Trasferimento genico nei batteri: trasformazione, trasduzione e coniugazione | Appunti di Microbiologia

•Trasformazione

La trasformazione è un processo di trasferimento genico attraverso il quale una o più

molecole di DNA libero penetrano in una cellula ricevente e vengono incorporate nel

suo genoma mediante un evento di ricombinazione. Molti batteri, tra i quali diverse

specie di Bacteria gram-positivi e negativi, sono trasformabili naturalmente. Poiché

nelle cellule dei procarioti il DNA è presente come un'unica molecola, quando la cellula

viene lisata delicatamente, il suo DNA fuoriesce. Una singola cellula normalmente

incorpora uno o pochi frammenti di DNA, così solo una piccola porzione dei geni di una

cellula può essere trasferita a un’altra cellula in un singolo evento di trasformazione.

•Competenza della trasformazione

Una cellula che è capace di assumere DNA ed essere trasformata viene chiamata

competente, e questa capacità è determinata geneticamente. Nella maggior parte dei

batteri naturalmente trasformabili la competenza è regolata e vi sono alcune speciali

proteine che svolgono un ruolo importante nell’assunzione e nel processamento del

DNA. Le proteine specifiche per la competenza includono una proteina che lega il DNA

associata alla membrana, un autolisina della parete cellulare e varie nucleasi.

Alcuni batteri che possiamo definire naturalmente competenti sono:

-S. pneumoniae;

-Bacillus subtilis;

-Neisseria meningitidis;

-Neisseria gonorrhoeae;

-Haemophilus influenzae;

-Pasteurella multocida.

Una via per la competenza naturale di B. subtilis è regolata dal quorum sensing, un

sistema regolativo che risponde alla densità cellulare. Durante la crescita, le cellule

producono e secernono un piccolo peptide il cui accumulo in alte concentrazioni

induce le cellule stesse a diventare competenti. Ma non tutte le cellule diventano

competenti. In Bacillus circa il 20% delle cellule in coltura lo diventa e rimarrà in

questo stato per diverse ore. Al contrario, in Streptococcus il 100% può diventare

competente, ma per un periodo molto breve durante il ciclo di crescita.

Molti batteri, a differenza di quelli che abbiamo citato, sono scarsamente trasformabili

in condizioni naturali. Ad esempio, Escherichia Coli e molti altri batteri gram-negativi

rientrano in questa categoria. Tuttavia, se le cellule di E. coli sono trattate con alte

concentrazioni di Ca2+ e successivamente raffreddate per diversi minuti, diventano

sufficientemente competenti. Le cellule di E. coli trattate in questo modo sono in grado

di assumere DNA a doppio filamento e, di conseguenza, la trasformazione di E. coli

con DNA plasmidico può essere relativamente efficiente.

L’elettroporazione è una tecnica fisica utilizzata per inserire il DNA in un organismo

difficile da trasformare, specialmente per quelli che possiedono una spessa parete

cellulare. In questa tecnica le cellule vengono mescolate con il DNA e poi esposte a un

breve impulso elettrico ad alto voltaggio. Questo trattamento rende permeabile

l’envelope della cellula e permette l’ingresso del DNA. L’elettroporazione è un

processo rapido e funziona nella maggior parte dei tipi cellulari, inclusi E. coli e quasi

tutti i Bacteria.

•Trasduzione

Nella trasduzione un virus batterico (batteriofago) trasferisce il DNA da una cellula

all’altra. I virus possono trasferire i geni dell’ospite in due modi. Nel primo, chiamato

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Trasformazione La trasformazione è un processo di trasferimento genico attraverso il quale una o più molecole di DNA libero penetrano in una cellula ricevente e vengono incorporate nel suo genoma mediante un evento di ricombinazione. Molti batteri, tra i quali diverse specie di Bacteria gram-positivi e negativi, sono trasformabili naturalmente. Poiché nelle cellule dei procarioti il DNA è presente come un'unica molecola, quando la cellula viene lisata delicatamente, il suo DNA fuoriesce. Una singola cellula normalmente incorpora uno o pochi frammenti di DNA, così solo una piccola porzione dei geni di una cellula può essere trasferita a un’altra cellula in un singolo evento di trasformazione.
Competenza della trasformazione Una cellula che è capace di assumere DNA ed essere trasformata viene chiamata competente , e questa capacità è determinata geneticamente. Nella maggior parte dei batteri naturalmente trasformabili la competenza è regolata e vi sono alcune speciali proteine che svolgono un ruolo importante nell’assunzione e nel processamento del DNA. Le proteine specifiche per la competenza includono una proteina che lega il DNA associata alla membrana, un autolisina della parete cellulare e varie nucleasi. Alcuni batteri che possiamo definire naturalmente competenti sono:
S. pneumoniae;
Bacillus subtilis;
Neisseria meningitidis;
Neisseria gonorrhoeae;
Haemophilus influenzae;
Pasteurella multocida. Una via per la competenza naturale di B. subtilis è regolata dal quorum sensing , un sistema regolativo che risponde alla densità cellulare. Durante la crescita, le cellule producono e secernono un piccolo peptide il cui accumulo in alte concentrazioni induce le cellule stesse a diventare competenti. Ma non tutte le cellule diventano competenti. In Bacillus circa il 20% delle cellule in coltura lo diventa e rimarrà in questo stato per diverse ore. Al contrario, in Streptococcus il 100% può diventare competente, ma per un periodo molto breve durante il ciclo di crescita. Molti batteri, a differenza di quelli che abbiamo citato, sono scarsamente trasformabili in condizioni naturali. Ad esempio, Escherichia Coli e molti altri batteri gram-negativi rientrano in questa categoria. Tuttavia, se le cellule di E. coli sono trattate con alte concentrazioni di Ca2+^ e successivamente raffreddate per diversi minuti, diventano sufficientemente competenti. Le cellule di E. coli trattate in questo modo sono in grado di assumere DNA a doppio filamento e, di conseguenza, la trasformazione di E. coli con DNA plasmidico può essere relativamente efficiente. L’elettroporazione è una tecnica fisica utilizzata per inserire il DNA in un organismo difficile da trasformare, specialmente per quelli che possiedono una spessa parete cellulare. In questa tecnica le cellule vengono mescolate con il DNA e poi esposte a un breve impulso elettrico ad alto voltaggio. Questo trattamento rende permeabile l’envelope della cellula e permette l’ingresso del DNA. L’elettroporazione è un processo rapido e funziona nella maggior parte dei tipi cellulari, inclusi E. coli e quasi tutti i Bacteria.
Trasduzione Nella trasduzione un virus batterico (batteriofago) trasferisce il DNA da una cellula all’altra. I virus possono trasferire i geni dell’ospite in due modi. Nel primo, chiamato

trasduzione generalizzata , il DNA derivato da qualsiasi porzione del genoma dell’ospite è impacchettato all’interno del virione maturo al posto del genoma virale. Nel secondo, chiamato trasduzione specializzata , il DNA di una regione specifica del cromosoma dell’ospite è integrato direttamente nel genoma virale, andando generalmente a sostituire alcuni geni virali.

Trasduzione generalizzata Come abbiamo anticipato, nella trasduzione generalizzata, qualsiasi gene del cromosoma della cellula donatrice può essere trasferito alla cellula ricevente, formando un trasduttante. La trasduzione generalizzata è stata scoperta e studiata estensivamente per la prima volta in Salmonella enterica con il fago P22, come anche in Escherichia coli con il fago P1. Quando una cellula batterica è infettata con un fago, durante il ciclo litico gli enzimi responsabili dell’impacchettamento del DNA virale nel capside del batteriofago a volte impacchettano, per errore, il DNA dell’ospite, producendo una particella trasducente. Le particelle trasducenti sono in grado di infettare la cellula batterica, ma, poiché non contengono DNA virale, non possono dare luogo a un nuovo ciclo litico e pertanto sono dette difettive. Al momento della lisi cellulare le particelle trasducenti sono rilasciate insieme ai virioni normali che contengono il genoma virale. Di conseguenza, il lisato contiene una miscela di virioni normali e di particelle trasducenti. Quando il lisato è utilizzato per infettare una popolazione di cellule riceventi, la maggior parte delle cellule verranno infettate con il virus normale, mentre una piccola porzione della popolazione sarà infettata dalle particelle trasducenti, che inietteranno il DNA che hanno impacchettato nell’ospite batterico precedente. Il DNA trasdotto, non può replicare, ma può ricombinare con il DNA della nuova cellula ospite.
Lisogenia e trasduzione specializzata La trasduzione generalizzata permette il trasferimento di qualsiasi gene da un batterio all’altro, ma a basse frequenze. Al contrario, la trasduzione specializzata permette un trasferimento estremamente efficiente, ma selettivo, in quanto viene trasferita soltanto una piccola regione del cromosoma batterico. Nel primo caso scoperto furono trasdotti i geni del catabolismo del galattosio dal fato temperato lambda di E. coli. Quando lambda lisogenizza una cellula ospite, il genoma fagico viene integrato nel cromosoma di E. coli in un sito specifico. Questo sito è vicino a un gruppo di geni che codificano gli enzimi responsabili del metabolismo del galattosio. Dopo l’integrazione, la replicazione del DNA virale è controllata dal cromosoma dell’ospite batterico. In seguito a induzione, il DNA virale si excide dal cromosoma dell’ospite attraverso un processo inverso a quello di integrazione. Di norma il DNA di lambda si excide in maniera precisa, ma, a volte, il genoma fagico si excide in maniera errata. Alcuni dei geni adiacenti a una delle due estremità del profago vengono excisi insieme al DNA fagico, mentre alcuni dei geni fagici rimangono sul genoma batterico. Questa particella trasducente può successivamente trasferire i geni del catabolismo del galattosio a una cellula ricevente. Questo trasferimento può essere rilevato solo se un ceppo galattosio-negativo (Gal-) è

stato infettato dalla particella trasducente e vengono selezionati i trasduttanti Gal+.

Perché un virione lambda sia infettivo c’è un limite alla quantità di DNA fagico che può essere sostituito con il DNA dell’ospite. Deve infatti essere mantenuta la porzione di DNA fagico che codifica il capside proteico e le altre proteine fagiche necessarie alla lisi e alla lisogenia.

attraverso questa giunzione che il DNA viene trasferito dalla cellula donatrice alla cellula ricevente.

Meccanismo di trasferimento del DNA durante la coniugazione Per il trasferimento di DNA durante la coniugazione è necessaria la sintesi del DNA. Questo DNA viene sintetizzato non attraverso il normale meccanismo di replicazione bidirezionale, ma con un sistema di replicazione a cerchio rotante , un meccanismo utilizzato anche da alcuni virus. Il trasferimento del DNA è attivato dal contatto tra cellula e cellula, in seguito al quale un filamento del DNA plasmidico circolare viene tagliato e trasferito nella cellula ricevente. L’enzima che taglia il DNA iniziando l’intero processo, TraI, è codificato dall’operone tra del plasmide F. Questa proteina possiede anche un’attività elastica ed è quindi coinvolta dello srotolamento del filamento da trasferire. Non appena inizia il trasferimento di un filamento, la sintesi del DNA mediante il meccanismo a cerchio rotante sostituisce il filamento trasferito nella cellula donatrice, mentre la cellula ricevente sintetizza il filamento di DNA complementare a quello in ingresso. Di conseguenza alla fine del processo, sia il donatore sia il ricevente possiedono una copia del plasmide completa. Quindi, se una cellula donatrice contenente il plasmide F (denominata F+) incontra una cellula ricevente mancante del plasmide F (denominata F-), grazie al trasferimento del

plasmide F si otterranno due cellule F+.

Il trasferimento di DNA plasmidico è efficiente e rapido, richiede circa 5 minuti.

Formazione dei ceppi Hfr e mobilizzazione del cromosoma Anche i geni cromosomali possono essere trasferiti attraverso la coniugazione mediata da un plasmide. In alcune circostanze il plasmide F di E. coli può mobilizzare il cromosoma durante il contato tra le due cellule. Il plasmide F è un episoma , ovvero un plasmide in grado di integrarsi al cromosoma dell’ospite e, quando si integra, può mobilizzare i geni cromosomali. Le cellule che possiedono un plasmide F non integrato sono chiamate F+. quelle con un plasmide F integrato nel cromosoma sono chiamate cellule Hfr (High frequensy oh recombination, letteralmete “ alta frequenza di ricombinazione ”). Sia le cellule F+ che le cellule Hfr sono donatrici, ma a differenza della coniugazione tra F+ e F-, la coniugazione con un donatore Hfr e un ricevente F- porta al trasferimento di geni del cromosoma ospite, poiché il cromosoma e il plasmide sono uniti a formare un’unica molecola di DNA. L’integrazione di un plasmide coniugativo fornisce un meccanismo per la mobilizzazione del genoma della cellula. Ne complesso la presenza di un plasmide F determina tre diverse alterazioni: (1) la capacità di sintetizzare il pilo F; (2) la mobilizzazione del DNA per trasferirlo a un’altra cellula; (3) l’alterazione dei recettori di superficie così che la cellula non possa più comportarsi da ricevente e acquisire una seconda copia del plasmide F o di plasmidi a esso geneticamente correlati.
Integrazione di F e modilizzazione del cromosoma Il plasmide F e il cromosoma di E. coli contengono entrambe diverse copie di elementi mobili chiamati sequenze di inserzione (IS) che forniscono regioni di sequenze omologhe tra il DNA del cromosoma e quelle del plasmide F. L’integrazione del

plasmide F nel cromosoma ospite è, pertanto, il risultato di un evento di ricombinazione omologa tra una IS sul plasmide F e sul cromosoma. Il plasmide non si replica più indipendentemente, mentre l’operone tra funziona ancora normalmente e il ceppo sintetizza i pili. Quando queste cellule incontrano un ricevente, la coniugazione viene attivata come in ogni cellula F+, e il trasferimento del DNA inizia in corrispondenza dei siti OriT (origine del trasferimento). Tuttavia, poiché il plasmide è parte integrante del cromosoma, i geni cromosomali cominciano ad essere trasferiti dopo il trasferimento di parte del DNA plasmidico. Come nel caso della coniugazione con il solo plasmide F, anche il trasferimento del DNA cromosomale richiede che vi sia replicazione. Poiché è molto frequente che un filamento di DNA si rompa durante il trasferimento, solo parte del cromosoma viene trasferito. Di conseguenza, il ricevente non diviene Hfr (o F+), poiché solo una parte del plasmide F viene trasferita. Il ceppo Hfr invece rimane tale, perché conserva un’intera copia del plasmide F integrato. Poiché il cromosoma completo non si può replicare, affinché il DNA trasferito dal donatore possa essere mantenuto deve ricombinare con il cromosoma del ricevente. Solo in seguito alla ricombinazione la cellula ricevente può esprimere un nuovo fenotipo codificato dai geni del donatore. Sebbene i ceppi Hfr trasmettano i geni cromosomali ad alta frequenza, in genere non convertono le cellule F- in F+ o Hfr, perché il trasferimento dell’intero plasmide F è un evento raro. Il risultato di un incrocio Hfr x F consiste quindi nel ceppo Hfr originale e nella formazione di una cellula F- dotata di un nuovo genotipo. Come nella trasformazione e nella trasduzione, la ricombinazione genetica tra geni Hfr e i geni F- richiede che nella cellula ricevente abbia luogo la ricombinazione omologa. Poiché sul cromosoma omologo possono essere presenti diverse sequenze di inserzione, è possibile che si formino diversi tipi di ceppi Hfr. Un ceppo Hfr di un certo tipo trasferisce i suoi geni nello stesso ordine e iniziando dallo stesso sito; ceppi Hfr che differiscono nel sito di integrazione del plasmide F trasferiscono i geni in ordini diversi. In alcuni siti d’inserzione, il plasmide F è integrato con la sua origine di trasferimento in una direzione, mentre in altri siti l’origine punta nella direzione opposta. L’orientamento del plasmide F determina quali geni cromosomali entrano per primi nel ricevente e mostra come i geni acquisiti per trasferimento genico orizzontale e ricombinati nel cromosoma possono essere trasferiti in una nuova cellula ricevente.

Trasferimento di geni cromosomali al plasmide F Occasionalmente, i plasmidi F integrati possono excidersi dal cromosoma e incorporare geni cromosomali durante il processo di excisione. Ciò accade poiché sia il plasmide F sia il cromosoma contengono più copie di frequenze di inserzione dove può avvenire la ricombinazione. I plasmidi F che contengono geni cromosomali sono chiamati plasmidi F’. Durante la coniugazione, i plasmidi F’ trasferiscono nel ricevente i geni cromosomali excisi dal cromosoma donatore ad alta frequenza. Il trasferimento mediato dai plasmidi F’ ricorda la trasdzione specializzata nel senso che solo un gruppo ristretto di geni cromosomali è trasferito da un certo tipo di plasmide F’. Il trasferimento di un particolare F’ in un ricevente permette la formazione di diploidi per una regione limitata del cromosoma. Questi diploidi parziali (merodiploidi) sono importanti per i test di complementazione.
DNA mobile: elementi trasponibili Come abbiamo visto le molecole di DNA possono trasferirsi da una cellula all’altra. Con il termine “DNA mobile” ci si riferisce a segmenti discreti di DNA che si muovono come

conservativa, come nel caso del trasposone Tn5, il trasposone di excide da un sito e si inserisce in un secondo sito. Il numero di copie di un trasposone conservativo rimane quindi invariato.
replicativa, al contrario della precedente, viene prodotta e inserita in un secondo sito una nuova copia del trasposone. Di conseguenza, dopo un evento di trasposizione replicativa, una copia del trasposone rimane nel sito originale mentre la seconda copia si trova nel nuovo sito.

Mutagenesi con i trasposoni

L’inserzione di un trasposone all’interno di un gene provoca una mutazione del ceppo stesso. Sebbene questo processo avvenga anche in natura, l’uso deliberato di trasposoni costituisce un conveniente mezzo per creare mutanti batterici in laboratorio. Di solito si utilizzano batteri che portano geni di resistenza agli antibiotici che favoriscono la selezione. Il trasposone viene introdotto nella cellula bersaglio su un fago o su un plasmide incapace di replicarsi nell’ospite. La maggior parte delle colonie resistenti all’antibiotico saranno dovute all’inserzione del trasposone nel genoma batterico. Poiché quest’ultimo possiede una porzione relativamente piccola di DNA non codificante, la maggior parte delle inserzioni di trasposoni avverranno nei geni che codificano proteine.

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plasmide F si otterranno due cellule F+.

Mutagenesi con i trasposoni