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Geni : sequenza di DNA che può essere trascritta in una molecola di RNA funzionale.
Dogma della biologia: passaggi DNA RNA PROTEINE. Si credeva che la complessità dell’organismo fosse definita esclusivamente dal numero di proteine codificate nel suo genoma. In seguito ciò venne smentito grazie al sequenziamento del genoma. Gli scienziati scoprirono che il numero di geni codificanti proteine non era in scala con la complessità dell’organismo umano. La proporzione di DNA non codificante cresceva con la complessità dell’organismo.
Infatti più del 70% del DNA viene trascritto in RNA, ma solo una piccola percentuale viene tradotta in proteine.
Tipi di RNA trascritto :
- 1.5% di mRNA (RNA messaggero) si trasforma in proteine.
- 80% di ncRNA (non-codingRNAs) questi possono contenere dai 20 ai 5000 nucleotidi e i più grandi sono gli rRNA (5000), tRNA, snRNA, snoRNA (100), microRNA (20).
- 18.5% di elementi ripetitivi (LINE, SINE, LTR).
TRASCRIZIONE DELL’RNA
Principio di complementarietà a mezzo del DNA (3’-5’) come stampo
Procarioti
L’ RNA-POLIMERASI apre la doppia elica e poi polimerizza in direzione 5’-3’. L’RNA-polimerasi ha 5 subunità e ha affinità per la molecola di DNA. Affinchè inizi la polimerizzazione, essa deve riconoscere un sito specifico d’inizio detto PROMOTORE. All’RNA-polimerasi si associa un FATTORE SIGMA , che aumenta l’affinità per i promotori. Esso indirizza l’RNA-polimerasi su geni specifici, riconoscendo sequenze specifiche di determinate basi. Esso è sensibile a cambiamenti di temperatura e viene rilasciato appena inizia la trascrizione.
I PROMOTORI batterici si trovano nella regione del filamento di DNA a monte rispetto al sito d’inizio della sintesi di RNA. L’analisi di più promotori indica la presenza di due brevi tratti simili da un gene all’altro, definiti come SEQUENZE CONSENSO : a -35 nucleotidi dal 1° nucleotide trascritto. -10 nucleotidi dal 1° nucleotide trascritto (ricca di A adenina e timina, TATA) Alla posizione del 1° nucleotide trascritto si associa il numero +1.
Le due catene di DNA complementari coinvolte nella trascrizione hanno ruoli diversi. La sintesi della molecola di RNA avviene solo su un filamento di DNA.
Si ha:
- Una catena non stampo [5’-3’] con la stessa sequenza del trascritto di RNA (a parte la timina che viene sostituita con l’uracile)
- Una catena stampo [ 3’-5’]
Fase di allungamento. Terminazione. La trascrizione termina grazie ad una proteina, chiamata RHO. In altri casi, l’RNA maturo viene rilasciato quando l’RNA polimerasi incontra una SEQUENZA DI TERMINAZIONE, ossia un insieme di sequenze “a simmetria bipartita” [nell’immagine, giallo- verde-giallo]. A seguire, le due regioni complementari formano uno STEM [giallo-giallo], con un LOOP [verde]. Questa struttura costituisce un ingombro sterico, che determina lo staccarsi della RNA polimerasi e la fine della trascrizione.
Della scissione del trascritto primario si occupa lo snoRNA (“small nucleolar RNA”), che viene precedentemente trascritto dalla POLIMERASI III. Lo snoRNA si associa a proteine formando dellle ribonucleoproteine nucleolari, denominate snoRNP. Questo complesso rimuove le SEQUENZE SPAZIATRICI , causando la scissione e l’assemblaggio delle subunità dei ribosomi, tramite:
- Metilazione del ribosio, aggiunta di un gruppo metilico al gruppo –OH in posizione 2’ del ribosio.
- Pseudouridinazione, una modificazione dell’uridina che viene convertita in pseudouridina.
Questi processi avvengono nel nucleolo.
RNA-POLIMERASI III
Essa trascrive tRNA , alcuni snoRNA e rRNA 5S.
Il tRNA viene maturato attraverso la rimozione di alcune sequenze:
- Sequenza in 5’
- Una sequenza centrale
- Sequenza in 3’, sostituita con la sequenza CCA.
RNA POLIMERASI II
Sempre coadiuvata a fattori di trascrizione, anche detti GTF ( es. TFIIE,TFIIH), per il riconoscimento del promotore.
Tra i promotori ricordiamo: BRE INR DPE TATA Il promotore TATA viene riconosciuto dal fattore TFIIR , che richiama altri fattori (ad esempio, il TFIIH, con funzione elicasica e chinasica), e la RNA polimerasi II, andando a costituire il COMPLESSO DI INZIO.
I fattori di trascrizione sono definiti generici perché si assemblano a tutti i promotori usati dall’RNA.
Il ruolo dei fattori di trascrizione è:
- Aiutare a posizionare l’RNA-polimerasi direttamente sul promotore;
- Aiutare a separare i due filamenti di DNA per permettere l’inizio della trascrizione;
- Contenere subunità con FUNZIONE CHINASICA : capacità di aggiungere gruppi fosfato, utilizzando ATP, sulla coda terminale dell’ RNA polimerasi (fosforilazione estremità C).
Negli eucarioti, tuttavia, prima che il DNA possa essere trascritto c’è il bisogno di rompere i legami che questo crea con gli istoni.
REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA
- A regolare l’espressione genica, oltre agli istoni, vi sono anche altre proteine che costituiscono il COMPLESSO DI RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA. Queste sono delle ATPasi , che, attraverso l’impiego di ATP, permettono lo scorrimento del DNA sugli istoni, rendendolo disponibile alla trascrizione.
2) La regolazione dell’espressione genica è garantita anche dalla METILAZIONE DELLE CITOSINE del DNA. La metilazione (aggiunta gruppo metilico) ùi sul promotore blocca la trascrizione.
- Le cellule riescono a regolare il legame tra DNA e istoni attraverso processi di ACETILAZIONE e DEACETILAZIONE.
-ACETILAZIONE ( istone acetil trasferasi - coattivatore ): Aggiunta di un gruppo acetilico sulla carica positiva della lisina degli istoni. Ciò permette il distacco degli istoni e l’avvio dei processi che portano alla trascrizione.
- DEACETILAZIONE (istone deacetilasi - corepressore ): Rimozione di un gruppo acetile, per rendere di nuovo inaccessibile la trascrizione.
Questi due tipi di istoni (acetiltrasferasi e deacetilasi ndr. ) vengono reclutati a livello del gene attraverso delle proteine attivatrici.
Si è precedentemente detto che i fattori di trascrizione sono generici. La specificità e, quindi, l’espressione genica sono garantite dal riconoscimento tra il COMPLESSO D’INZIO e ATTIVATORI SPECIFICI. Gli attivatori specifici possono interagire o con il promotore stesso o con gli enhancer. Gli ENHANCER sono siti d’attacco per le proteine attivatrici, spesso molto distanti dal promotore. Si viene quindi a costituire un COMPLESSO MEDIATORE , interposto tra:
- Fattori di Trascrizione
- Enhancer
- Complesso di rimodellamento della cromatina
!!RICORDA!! Enhancer interagisce con attivatore Attivatore interagisce con complesso d’inizio tramite il mediatore
AGGIUNTA CAP, POLYA, SPLICING:
I trascritti primari degli mRNA (premRNA) subiscono 3 modificazioni:
- Aggiunta del cappuccio trimetilico al 5’ ;
- Aggiunta coda polyA al 3’ ;
- Splicing
Le prime due modificazioni servono al passaggio nucleo-citoplasma e alla protezione della cellula da esonucleasi ed endonucleasi.
ESONUCLEASI : degrado di mRNA a partire dall’estremità. ENDONUCLEASI : degrado di mRNA a partire dal centro.
AGGIUNTA CAP al 5’
L’aggiunta di un “CAP” corrisponde all’aggiunta di 7-metilguanosina (guanosina metilata) in posizione 5’. Esso viene aggiunto mediante l’ utilizzo di GTP ed è un processo cotrascrizionale, perchè sulla coda fosforilata dell’RNA polimerasi sono già presenti enzimi deputati all’aggiunta del cappuccio. Ciò che si forma è un legame 5’-5’ che confonde l’esonucleasi. Il CAP serve ad allineare l’mRNA nei ribosomi al momento della traduzione.
AGGIUNTA CODA POLY_A al 3’
Quando l’RNA trascrive, ad un certo punto incontra, nella sequenza terminale, il PAS (sito di poliadeninazione), con sequenza AAUAAA. Questa sequenza viene riconosciuta da due fattori:
- CsTF che taglia l’RNA in questo punto
- CPSF che oltre a contribuire al taglio-specifico , permette la poliadeninazione da parte di POLY-A POLIMERASI (lungo 200-250 nucleotidi).
Tramite la poliadeninazione, l’RNA non viene intaccato dalle esonucleasi, in quanto queste andranno a degradare la coda di poly-A , mantenendo intatta la sequenza ORF della molecola.
SPLICING
I geni contengono gli introni che vengono rimossi e gli esoni che vengono conservati per la formazione di RNA maturo.
INTRONI : sequenze nucleotidiche non codificanti ESONI : sequenze nucleotidiche codificanti
Nell’ m-RNA, gli ESONI corrispondono a domini di una proteina. Si pensa che ancestralmente, questi fossero singoli geni che codificavano per due proteine distinte con funzione simile. Esempio : nella DNA-polimerasi, sono presenti diverse subunità (una ad attività esonucleasica e una polimerasica) e si pensa provengano da due geni distinti.
Più gli organismi conterranno introni, più essi saranno complessi.
SPLICING ALTERNATIVO Fenomeno in cui alcuni esoni vengono eliminati ed alcuni introni vengono mantenuti. Proprio per questo, ci possono essere diversi tipi di RNA maturi derivanti da un unico gene e quindi diverse proteine. Esempi : gene della alpha-tropomiosina; mutazione della beta-globina (beta-talassemia).
AUTOSPLICING Meccanismo di splicing in assenza dello spliceosoma (proteine). L’RNA ha un’azione di ribozima in alcuni geni per gli eucarioti, alcuni per l’r-RNA e alcuni per mitocondri. L’attività di ribozima consiste nel taglio, da perte dell’ RNA, del proprio substrato e attuazione di particolari modifiche.
U1 riconosce la sequenza consenso sul sito all’estremità 5’ U2 riconosce il branch point (adenina) Il complesso pre-splicing (U1 e U2) e richiama U4, U5 e U U4 mantiene U6 nel citoplasma fino a che U1 non si è legato al sito 5’ U6 interagisce con U avvicinando il branch point al sito 5’ U5 unisce i due esoni
