’asse z. Il ripristino della magnetizzazione ha un andamento esponenziale che dipende da T1 che è il tempo di rilassamento longitudinale della specie (H o C) e corrisponde all’inverso della velocità con cui gli spin si riorientano cioè con cui ritorna la magnetizzazione su z. Per misure quantitative = bisogna aspettare 5 volte il T1 affinché si ripristini il 100% della magnetizzazione Per ottimizzare il rapporto S/N = si aspetta 1.26 volte il T1 con cui ripristiniamo il 72 % della magnetizzazione e risparmiamo un sacco di tempo. Nel caso a lato risparmiamo 10 volte il tempo. IMPULSO RF L’impulso di radiofrequenze è un impulso elettromagnetico per cui il campo elettrico e il campo magnetico, perpendicolari tra loro, si propagano lungo una retta oscillando alla frequenza di Larmor. Quindi stiamo applicando un campo magnetico oscillante che possiamo descrivere con due vettori che ruotano in maniera opposta e alla frequenza di Larmor. Questo impulso genera un effetto sugli spin e un effetto sulla magnetizzazione macroscopica.
1. Effetto sugli spin = l’impulso RF crea coerenza di fase. Quando inseriamo il campione nel campo magnetico, gli spin, inizialmente orientati in modo casuale, si riorientano in direzione del campo (anti o parallelamente). Ogni spin parte da una posizione diversa e in questo modo si ottiene il cono di spin. Quando mandiamo l’impulso, gli spin si raggruppano tutti nello stesso punto e acquistano coerenza di fase. Prima dell’impulso, gli stati alfa e beta si elidono e rimangono solo spin in stato alfa che generano la magnetizzazione lungo Z. Quando mandiamo l’impulso, non abbiamo più il cono di spin ma tutti gli spin in alfa si raggruppano da una parte e idem quelli in stato beta. La risultante sarà una magnetizzazione non può lungo Z ma lungo X (sul piano). 2. Effetto sulla magnetizzazione = l’impulso RF è un campo magnetico oscillante B 1 perpendicolare al campo magnetico statico B 0. Quando mandiamo l’impulso, la magnetizzazione, che precede alla frequenza di Larmor orientata lungo l’asse di B 0 , risente anche del campo B 1 perpendicolare, orientato lungo y. Risente quindi di un campo effettivo che è la somma dei due e precede quindi attorno all’asse Beff. Immaginiamo di cambiare sistema di riferimento, passiamo dal sistema di riferimento statico (lab) a un sistema di riferimento rotante che ruota alla frequenza di B1; in questo sistema quindi B1 è statico perché ruotano alla stessa frequenza ωr.
Siccome anche B0 è rotante, e si trova in un sistema che ruota, il campo magnetico statico sarà dato da B0 - ωr / γ. Se la frequenza ωr è quella di Larmor ( ωr = γ * B 0 ) quell’espressione diventa B 0 - B 0 =0. Questo significa che se l’impulso è sintonizzato alla frequenza di Larmor e quindi soddisfa le condizioni di risonanza, cioè il ΔE tra stato alfa e beta; la magnetizzazione risente solo di B 1 e non risente più di B 0 e quindi se abbiamo un magnetizzazione lungo z che risente solo di B 1 , la magnetizzazione ruota attorno a B 1 cioè va sul piano. In conclusione, l’impulso di radiofrequenza ha l’effetto di spostare la magnetizzazione netta dall’asse z di un angolo τ.
- L’IMPORTANZA DELL’ASSE SU CUI SI APPLICA L’IMPULSO Vale la regola della mano destra (pollice verso l’impulso e dita spostamento della magnetizzazione). Possiamo mandare l’impulso con un diverso angolo τ. Se mandiamo un impulso (rosa) di 90° su x la magnetizzazione (rosso) andrà su - y. Se mandiamo un impulso di 180° su y la magnetizzazione andrà su - z
- DURATA DELL’IMPULSO Per determinare un impulso a 90° dobbiamo calcolare la durata dell’impulso ovvero dobbiamo scegliere un impulso di durata adatta che porti la magnetizzazione a 90° cioè sul piano. Per calcolare la durata facciamo uno spettro utilizzando durate differenti e valutiamo le variazione delle intensità del mio segnale in funzione della durata dell’impulso. Quando l’intensità è massima avrò il 90 ° perché la magnetizzazione va esattamente dove c’è il registratore quindi la registra tutta, poi quando va a 0 sono a 180° perché la magnetizzazione è lungo l’asse z e non sul piano, infine quando è totalmente negativa sarà in posizione opposta rispetto al ricevitore. Quindi per calcolare il 90° la cosa più facile è cercare il 180° e dividere per metà la velocità. Se l’impulso deve essere 20 microsec per avere uno spettro piatto (180°); con 10 microsecondi abbiamo il 90°. L’impulso di 90° eguaglia le popolazioni degli spin (0 magnetizzazione su Z, tutta sul piano) mentre uno di 180° inverte le popolazioni (beta + popolato di alfa)
- FINESTRA DI ECCITAZIONE Come fa un impulso ad eccitare un range di frequenze? l’impulso deve soddisfare le condizioni di risonanza per ogni segnale che però hanno tutti un ΔE diverso ovvero risuonano a delle frequenze diverse. L’impulso è una sinusoide che oscilla nel dominio del tempo. Se mandiamo l’impulso come onda continua, facendo la trasformata di Fourier ottengo una singola frequenza (frequenza = numero di picchi nell’unità di tempo) Però sappiamo che l’impulso non è un onda infinita ma ha una durata di microsecondi. Questo fa si che la trasformata di Fourier non mi darà un solo segnale di frequenza ma un picco allargato che abbraccia un range di frequenze. Il range di frequenze irradiate in maniera omogenea è inversamente proporzionale alla durata dell’impulso. Un impulso 90° di 10 microsecondi mi genera una finestra di eccitazione pari a 25000 Hz. Se sono a 500MHz e ho 10 ppm ogni ppm sono 500 Hz, quindi, vuol dire la finestra di 10 ppm sono 5000 Hz. Al centro abbiamo il massimo effetto di B1 ma più ci allontaniamo dal centro più l’effetto diminuisce (o si inverte) e diventa disomogeneo. Il 90° è dato da una durata x una potenza: se la potenza è alta, la durata deve essere corta e viceversa.
2) campo magnetico oscillante = Si parte sempre dall’equazione differenziale, si trasforma tutto nel sistema rotante alla frequenza di B 1 e si arriva all’equazione in figura sotto che è l’equazione dell’evoluzione della magnetizzazione sotto l’effetto di B 0 e B 1 ; se si hanno due campi magnetici, l’effetto risultante è un campo magnetico effettivo che tiene conto di entrambi i campi magnetici. In condizioni di risonanza, il B 1 è alla stessa frequenza di Larmor. Quindi ω 1 = ω 0 e quando ciò avviene l’evoluzione della magnetizzazione nel tempo dipenderà solo più da B 1 perché il termine B 0 viene eliminato. Se la magnetizzazione risente solo di B 1 vuol dire che incomincia a ruotare intorno all’asse B 1 e si sposterà in secondo la regola della mano destra. In realtà le due equazioni sono incomplete perché mancano i termini legati al rilassamento che introducono delle costanti, T1 e T2 detti tempo di rilassamento longitudinale e trasversale (vedremo dopo).
TEMPO MORTO
Dopo l’impulso, non accendiamo subito il rivelatore, perché a causa del tempo morto si acquisirebbe la coda dell’impulso e l’intensità sarebbe maggiore rispetto alla magnetizzazione. Questo accade perché la bobina che manda l’impulso è la stessa che riceve il segnale e siccome l’impulso è in radioonde, la bobina dopo averlo mandato per un certo tempo continua a vibrare e se ricevessimo il segnale vedremmo la coda dell’impulso ovvero questa vibrazione residua che coprirebbe i nostri segnali. Il tempo morto va da 3 a 10 μs. Siccome con l’impulso mandiamo la magnetizzazione sul piano ma poi aspettiamo il tempo morto, la magnetizzazione inizia a precedere e quindi non sarà più esattamente coerente con l’asse del ricevitore. Più aumenta il tempo morto più il segnale diventa fuori fase. Se si manda l’impulso sull’asse ricevitore, c’è il tempo morto, la magnetizzazione incomincia fare un quarto di quadrante, cosa riceverà il ricevitore? Si guardi la figura sotto: riceverà la componente azzurra, in fase (segnale in assorbimento positivo) + metà componente che è già sull’asse x e che quindi ha la forma come il segnale rosso in figura sotto; quindi, è un segnale fuori fase. In realtà questo non è un problema perché dopo aver acquisito lo spettro lo si processa e quindi si riportano i segnali in fase Il ricevitore si accende per secondi (soluzione) o ms (stato solido). EFFETTO DEL CHEMICAL SHIFT E DELLA J-COUPLING SULLA MAGNETIZZAZIONE Dopo l’impulso la magnetizzazione inizia a precedere sul piano secondo il suo chemical shift. Quando lo si guarda con il formalismo degli operatori prodotto, Iy (l’operatore prodotto legato alla magnetizzazione lungo y), la magnetizzazione precede con due componenti (x e y): una che viaggia con il seno l’altra con il coseno. Se abbiamo delle costanti di accoppiamento, la magnetizzazione si scompone nelle due componenti e darà origine ad un doppietto che sarà rappresentato da due vettori magnetizzazione: uno che va più veloce, uno che va più lento (rotating frame :uno va in senso orario e latro in senso antiorario). Ciò significa che dopo un tempo pari a 1/(2J), uno dei due vettori sarà sull’asse +y e altro che sarà sull’asse - y. Dopo un tempo 1/J si avrà i due vettori ricongiunti sull’asse - x. Quando si considera i due fenomeni insieme ( chemical shift e costante di accoppiamento scalare) non si è più nel rotating frame. Allora si avrà un’evoluzione per chemical shift che è ciò che fa fare l’angolo φ, ma in realtà i due vettori sono quelli in arancione non tratteggiati in figura sotto. EFFETTO DEL RILASSAMENTO SULLA MAGNETIZZAZIONE Quando l’impulso è finito, la magnetizzazione precede per chemical shift e costante di accoppiamento scalare ma non precede sul piano all’infinito, inizia a rilassare e rigenerare la magnetizzazione su z. Man mano che si genera su z, le componenti su x e y diminuiscono. La velocità con cui si recupera sull’asse x è il T1, quella con cui si perde sul piano x e y è il T2.
