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TRASCRIZIONE EUCARIOTICA
Nei procarioti abbiamo solo 1 RNApolimerasi, mentre negli eucarioti ne abbiamo 3. Aspetti in comune: trascrizione va sempre da seq promotore a seq di terminazione, RNA viene copiato sempre in direzione 5’3’. Ci sono alcune differenze però. Qui ci sono dei geni che vengono trascritti, c’è un processa mento degliRNA sintetizzati nel nucleo che poi attraverso i pori nucleari vanno nel citoplasma (non tutti, ma la maggior parte) andando a svolgere le loro funzioni. Altra differenza importante tra le 2 trascrizioni: tutte e tre le RNA poli eucariotiche NON sono in grado di riconoscere da sole il promotore quindi hanno bisogno di FATTORI AUSILIARI (proteine che li aiutano a riconoscere il promotore).
Confronto 3 RNA POLI 1-2-3 EUCARIOTICHE e RNA POLI PROCARIOTICA: nella procariotica c’è beta primo, beta, le due alpha e omega. La Beta prima è la sub catalitica, alpha ha la porzione carbossiterminale che ha per contattare il promotore. Queste 5 sub procariotiche hanno un grado di omologia con 5 delle sub unità delle 3 poli eucariotiche che sono più grandi. Ogni polimerasi eucaristica ha almeno 12 subunità! Tra di loro, le 3 poli eucariotiche, hanno sub unità in comune, 4. Quindi: 5 sub in comune con la procariotica e tra di loro, 4 in comune tra di loro che sono assenti nella procariotica, e ci sono sub specifiche x ogni poli. La poli 3 sembrerebbe essere la più grande con un maggior num di sub unità. Nella RNA poli 2 nella subunità 1 c’è la CTD (carbossiterminale) che non è presente nelle due subunità che hanno omologia con le due sub alfa, a livello di questa coda si legano proteine importanti x la maturazione dell’mRNA. Le RNA poli euc lavorano nel NUCLEO, la 1 è localizzata nel NUCLEOLO (=struttura dove si condensano i cromosomi acro centrici 13 14 15 21 22 dove sono presenti i geni per rRNA, i geni di classe 1 ). La poli 1 ci fornisce rRNA, la 2 nucleare RNA e la 3 ci dà tRNA, ma anche rRNA 5S. Sono posizionate a livello di tutti i promotori da un fattore che contiene la proteina TATA BINDING ‘bainding’ PROTEIN ovvero la TBP.
le RNA poli vanno a riconoscere il promotore. I fattori che permettono di riconoscere il promotore bipartito (infatti ha una regione chiamata UPE ‘upstream promotor element’ posizionata da -180 a -107 a monte del +1 e il NUCLEO DEL PROMOTORE tra una reg + e una – ovvero -45 e +20 ricco in GC tranne nella regione vicina al punto di inizio chiamata Inr ricca in AT). Intervengono 2 tipi di fattori per la RNApoli1 :
- UBF1 ‘upstream binding factor’ che lega due sequenze specifiche del promotore
- SL1. Contiene la TBP (necessaria anche x altre polimerasi) ed è il fattore di posizionamento che associato ad altre proteine specifiche per ciascun promotore assicura che l’RNA poli si localizzi nel punto di inizio della trascrizione.
Ricorda INIZIO TRASCRIZIONE CON RNAPOLI1: promotore bipartito, UBF1 e SL1 che lega UBF1.
UBF1 si trova sottoforma di dimero che riconosce entrambe le due parti del promotore (UPE E NUCLEO), ha quindi un sito di leg con DNA e avvicina appunto i due tratti del promotore. Questo cambiamento conformazionale del DNA richiama SL1 che ha la TBP che permette alla poli1 di posizionarsi in maniera corretta sul promotore INIZIANDO LA TRASCRIZIONE dal +1 del gene. Se non ci fossere questi due fattori, non si potrebbe iniziare bene la trascrizione dal +1. Importante iniziare dal +1 sennò perdiamo info molto impo; se perdiamo una base si può infatti compromettere la codifica del gene. Ovviamente RNApoli1 trascrive geni di classe 1! RNA poli copia l’unità trascrizionale, ci sarà un trascritto molto grande che contiene info per rRNA 18S , 5.8 S e 28S. Tra 18S, 5.8S e 28S ci sono gli ITS1 e 2 che sono spaziatori trascritti interni, sono sequenze che danno info per la specie infatti variano di specie in specie.
Per la poli3: Copia i geni per rRNA 5S e tRNA (riconoscendo i promotori interni) e per scRNA = small citoplasmatic RNA (riconoscendo i promotori a monte del sito di inizio). Come erano i promotori interni? Abbiamo box A e box C per 5S e tRNA, sono stati trovati con studi di delezioni vedendo che togliendo delle regioni a monte di questi geni la trascrizione avveniva comunque. Sono state trovate le box ovvero sequenze conservate indicate con cassette o box. Per i PROMOTORI INTERNI che portano info per tRNA: la poli 3 richiede fattori di assemblaggio rappresentati da TF3A e TF3C e il fattore d’inizio TF3B. (UB1 del 1 è TF3C creando le condizioni necessario x legare TF3B). TF3B è il fattore di posizionamento che contiene TBP, quindi è come SL1.
Cosa succede per i geni che hanno info per 5S: Abbiamo un fattore addizionale TF3A che si posiziona in corrispondenza di box A che serve per richiamare TF3C che a sua volta richiama TF3B riuscendo a posizionare perfettamente la poli3.
Per i piccoli RNA citoplasmatici che non hanno bisogno di tutti i fattori addizionali ma solamente di TF3B che permette il posizionamento corretto della polim.
Per l’RNApoli2: ha più elementi di controllo. Più complessi. Abbiamo promotori TATA e TATAless. Quelli con TATA avevano elemento BRE e DCE mentre i TATAless hanno DPE e DCE nella porzione + del promotore. Il gene di classe 2 ha segmento 5’UTR, la regione codificante, il 3’UTR che contiene la sequenza di terminazione. Differenza con poli 1 e 3: geni 2 sono più regolati con molte sequenze cis che consentono la regolazione dell’espressione genica, quindi oltre ad avere fattori basali che servono x iniziare la trascrizione posizionando correttamente la polimerasi, hanno elementi che servono per regolare finemente la trascrizione. I fattori che intervengono per la poli2 abbiamo : (in questo ordine)
TF2D TF2A TF2B TF2E TF2F TF2H
(SL1, TF3B E TF3D sono i fattori che nelle diverse poli contengono la TBP che ne permette il posizionamento) Si crea un PIC= complesso di preinizio della trascrizione. La TBP si posiziona a forma di sella sul DNA, è una delle poche proteine che interagisce con il SOLCO MINORE DEL DNA. (nel DNA c’è infatti un solco maggiore e uno minore). Il legame con il DNA, piega il DNA di circa 90° a livello della TATAbox che permette l’apertura della doppia elica (simil cosa nella replicazione con trombone); ciò è valido per tutti i fattori delle altre poli che hanno questo compito. La TF2D è abbastanza complessa, infatti oltre a contenere la TBP contiene anche le TAFs (=fattori associati alla TBP) che aiutano il posizionamento di D riconoscendo l’elemento Inr, legano i fattori di trascrizione e aiutano a de compattare la proteina. Quando deve iniziare la trascrizione, ci deve essere uno srotolamento della cromatina grazie ai TAFs. (invece l’acetilazione della cromatina è fatto dalle acetilasi, le TAFs sono un ulteriore aiuto). L’TF2D si posizione in corrispondenza di TATAbox, si srotola a quel livello. Poi interviene TF2A che prende contatti con D, aumenta e stabilizza il legame di TBP e di TF2B che deve ancora arrivare. TF2B partecipa alla selezione del sito di inizio stabilendo la direzione di sintesi della trascrizione, è stabilizzato da A nel legame con D. Interviene ora TF2F che è legata alla RNApolimerasi2. B induce una torsione del DNA. Intervengono E e H. H ha attività elicasica aiutata da E che recluta appunto H la quale fosforila una delle subunità della polimerasi promuovendo il distacco dal promotore e l’inizio della fase di allungamento. La fosforilazione avviene al livello della coda carbossiterminale della subunità 1.
Interviene il COMPLESSO DEL MEDIATORE formato da 20 unità, è un complesso proteico richiesto in vivo per permettere al DNA la trascrizione. Si lega al complesso di inizio e trasporta la RNApolimerasi.
nucleo ma rimane nel citoplasma. Un altro meccanismo importante della variazione dell’ambiente è dato dall’interazione tra segnale e recettore; la molecola segnale si unisce ad un recettore di membrana poiché la molecola segnale non può attraversare la membrana cellulare poiché è idrosolubile. Ci sono recettori a 7 PASSI che formano anse per 7 volte nella membrana dotate di un collegamento con esterno e con interno; quando la molecola segnale arriva, c’è un cambiamento conformazionale che lo porta ad interagire con una proteina G. Quando la G è attivata, attiva a sua volta l’adenilato ciclasi che gli sta vicino producendo un secondo messaggero cellulare: cAMP che attiva le proteine chinasi che in assenza di segnale sono inattive. Sono le PKA che entrando nel nucleo, attiva CREB che si va a posizionare al livello del promotore su un elemento in CIS chiamato CRE( sono delle box ), attivandolo e determinando così una risposta genica. Si chiama TRASDUZIONE DEL SEGNALE. Altra via di propagazione: una volta che il segnale è stato ricevuto mediante proteine adattatrici arrivando ad un complesso, in esso è situato un complesso chiamato NFKB. E’ un fattore che viene attivato quando ci sono condizioni di infiammazione, stress ossidativo. Quando l’organismo sta bene, è inattivo grazie al complesso ikb. Quando invece è attivato, NFKB si va a legare nel nucleo in una sequenza cis, determinando la risposta allo stress o all’ossidazione. A seconda dei segnali, a seconda della trasduzione, a seconda della risposta, si hanno geni attivati e geni che possono essere silenziati! C’è infatti un continuo on\off dei geni che NON sono housekeeping.
DNA lo vediamo sottoforma di cromatina! Quindi il 1Step è quello di ‘avvisare’ la cromatina ch eun det gene deve essere sintetizzato! Tutto ciò avviene prima che la molecola segnale si leghi e crei la cascata biologica. SI HA PER PRIMO IL RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA = movimento continuo della cromatina che si avvolge e svolge a seconda delle esigenze cellulari. Intervengono enzimi di modificazione degli istoni (acetilasi HAT insieme ad una proteina sensore ). C’è una continua interazione tra DNA e proteine, quindi il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di diverse classi di proteine che agiscono sul solco maggiore del DNA, perché lì hanno maggior possibilità di formare sia leg H che idrofobici con DNA. Ovviamente ci sono diverse eccezioni ( proteine che agiscono anche sui solchi minori ovvero la TBP che si lega a sella ).
REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE EUCARIOTICA: (epigenetica è un particolare tipo di regolazione genica). Le proteine che si legano al DNA x regolarne la trascrizione, chiamate anche fattori trascrizionali ; questi hanno:
Dominio di attivazione trascrizionale Dominio di legame al DNA
m
Il dominio di interazione diretta*^ ha il dominio di connessione, di attivazione,di legame con DNA (box in cis del DNA). La proteina agisce in TRANS SUL DNA! Senza il dominio di legame di DNA, ma comunque con il dominio di attivazione presente, la trascrizione può essere modulata. Le sequenze regolatrici su un gene possono essere vicine tra loro, quando sono lontane si chiamano ENANCER! Alle sequenze regolatrici in cis si uniscono le proteine regolatrici; la maggior parte delle sequenze però si trovano a monte del luogo in cui inizia la trascrizione, ma possono trovarsi anche a valle. Le proteine regolatrici che in qualche modo devono interagire con il complesso del mediatore dando il segnale alla cellula, come fanno?? Grazie al ripiegamento del DNA, si crea un assortimento di ripiegamenti e interazioni tra proteine e complesso del mediatore. Un gene eucaristico, come per i procarioti, può essere anche represso con dei repressori che vanno a competere con il sito d’inizio bloccando il riconoscimento dei siti importanti per l’inizio della trascrizione per la RNApoli2. Ci sono altre forme per silenziare un geme come la METILAZIONE (istoni possono essere metilati e quindi la cromatina è più addensata e non trascritta) ma ci sono tipi di metilazioni che avvengono proprio all’interno del DNA sulle ISOLE CpG ossia sequenze CG vicine al sito d’inizio, nella zona del promotore, che vengono metilate aggiungendo gruppi- CH3. Quando c’è la metilazione di queste isole, il gene si spegne ovvero è silenziato.
Dominio di interazione diretta *^ col complesso pre-inizio
Dominio di interazione indiretta col complesso‘mediatore’
Elica-giro-elica ed
omeodomini
Cerniera di
leucine Zinc fingers
Elica-ansa-elica
Ci sono delle proteine che legano il DNA Metilato, dopo intervengono le deacetilasi che porteranno ad una cromatina più avvolta anche per l’intervento dei CH3. Prima metilazione DNA; seconda metilazione CROMATINA.
SEQUENZA DI EVENTI NELL’ATTIVAZIONE TRASCRIZIONALE DI UN GENE:
- La proteina attivatrici si lega alla cromatina, interviene il complesso di rimodellamento della cromatina.
- Rimodellamento della cromatina, intervento enzimi di modificazione degli istoni
- Modificazione covalente degli istoni, intervengono altre proteine attivatrici che si legano alla regione regolatrice del gene
- Assemblaggio del complesso di pre-inizio al promotore, intervengono altre proteine attivatrici e si ha il riarrangiamento di proteine nel complesso di pre-inizio
- Inizio della trascrizione
RNA trasfer maturazione: serve per trasportare gli AA in sede di sintesi proteica, subisce molte modificazioni di conformazioni assumendo strutture 2 e 3. Per quello EUCARIOTICO i tagli sono:
- Taglio al 5;’ interviene una RNAsi P che è una endonucleasi costituita da una ribonucleoproteina quindi da una componente proteica e una a RNA, la sua attività catalitica\di taglio è affidata all’RNA che agisce come ribozima.
- Taglio al 3’;
- Ci può essere un introne che viene tagliato grazie ad endonucleasi di splicing
- Modificazione al 3’ del tRNA; viene aggiunta una sequenza CCA grazie ad una trasferasi per cui tutti i tRNA processati eucaristici finiscono con questa sequenza e soprattutto quindi finisce al 3’ con un’adenina. Il nucleotide terminale è essenziale xk è l’ che viene caricato l’AA. Importantissimo!!
Nei PROCARIOTI: la sequenza CCA non è una modificazione post-trascrizionale ma CCA è scritto nell’operone e non viene aggiunto dopo.
QUIND I SIA I PROCARIOTI CHE GLI EUCARIOTI FINISCONO CON CCA
Soprattutto i tRNA presentano un alto livello di basi modificate, ci sono le modificazioni viste per i ribosomiale (metilazione 2’0 e pseudouridinilazione).
mRNA maturazione: serve a produrre nelle cellule EUCARIOTICHE un mrna pronto per essere tradotto. Subisce processi che aumentano la stabilità : modificazioni al 5’, al 3’, sulla parte codificante con rimozione degli introni (splicing tradizionale/alternativo/ trans splicing). Può avvenire anche l’RNA editing: modificazioni che ne cambiano il significato.
Perché la coda si fosforila? La RNA polimerasi quando ha iniziato la trascrizione, ha incontrato il fattore H che ha attività elicasica e chinasica, ciò indica che la polimerasi può lasciare il promotore e continuare l’allungamento. Se non è fosforilata, non può interagire con i fattori di maturazione!!!!
Una copia di un gene di classe 2 dà vita ad un mrna eterogeneo poiché è la copia complementare al filamento stampo. Si forma il cappuccio al 5’, lo splicing elimina gli introni e viene aggiunta la coda di poli A. processo avviene nel nucleo. Quandpo si forma questa copia matura, si passa dal nucleo al citoplasma dove porterà le info per la sintesi della proteina infatti ci sarà una decodificazione del messaggio nucleotidico che verrà convertito in un linguaggio amminoacidico. L’mrna eucaristico è modificato ad entrambe le estremità!!
Per fare maturare l’RNA, ci dobbiamo ricordare della sub1 della RNApoi2 che contiene CDT, estremità carbossiterminale; una volta ch equesta cosa viene fosforilata, prende su di sé i fattori coinvolti in questo processo di maturazione: abbiamo il capping e lo splicing.
PROCESSO DI MATURAZIONE AL 5’: CAPPING!
Viene effettuato subito dopo che la sua sintesi, man mano che mRNA viene sintetizzato a livello di 20 nucleotidi formati aggiunge il cappuccio. Ciò consiste nell’introduzione di un altro nucleotide grazie a dei complessi che svolgono attività enzimatiche. Il CTD fosforilato da TF2H recluta il complesso proteico coinvolto nel capping e costituito da:
Capping enzimi: un enzima con attivtà trifosfatasica e con attività guaniltransferasica RNA metil transferasi
Il capping serve a rendere l’Mrna più resistente all’attacco delle nucleasi e a farlo riconoscere come un mRNA da tradurre. Il primo nucleotide che viene inserito per formare un RNA è un’adenina. Abbiamo fostato in posizione alpha, beta, gamma. Ad opera di una fosfatasi viene eliminato un fosfato in posizione gamma.
Il nucleotide che abbiamo inserito come cappuccio di chiama cap0 e il primo rimane cap1. il nucleotide 1 e 2 vanno incontro a metilazione, ma non cap0!
FUNZIONI DEL CAP:
- Protegge mrna dalla degradazione
- Aumenta l’efficienza di traduzione, non c’è infatti attività esonucleasica al 5’
- Facilita il tarsporto dell’mrna dal nucleo al citoplasma
- Contribuisce ad aumentare l’efficienza del processo di splicing
RNA privi di cap non sono in grado di traslocare nel citoplasma e provocano anche il blocco dello splicing (=no rimozione degli introni).
CODA DI POLIA:
consiste nell’aggiunta al 3’ di una coda di A di lunghezza variabile (50-250 nucleotidi) (A=adenina). Com’è fatto il 3’UTR del gene di classe 2? Lì è presente una sequenza segnale di terminazione indicata come AAUAAA. (MA NON ERA T ???) L’apparato di poliadenilazione può riconoscere diversi segnali alternativi e perciò può fornire trascritti maturi poliadenilati di lunghezza variabile. Possiamo avere anche più sequenze seganle: ad esempio ne abbiamo 2, la RNApoli2 tracsrive tutto il 3’UTR però non è detto che questo rimanga tutto nell’mrna maturo. significa che successivamente ci possono essere diversi tagli in diverse posizioni portando ad avere rispettivamente dei trascritti diversi. I prodotti finali saranno quindi di grandezze differenti. A valle della sequenza di terminazione si trova la
FOSFATASI: elimina un P, il primo nucleotide rimane con 2P.
GUANIL TRANSFERASI: aggiunge un nucleotide guanilinico al 5’ fosfato dell’RNA che si sta appunto allungando. C’è un legame 5’5’. Ciò non accade normalmente nella sintesi di un polimero di nucleotidi poiché in genere c’è il game 5’OH3’fosfato. Proprio questo legame 5’5’ lo rende più forte e non aggredibile dalle esonucleasi.
METIL TRANSFERASI. Metila in posizione 7 della guanina.
STRUTTURA INTRONE nel gene di classe2: regola del GTAG , ovvero che solitamente al 5’ gli introni iniziano con G e terminano al 3’ con AG, in maniera tale che ci siano delle box conservate utili x il riconoscimento da parte dello spliceosoma. Inoltre più spostato verso il 3’ c’è un sito di ramificazione costituito da una A che è il sito di ramificazione/sito di Brenc. In prossimità del 3’ c’è un tratto di polipirimidine , inoltre c’è una porzione che comprende anche 2 nucleotidi al 3’ dell’esone che prendono il nome di “ sito donatore di splicing ” costituito da sei basi dell’introne al 5’ e 2 basi dell’esone della porzione finale dell’esone precedente. C’è anche il “ sito accettore di splicing ” che comprende il tratto di polipirimidine più la G iniziale dell’esone successivo alla porzione 3’ dell’introne.
5’.......….AG |GU(A/G)AGU…………………………….……………A………………………………………{ Pytract } AG |G………..3’
(sito donatore.spli) sito di ramificazione (sito accettore spl)
---Esone5’--|-----------------------------------------------INTRONE----------------------------------------------|--Esone3’-
FASI DELLO SPLICING:
- Viene definito il COMPLESSO PRECOCE E che consiste nell’interazione di U1 (=ribonucleoproteina formata da proteina e small RNA). La porzione di RNA contenuta nell’U1 forma legami H di Watson e crick quindi canonici con l’introne con un’esatta corrispondenza. Nel sito di Brenc abbiamo la BBP proteina che si lega e ci sono anche proteine ausiliarie
- S forma COMPLESSO A ; U1 eimane dov’era, è stata scalzata BBP sostituendolo con U2, che interagisce con la regione di Brench del’introne; c’è un esatta corrispondenza anche qui ma rimane fuori una A che sporge rappresentando appunto il punto di ramficazione che consentirà di fare splicing. Attenzione: lo spliceosoma non è ancora attivo
- COMPLESSO B1 : sono andate via le 2 proteine ausiliarie infatti sono presenti tutte le snorp in questa fase; U1 e U rimangono legate ai loro siti iniziali. Ci sono anche U5,U6,U4. Si è formata una loop quindi U6, U5,U4 si sono legate alle 1 e 2 permettendo un avvicinamento dei due esoni che confinano con questo introne rendendo possibile la formazione di una loop.
- COMPLESSO B2: U1 va via quindi U6 prende il suo posto anche se è meno stabilmente legato rispetto al primo. Va via anche U4, quindi ora ci sono solo snor. IL COMPLESSO DIVENTA ATTIVO!!! Abbiamo un’adenina ramificata nel sito di Brench e la guanina iniziale dell’introne , c’è una perfetta condizione di attivazione.
- COMPLESSO C1: c’è condizione di attivazione che permette che il 5’fosfato della guanina si vada a legare con il 2’OH che sporge dall’Adenina si forma la loop dove la guanina con il suo gruppo fosfato è legato all’adenina. Questa è una reazione di TRANSESTERIFICAZIONE perché da un legame estere se ne forma un altre estereo.
- COMPLESSOC2: Una volta formato questo legame, rimane libero il 3’OH che si trova al 3’ dell’esone precedente. Il 3’OH che abbiamo generato con la prima reazione di esterificazione può dare origine attaccando nucleofilamente facendo una seconda reaz di trans esterificazione attacca praticamente il 5’ fosfato del primo nucleotide dell’esone che sta al 3’ dell’introne. Quindi la seconda reazione consiste nell’attacco nucleofilo dell’OH libero all’estremità 3’ dell’esone a monte sul fosfato al 5’ dell’esone a valle. Otteniamo gli esoni che si sono legati, splicing ottenuto. La loop dell’introne che si è formata verrà successivamente degradata. I due esoni quindi sono legati tramite un P.
TRANS-SPLICING: Reazione di taglio a concatenazione di esoni provenienti da molecole diverse. Il meccanismo
è identico a quello dello splicing normale anche se quello avviene con reazioni intermolecolari. Qui il sito donatore e il sito accettore si trovano infatti su molecole diverse di RNA con il sito di ramificazione e l’elemento ricco di pirimidine nell’RNA contenente il sito di accettore. Questo meccanismo potrebbe essere usato per correggere alterazioni patologiche localizzate in una certa porzione del trascritto.
SPLICING ALTERNATIVO: utilizzo di una diversa combinazione di esoni e di introni. Uno stesso mRNA può
subire eventi di splicing differenti che portano alla creazione di diversi mRNA alternativi che a loro volta possono codificare proteine diverse. Infatti possono talvolta essere eliminati anche gli esoni fornendo diverse combinazioni che forniscono un ampio raggio di variabilià delle proteine. A ciò ovviamente possono lavorare terminatori e promotori differenti aumentando ancora la variabilità. Ci fa capire come gli introni non siano solo materia che non serve anche perché in alcuni casi rimane poiché ha un significato quindi può essere codificante! Perché possa avvenire questo splicing, ci sono diversi aspetti che lo permettono:
Esoni facoltativi (=esoni cassetta)che possono esserci e non esserci, esoni costitutivi che devono esserci sempre, esoni mutuamente esclusivi Ritenzione di introni (alcuni introni possono essere materiale codificante funzionando tipo esoni) Siti donatori di splicing al 5’ o al 3’ alternativi oltre a quelli ‘standard’.
Esiste lo Splicing alternativo della TROPOMIOSINA, TROPONINA ALPHA E BETA infatti il 90% degli mRNA è soggetto ad esso. Quando si ha lo splicing alternativo? Può essere un evento che può determinare la formazione di un tessuto quindi è tessuto specifico, o in determinate condizioni ambientali.
REGOLAZIONE DELLO SPLICING. La regolazione dello splicing comporta l’interazione tra proteine in trans in grado di legare specifici motivi presenti sia negli esoni che negli introni in cis. Ci sono infatti delle sequenze in cis sugli introni che si chiamano enhancer, gli S invece sono del silencer, idem per gli esoni. All’azione delle proteine SR che legano le sequenze enhancer negli esoni e negli introni e che attivano lo splicing , si oppongono delle proteine RNP che invece riconoscono le seq silencer negli esoni e negli introni silenziando lo splicing. Il meccanismo di repressione o attivazione comporta normalmente l’interazione con altre componenti dello spliceosoma. Ci sono anche proteine SR che stimolano lo spliceosoma.
Abbiamo un RNA che si chiama RNA SL e un mRNA che è un premRNA xk non è ancora maturo. Il GU e AG vengono utlizzati su due molecole diverse, il risultato sarà sempre come quello dello splicing tradizionale solo che non si formerà alcuna loop, ma un qualcos’altro che sarà egualmente degradato.
L’editing A-I nell’mRNA per il recettore del glutammato comporta la sostituzione di una GLUTAMMINA con un ARGININA che altera le proprietà del recettore e la permeabilità della membrana! L’mRNA per un recettore della serotonina subisce il processo di editing in 5 siti distinti che comportano 3 sostituzioni aminoacidi che che alterano le proprietà della trasduzione del segnale che coinvolge le proteine G.
EDITING DEI GENI COX2 DI T.BRUCEI: Causato da eliminazione/introduzione di 1 o più basi, qui viene persa completamente l’info della proteinascivolamento del codice di lettura.
Fine processamento mRNA ora mRNA è pronto x passare dal nucleo al citoplasma (sede di sintesi proteica poiché contiene i ribosomi che possono essere anche nel RER e nei mitocondri) perché mRNA ora è maturo (dopo aver subito capping, splicing, PoliA, proteine aggiunte) viene rilasciato con un meccanismo regolato e corredato di mRNP. Le molecole che superano i 40 kilodalton NON possono attraversare la membrana per diffusione ma attraverso dei sistemi di esportazioni: le esportine (particolari proteine). Quando il nucleo subisce dei segnali di trasporto; il complesso nucleo proteico passa mRNA maturo attraverso i pori nucleari trasporto con dispendio energetico infatti utilizza del GTP e una proteina GTPasi Ran che permette l’idrolisi del GTP.
IL LINGUAGGIO NUCLEOTIDICO
Il linguaggio nucleotidico è un linguaggio a 4 lettere infatti abbiamo 4 basi azotate che compongono il DNA e 20 AA diversi in natura. L’ipotesi più plausibile è che il codice genetico parli con sequenze di 3, derivando da una combinazione di 4 nucleotidi elevati alla terza (4^3 =64 possibili combinazioni) quest’ipotesi ha quindi portato ad una tabella di 64 combinazioni di aa. Ogni combinazione è associata ad un aa: sono stati costruiti degli omopolimeti delle quattro componenti delle basi andando a vedere cosa determinavano grazie ad una sintesi proteica in vitro con una coltura di E.coli si fa lisato si fa centrifuga e si prende il sopranatante dove ècpntenuto l’apparato di sintesi proteica. Ora l’mRNA è quello che si degrada più facilmente quindi se non inseriamo un omopolimero, quindi una coda di U, possiamo vedere quale peptide viene sintetizzato. Da ciò è stato visto che una coda di U dà la fenilalanina. Quindi UUU Fenilalanina. Così è stato ovviamente poi fatto per le altre basi ma il problema è sorto quando si doveva determinare la sequenza di una tripletta. Ciò è stato possibile marcando gli aa: hanno visto che se si introduceva la singola tripletta che ci interessava vedere per cosa codificasse, era possibile vedere che cosa veniva caricato sul ribosoma. Facendo tutte le combo in questo modo, caricando ogni singola tripletta in un estratto di cellula batterica, si è decifrato il codice genetico. (leggere solo la storia).
IL CODICE PARLA PER SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI TRE BASI (= TRIPLETTA O CODONE). I CODONI SONO IN TUTTO 64 E GLI AA SONO 20!!!
Più codoni possono codificare per lo stesso aa così possiamo giustificare l’abbondanza di triplette in confronto ai pochi aa. (es. 4 codoni portano l’info per la leucina) IL CODICE GENETICO E’ DEGENERATO!!!!!
Il codone che porta l’info per le metionina è un codone non degenerato ed è AUG!--> LA METIONINA è CODIFCATA DA UN SOLO CODONE COME IL TRIPTOFANO. Tutti gli altri 18 AA sono invece codificati da più di un AA.
AUG: è il codone di inizio infatti TUTTE LE PROTEINE INIZIANO PER LA METIONINA la sequenza dell’mRNA nei procarioti e negli eucarioti inizia con AUG!
Le triplette che portano l’info x gli aa sono 61/64 poiché 3 SONO CODONI DI STOP non portano info per un aa UAA UAG UGA!
Nella tabella del codice genetico universale, alcuni aa tipo ASPARTATO e GLITAMMATO sono nello stesso riquadro poiché hanno una parte R- simile quindi se viene sostituito un aa con un altro (in quanto varia la terza posizione della tripletta) che ha le stesse caratteristiche chimica, la proteina che ne deriva potrebbe non causare danni eccessivi in quanto la parte chimica sarebbe comunque simile. Per questo amminoacidi simile occupano lo stesso riquadro. Codoni che portano la stessa info x un aa CODONI SINONIMI.
Perché c’è una degenerazione del codice? Per la protezione dell’organismo da eventi mutazionali che possono avvenire. Evita gli errori. Se infatti la modificazione riguarda la terza base, il sistema non lo avverte ( le mutazioni però possono colpire anche la prima o la seconda base quindi si avranno errori notevoli poiché si ottengono prodotti chimicamente differenti).
OSCILLAZIONE DELLA TERZA BASE : la terza base è appunto meno influente nel riconoscimento codone-anticodone (mediante leg H durante la sintesi proteica) per specificare l’aa, o al massimo è coinvolta come purina o pirimidina senza distinzione tra C e U o A e Gg. Le regole che governano il riconoscimento codone-anticodone sono riassunte nella teoria dell’oscillazione della terza base, seconda la quale l’appaiamento seguendo le regole usuali è rispettato per le prime 2 posizione del codone (G-C e A-U), ma non per la terza posizione. Quindi la terza base del codone e la prima dell’anticodone possono oscillare non sono costretti a formare legH precisi ma l’importante è che ci sia una corrispondenza purina-pirimidina.
