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PLASMIDI
Negli anni '50 sono stati individuati frammenti di DNA estranei al cromosoma batterico e che possono essere trasmessi da un batterio ad un altro indipendentemente da esso: tali strutture sono dette plasmidi. Essi sono strutture genetiche molto particolari in quanto, a differenza dei cromosomi, non sono legati ad una determinata specie batterica: possiamo trovare batteri della stessa specie che hanno plasmidi diversi o che ne possono mancare, batteri di specie diversa che ospitano plasmidi dello stesso tipo. Essi inoltre si replicano in modo indipendente.
Queste osservazioni suggeriscono che i plasmidi facciano parte di quella categoria di "esseri" al limite tra vita e non vita, di cui i virus sono l'espressione più organizzata; essi sarebbero dei simbionti obbligati della cellula batterica, ridotti ormai al solo DNA.
Appunti tratti da INTERNET
I plasmidi sono elementi genetici extracromosomici identificati in varie specie batteriche. In genere sono molecole di DNA circolare a doppio filamento di grandezza variabile, da 1 Kb
- 200 Kb ed oltre. I plasmidi contengono geni codificanti per enzimi che, in determinate condizioni o circostanze, sono vantaggiosi per l'ospite batterico. I fenotipi conferibili mediante differenti plasmidi all'ospite batterico sono molti; ad esempio:
- • Resistenza o produzione di antibiotici.
- • Degradazione di composti organici complessi,
- • Produzione di colicine, enterotossine, enzimi di restrizione o di modificazione.
In condizioni naturali, molti plasmidi sono trasmessi a nuovi ospiti mediante un processo simile alla coniugazione batterica. In laboratorio, tuttavia, i plasmidi possono essere trasferiti ai batteri mediante un processo artificiale, noto come trasformazione. I plasmidi vengono introdotti in batteri trattati precedentemente (ad esempio con CaCl 2 ) così da renderli temporaneamente permeabili a piccole molecole di DNA. I batteri trasformati sono poi facilmente distinguibili da quelli che non hanno assorbito e replicato il plasmide, sulla base del nuovo fenotipo conferito dallo stesso (come ad esempio la resistenza ad un antibiotico).
La replicazione del DNA plasmidico all'interno dell'ospite batterico è portata avanti in buona parte dallo stesso gruppo di enzimi usati per duplicare il cromosoma batterico. Alcuni plasmidi sono sotto un cosiddetto " controllo stringente ", ciò significa che la loro replicazione è accoppiata a quella dell'ospite e che solo una o poche copie del plasmide saranno prodotte in ogni cellula batterica. Esistono plasmidi, per contro, sotto un cosiddetto " controllo attenuato ", che consente al plasmide di raggiungere dalle 10 alle 200 copie per ciascuna cellula batterica. Tale numero di copie può essere ulteriormente incrementato fino a varie migliaia per batterio arrestando la proliferazione batterica mediante un blocco della sintesi proteica del batterio.
Queste proprietà dei plasmidi hanno suggerito ai genetisti di sfruttarli come vettori per trasportare all’interno del batterio qualsiasi frammento esogeno di DNA e farlo replicare in grande quantità. Il batterio più usato a tal scopo è un ceppo di Escherichia coli opportunamente modificato.
I requisiti che un plasmide deve possedere per essere un utile vettore di clonaggio sono: a) essere relativamente piccolo (è più facile purificarlo come molecola integra circolare); b) replicare sotto un “controllo attenuato”; c) portare uno o più marcatori genetici selezionabili per l'identificazione dei batteri trasformati; d) contenere siti unici di riconoscimento per uno o più enzimi di restrizione in regioni non essenziali per la replicazione del plasmide. Questi siti di restrizione lo rendono più duttile nell’utilizzarlo per l'inserimento di frammenti di DNA esogeno. Esistono numerosi vettori di clonaggio plasmidici, con i menzionati requisiti, tra cui ricordiamo il vettore pBR322 , un plasmide che possiede sia il gene per la resistenza all'antibiotico ampicillina sia quello per la resistenza all'antibiotico tetraciclina. Esso rappresenta il capostipite di una serie di vettori più piccoli e più efficaci da esso derivati.
In linea di principio il clonaggio in vettori plasmidici è molto semplice e riproducibile. Sia Il DNA plasmidico che il frammento di DNA esogeno vengono “tagliati” (rottura del legame fosfodiesterico che lascia estremità 5’-P e 3’-OH) con endonucleasi di restrizione (così da produrre nelle due molecole estremità compatibili) e legati covalentemente in vitro (mediante l’enzima ligasi ). I plasmidi ricombinanti sono poi usati per trasformare i batteri.
cromosoma; questo permette l’integrazione del plasmide F nel cromosoma batterico e la sua modificazione.
b-Di dimensioni maggiori rispetto alle sequenze di inserzione portano geni che conferiscono
importanti proprietà all’organismo. Tra questi ricordiamo geni per la resistenza agli antibiotici e per altri caratteri facilmente selezionabili. *alcuni batteri Gram-positivi posseggono trasposoni coniugativi, in grado anche di trasferirsi da un batterio ad un altro.
Sia le sequenze IS che gli elementi trasponibili hanno brevi sequenze ripetute invertite all’estremità del loro DNA. Queste sequenze sono coinvolte nel processo di trasposizione.
Quando un elemento trasponibile si inserisce in un altro punto del DNA (il DNA bersaglio) si verifica la duplicazione di una breve sequenza del DNA bersaglio a livello del sito di integrazione. Questa sequenza bersaglio non era presente nel trasposone, ma è l’elemento trasponibile a determinare la duplicazione di questo DNA attraverso il processo di inserzione. La duplicazione della sequenza bersaglio apparentemente si verifica in seguito all’attività dell’enzima trasposasi che induce rottura a livello di un solo filamento di DNA. Il trasposone si attacca, poi, alle estremità a singola elica generate e la riparazione delle porzioni a singolo filamento determina la duplicazione. Alcuni elementi trasponibili hanno delle sequenze bersaglio preferenziali, mentre altri, incluso il batteriofago Mu, possono inserirsi in maniera quasi del tutto casuale nel genoma
Gli elementi trasponibili esistono sia nei procarioti che negli eucarioti. Nei procarioti alcuni geni possono essere trasportati da una cellula all'altra tramite vettori come gli episomi ed i plasmidi (tramite trasformazione batterica o tramite coniugazione batterica , ed addirittura tramite i capsidi virali - trasduzione generalizzata e trasduzione specializzata). Importantissimo é il fatto che gli elementi traponibili sembrano "saltare" con una frequenza solitamente molto bassa e questi movimenti sono altamente regolati per il pericolo che essi possano inserirsi casualmente e danneggiare la sopravvivenza dell'organismo. Sugli elementi trasponibili si sa finora ben poco. Non si é ancora individuata la loro funzione pur avendone identificati alcuni prodotti proteici. Si crede che, effettivamente, tali elementi siano “ sequenze parassite” , annidate all'interno dei cromosomi. Essi potrebbero avere importanti funzioni nell'evoluzione di un organismo vivente, essendo in grado di
inserirsi e modificare alcuni assetti genetici definiti. Sotto questo punto di vista, gli elementi trasponibili sono dei veri e propri agenti “ mutageni” per le grandi modificazioni che possono apportare all'organismo vivente. Alcuni Autori indicano come i primi elementi trasponibili scoperti nei procarioti fossero sequenze di DNA composte da 1000-2000 paia di basi azotate (scoperti in punti diversi del cromosoma di Escherichia coli) ;
VETTORI
Sistemi utilizzati per inserire un certo costrutto genico in particolari tipi di cellule, superando le barriere di specie imposte dai normali processi riproduttivi.
I possibili vettori sono 4:
- Plasmidi;
- Virus fagi;
- Trasposoni;
- Agrobacterium tumefaciens.
PLASMIDI : Sono degli utili vettori in quanto si moltiplicano rapidamente e sono facilmente inglobati dai batteri attraverso la membrana cellulare. Sono però vettori affidabili solo per segmenti lunghi fino a 4000 coppie di basi azotate, infatti tollerano solo brevi sequenze di DNA estraneo, mentre i segmenti lunghi tendono ad essere eliminati col passare delle generazioni.
VIRUS FAGI : Anche i virus possono fungere da vettori che spostano pezzi di DNA da una cellula ad un’altra. Infatti il DNA dei fagi temperati può integrarsi nei siti specifici del cromosoma ospite e duplicarsi con il cromosoma stesso. I più utilizzati sono i fagi LAMBDA. I virus utilizzati sono modificati in modo tale da non essere più patogeni, ma da poter ancora trasmettere informazione genetica.
TRASPOSONI : Tutte le cellule eucariote hanno segmenti di DNA mobili, chiamati TRASPOSONI, in grado di passare da un sito ad un altro all'interno di un cromosoma. Per esempio il tipo di trasposone più semplice comprende un gene per un enzima che
