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CELLULE EUCARIOTICHE E PROCARIOTICHE
Tutti gli organismi sono costituiti da una o più unità fondamentali dette cellule. Le cellule, in base alla loro organizzazione interna, possono essere distinte in due grandi categorie: le cellule procariote (per esempio, i batteri) e le cellule eucariote (ossia protisti, animali, piante e funghi). Fra le due vi sono diverse differenze:
- “eucarion” deriva dal greco, e significa "vero nucleo"; viceversa “procarion” significa "prima del nucleo". Le cellule eucariotiche possiedono un involucro nucleare che separa il DNA dal resto della cellula, al contrario le cellule procariotiche hanno il DNA libero nel citoplasma in una regione definita nucleoide. Questa differenza strutturale comporta anche piccole variazioni nei processi di trascrizione e traduzione descritti. Negli eucarioti, infatti, la trascrizione del DNA in mRNA avviene nel nucleo; poi le molecole di mRNA vengono traslocate nel citoplasma, dove ha luogo la sintesi delle proteine.
- La molecola di DNA contenuta nelle cellule procariotiche è solitamente di forma circolare e di dimensioni molto ridotte rispetto agli eucarioti. Le cellule eucariotiche presentano più molecole di DNA non circolare, organizzate in cromosomi. La quantità di DNA nelle cellule eucariotiche infatti è superiore di diversi ordini di grandezza. 3)Gli eucarioti sono caratterizzati dalla presenza di organuli cellulari (provvisti di una autonoma membrana di separazione) deputati allo svolgimento di specifiche funzioni. Tra essi ricordiamo: reticolo endoplasmatico e apparato di Golgi, dove vengono sintetizzate o confezionate molecole complesse poi inviate nelle sedi opportune; lisosomi e vacuoli, sistemi dove le molecole di grosse dimensioni vengono idrolizzate in monomeri facilmente utilizzabili; mitocondri, dove si svolge la respirazione cellulare; cloroplasti, compiono la fotosintesi (presenti solo nelle cellule vegetali). Queste strutture sono immerse nel citoplasma (composto da due parti: il citosol, che è la parte più fluida, e le particelle insolubili sospese in esso) e ulteriormente protette all’esterno da un involucro detto membrana plasmatica (composta da due strati di molecole di fosfolipidi). Questa proprietà, detta compartimentazione, permette di separare fisicamente complessi di reazioni specifiche, in modo che esse si svolgano indipendentemente le une dalle altre. I procarioti, invece, seppur dotati di membrana plasmatici, sono privi di alcuni organuli, quali mitocondri, reticolo endoplasmatico, cloroplasti e apparato di Golgi (a eccezione dei ribosomi, preposti alla sintesi delle proteine). Alcune cellule procariotiche nel corso della loro evoluzione hanno sviluppato strutture specializzate. Tali strutture comprendono: una parete cellulare situata esternamente rispetto alla membrana plasmatica, un ripiegamento della membrana plasmatica in una membrana interna per la compartimentazione di alcune reazioni chimiche, e uso di appendici (denominati flagelli, se più lunghi, e pili, se più corti) utili per il movimento della cellula nell’ambiente acquatico.
- La cellula eucariotica ha normalmente dimensioni maggiori nell'ordine di decine di micrometri (solitamente il loro asse maggiore è compreso fra i 10 e i 50 μm), mentre una cellula procariotica ha dimensioni che variano nell'ordine di pochi micrometri (diametro generalmente compreso fra 1 e 5 μm) 5)Le cellule eucariotiche si dividono per mitosi, un processo che coinvolge la condensazione del DNA duplicato in cromosomi e la loro separazione mediante un processo elaborato e strettamente regolato. I procarioti si dividono per scissione binaria: le cellule dopo aver duplicato il proprio DNA ed essersi allungate fino quasi al doppio della loro lunghezza media si dividono in due cellule figlie a seguito della formazione di un setto divisorio e una molecola di DNA rimane in ognuna delle due cellule.
VIRUS
I virus , dal latino virus “veleno”, sono organismi subcellulari, i più piccoli microrganismi conosciuti (dieci volte più piccoli dei batteri, quindi cento volte più piccoli di una cellula umana), e non sono cellule: essi infatti sull’esterno delle cellule ospiti si presentano come particelle singole, definite virioni (possono avere forma semplice o complessa e talvolta essere avvolti da membrana), costituite soltanto da un involucro proteico (capside) che racchiude materiale genetico (RNA o DNA) a filamento lineare o circolare, doppio o singolo. Il cromosoma virale codifica per le proteine di rivestimento (il virus è altamente specifico) e per gli enzimi che demoliscono la cellula ospite. All’esterno presentano glicoproteine di membrana, che facilitano l’ingresso nella cellula ospite; esso determina la specificità per un tipo di ospite. I virus sono definiti parassiti intracellulari obbligati, poiché non possedendo meccanismi energetici per sopravvivere e moltiplicarsi hanno sempre bisogno di una cellula vivente, diversa secondo il tipo di virus. Si può trattare di una cellula batterica, una vegetale, una animale (e quindi una umana). Alcuni presentano una membrana (rivestimento lipoproteico), derivata dalla membrana plasmatica della cellula ospite precedentemente infettata, e sono detti virus con rivestimento. I virus che infettano i batteri vengono chiamati batteriofagi, o fagi. Il riconoscimento dei potenziali ospiti avviene attraverso un legame che si stabilisce fra le proteine del capside e specifici recettori parete del batterio ospite. I virioni, i cui acidi nucleici devono superare la parete batterica per poter infettare la cellula ospite, sono spesso muniti, a livello della coda, di un complesso molecolare in grado di iniettare l’acido nucleico del fago attraverso la parete del batterio ospite. Una volta che il batteriofago si è legato al batterio e l’acido nucleico penetrato si integra con quello del cromosoma batterico, possono succedere due cose, a seconda del tipo di fago:
- il virus compie un ciclo litico, cioè si riproduce immediatamente, assumendo il controllo dell’attività metabolica della cellula ospite: viene digerito il DNA della cellula ospite per formare nuovo DNA fagico, e, dopo aver trascritto quest’ultimo e tradotto l’RNA virale, si producono nuove proteine virali. Una volta completato l’assemblaggio dei nuovi fagi, un enzima provoca la lisi della cellula ospite e di conseguenza la fuoriuscita della progenie del fago. -il virus compie un ciclo lisogeno, cioè posticipa la riproduzione inserendo il proprio acido nucleico nel genoma della cellula ospite. In questo caso il batterio infettato non va incontro a lisi e ospita, invece, l’acido nucleico virale nel proprio genoma. Il virus così integrato è un’entità non infettiva e viene denominato profago. I batteri che ospitano particelle virali non litiche sono detti batteri lisogeni e i virus vengono definiti temperati. Il profago può rimanere inattivo all’interno del genoma batterico per molti cicli di divisione cellulare. Però, a volte, un batterio lisogeno può essere indotto ad attivare il proprio profago. Tale attivazione dà origine a un ciclo litico, in cui il profago abbandona il cromosoma batterico e produce nuove particelle virali. La capacità di passare dal ciclo lisogeno a quello litico è di grande utilità per il fago, perché gli permette di sfruttare al massimo l’opportunità di produrre particelle virali figlie. Quando la cellula ospite è in fase di rapida crescita e riproduzione, il profago rimane nello stato lisogeno. Quando, invece, la cellula ospite si è logorata o è stata danneggiata da agenti mutageni, il profago interrompe lo stato di incubazione e attiva il ciclo litico. Molti virus si riproducono esclusivamente attraverso il ciclo litico (e vengono definiti virulenti), mentre altri vanno incontro a entrambi i tipi di ciclo riproduttivo.
virale trascrittasi inversa per produrre DNA complementare (cDNA). A questo punto l’RNA virale degenera, mentre la trascrittasi inversa sintetizza un secondo filamento di DNA. Infatti la caratteristica peculiare del ciclo vitale dei retrovirus è la sintesi di DNA guidata dall’RNA. Questo cDNA entra ora nel nucleo e viene integrato nel cromosoma della cellula ospite, dando origine ad un provirus. Esso risiede stabilmente nel genoma della cellula ospite (senza danneggiarla), attivandosi di tanto in tanto per produrre nuovi virioni. Quando ciò accade il DNA del provirus viene trascritto in RNA virale che viene trasportato nel citoplasma. Qui, a livello dei ribosomi, l’RNA virale viene tradotto in proteine. Le glicoproteine virali si inseriscono nella membrana plasmatica della cellula ospite, che poi diventerà il rivestimento virale. Altre proteine virali formeranno il capside, che racchiude le molecole di RNA virale. La liberazione dei virioni dalla cellula ospite avviene per un processo di gemmazione molto simile all’esocitosi. In linea di principio, quasi ogni tappa di questo complesso ciclo può essere oggetto di attacco da parte di farmaci. Questo fatto viene sfruttato dai ricercatori nel loro sforzo di debellare il virus. Molti virus animali a DNA compiono un ciclo litico simile a quello dei batteriofagi. Altri virus a DNA possono integrarsi nel DNA dell’ospite; in tal caso non distruggono immediatamente la cellula ospite, come accade nel ciclo lisogeno. Il DNA virale integrato in un cromosoma di una cellula eucariotica è chiamato provirus.
BATTERI
Diversamente dai virus, i batteri sono cellule capaci di svolgere tutte le funzioni vitali fondamentali. Si tratta di organismi unicellulari (contrariamente ad animali e piante) procarioti che si riproducono di regola per via asessuata (scissione, ovvero mitosi): ogni cellula dà origine non a gameti, ma a cloni, ovvero a una popolazione di individui geneticamente identici (la duplicazione ha un solo punto di origine). I batteri sono microrganismi più grandi rispetto ai virus (dimensioni medie di 1000 nanometri), ma comunque 10 volte più piccoli delle cellule umane, e non si possono vedere ad occhio nudo. Essi non hanno alcun nucleo cellulare, ed hanno unicamente un filamento genetico (cromosoma circolare). Ciononostante, i batteri dispongono di varie modalità di ricombinazione genica che sono
estremamente utili dal punto di vista evolutivo, in quanto introducono nelle popolazioni batteriche quella variabilità genetica che permette di sopravvivere a eventuali cambiamenti dell’ambiente. Negli eucarioti la ricombinazione è un processo strettamente associato alla riproduzione e si verifica tra cromosomi omologhi durante la meiosi. Nei procarioti, al contrario, i due processi sono separati e distinti, tanto che a volte la ricombinazione non richiede nemmeno la partecipazione di due cellule intere. Tutti i batteri contengono inoltre plasmidi, ovvero cromosomi circolari (o a doppio filamento) più piccoli (con due o pochi geni) in aggiunta al cromosoma principale. Di regola i plasmidi si duplicano autonomamente (hanno una propria origine di duplicazione), ma in contemporanea con il cromosoma principale; possono però trasferirsi da una cellula all’altra durante la coniugazione, portando nuovi geni nel batterio ricevente. Dal momento che i plasmidi hanno un’esistenza indipendente dal cromosoma principale, non c’è bisogno che si ricombinino con esso perché i loro geni possano aggiungersi al genoma della cellula ricevente. Esistono diversi tipi di plasmidi, classificabili in base al tipo di geni che contengono: -Degradativi: metabolizzano sostanze tossiche; -Col: codificano per le colicine , che uccidono altri batteri; -della virulenza: trasformano l’ospite in patogeno; -F: consentono lo scambio di materiale genetico (tramite coniugazione); -R: conferiscono resistenza ad alcuni antibiotici. I geni contenuti codificano per enzimi che degradano il farmaco o ne riducono gli effetti. I geni possono essere trasferiti al cromosoma batterico, a virus e a batteri di altre specie compresi patogeni umani. Pur riproducendosi per via asessuata, i procarioti dispongono di svariati modi per ricombinare i loro geni:
- Trasformazione
Si tratta di una ricombinazione che avviene quando un batterio acquisisce DNA libero dall’ambiente. Questo fenomeno si manifesta in natura in alcune specie di batteri, quando le cellule muoiono e il loro DNA fuoriesce. Quest’ultimo può penetrare in un’altra cellula viva, dove si verifica un evento di ricombinazione tra il frammento di DNA e il cromosoma ospite.
donatore, cambiando la costituzione genetica della cellula, anche se in questo modo soltanto metà circa dei geni trasferiti riesce a integrarsi. Non tutti i batteri hanno la capacità di costruire i pili sessuali e il tubo di coniugazione. Per poterlo fare infatti devono possedere specifici geni che normalmente non sono presenti nel cromosoma batterico. Tali geni si trovano su una piccola molecola di DNA chiamata plasmide F, presente nei batteri donatori. Altri meccanismi per il “trasporto genico” sono:
- Infezione virale Provoca integrazione di acidi nucleici virali ad opera di un virus;
- Plasmidi
- Trasposoni Scoperti per la prima volta da Barbara McClontock, sono frammenti di DNA in
grado di spostarsi all’interno del genoma andando a inserirsi in un punto diverso dello stesso o di un altro cromosoma (l’enzima che catalizza questa inserzione è la trasposasi). Ciò può avvenire sia in organismi procariotici, che eucariotici, nel qual caso sono detti retrotrasposoni o retroelementi (sono copiati in RNA e poi in DNA prima del loro reinserimento nel cromosoma). Questi ultimi possono servire come marcatori per ricostruire l’evoluzione, confrontando quelli in comune tra specie diverse. Questo meccanismo consente di spostare alcuni geni all’interno di una singola cellula. Il frammento considerato però non scompare dal suo punto di origine, in quanto si duplica. In molti casi il loro inserimento produce effetti fenotipici perché, se avviene all’interno di un gene, ne distrugge l’integrità. Sequenze di questo tipo si trovano in numerosi siti del cromosoma principale di E. coli. Si possono avere trasposoni semplici (corti, possono provocare mutazioni, non portano fuori altri geni se non quelli della trasposizione) o complessi (portano geni che codificano per altre proteine).
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
possono, per esempio, trasferire geni da Si definisce tecnologia del DNA ricombinante l’insieme delle tecniche di laboratorio che consentono di isolare e tagliare brevi sequenze modificano in modo specifico solo i geni dei caratteri su cui si vuole agire di DNA per analizzarle, conoscerne la sequenza o la posizione e trasferirle e inserirle nel genoma di altre cellule (anche tra individui un batterio a una pianta o introdurre in un batterio un gene proveniente da una cellula eucariotica.Questa tecnologia (scoperta da Arber, Nathans e Smith nel 1960) permette interventi mirati, che di specie diverse), in modo da modificarne uno o più geni. Si. Gli scopi di questa operazione possono essere diversi: determinare un miglioramento genetico nell’individuo ricevente (per esempio, una maggiore resistenza agli attacchi dei parassiti), oppure utilizzare l’organismo ricevente per clonare il gene introdotto e servirsi della cellula ospite come una «fabbrica» per la produzione di molecole utili. Il meccanismo del DNA ricombinante ha permesso l’avvento delle tecniche di ingegneria genetica.
Enzimi di restrizione ed elettroforesi
Alla fine degli anni Sessanta del Novecento si scoprì che alcuni batteri si difendono dall’attacco dei virus producendo particolari enzimi, denominati enzimi di restrizione, che tagliano le molecole di DNA estraneo riducendole in frammenti più piccoli non infettanti. Più precisamente questi enzimi rompono i legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3' di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5' del nucleotide successivo, in un processo chiamato digestione da restrizione. Gli enzimi di restrizione agiscono solo sul DNA estraneo e non tagliano mai il DNA della cellula batterica che li ha prodotti. Il batterio infatti protegge il proprio DNA con un meccanismo chiamato metilazione: alcuni enzimi aggiungono un gruppo metile (–CH 3 ) in tutti i punti del DNA batterico che potrebbero essere riconosciuti dagli enzimi di restrizione. Oggi gli enzimi di restrizione si utilizzano per studiare sia il genoma dei batteri sia quello delle cellule eucariotiche. Esistono numerosi enzimi di restrizione, ciascuno dei quali taglia il DNA a livello di una specifica sequenza di basi (normalmente 4-8 basi), definita sequenza di riconoscimento o sito di restrizione. Per esempio, l’enzima Eco RI taglia il DNA soltanto quando incontra la seguente sequenza di basi appaiate nella doppia elica del DNA: Gli enzimi di restrizione più usati inoltre riconoscono determinate sequenze palindromiche, ovvero sequenze della lunghezza di 4-8 basi in cui il filamento superiore e quello inferiore, letti in direzione 5'-3', sono uguali. Uno stesso campione di DNA può venire tagliato da più enzimi che riconoscono siti di restrizione diversi. In questo modo i biologi molecolari possono scegliere con precisione chirurgica dove tagliare un campione di DNA optando tra molti siti diversi. Poiché le sequenze di riconoscimento non si presentano a intervalli regolari, i tratti di DNA che si ottengono sono di lunghezza e sequenza variabile, chiamati frammenti di restrizione. Per tagliare dei frammenti di DNA occorre inserire il materiale genetico in esame in una soluzione fisiologica a cui si andrà ad aggiungere l'enzima di restrizione. Dopo che l’enzima ha avuto il tempo di reagire, si procede con la separazione dei singoli frammenti di restrizione. Il metodo più
Ibridazione e denaturazione del DNA
Per verificare se la sequenza genica che stiamo studiando è presente nel campione di DNA a nostra disposizione, bisogna metterlo a contatto con frammenti di DNA a singolo filamento del campione e osservare se tale legame avviene o meno. I frammenti di DNA con tali caratteristiche sono detti sonde e il processo spontaneo attraverso cui due filamenti singoli di DNA si appaiono formando una molecola a doppio filamento è chiamato ibridazione (può avvenire anche tra due molecole di RNA o tra una di DNA e una di RNA). Il tempo necessario perché questa operazione si concluda è direttamente correlato alla lunghezza delle sequenze di DNA coinvolte. Il processo di ibridazione però è possibile solo se il DNA è presente a filamento singolo e perciò per dividere il doppio filamento è necessario un meccanismo, detto denaturazione. Esso consiste nello scaldare il campione a 95° in modo che le alte temperature vincano le forze dei legami a idrogeno che tengono insieme gli appaiamenti di basi e i due filamenti si separano esponendo le basi non appaiate. A questo punto viene aggiunta la sonda e il campione viene raffreddato per far avvenire l’ibridazione. Avvenuta quest’ultima, il campione viene ripulito da tutte le sonde che non hanno reagito. Per essere individuate esse vengono modificate o marchiate chimicamente, per esempio con fosforo radioattivo, coloranti fluorescenti o composti che reagendo con enzimi specifici formano un prodotto finale colorato: rosso, gene (sul cromosoma X) della formapiù comne di distrofia muscolare infantile; verde (sul cromosoma 21), gene coinvolto nella sindrome di Down; arancione (sul cromosoma 11), gene che codifica per la beta-globina; bianco (sul cromosoma 8), oncogéne coinvolto nello sviluppo del cancro; viola, gene che codifica per una proteina sulla superficie dei globuli bianchi; giallo (sul crmosoma 5), sequenza non identificata. Per produrre una sonda quindi occorre isolare del DNA naturale, marcarlo e scaldarlo per denaturarlo, ma esiste anche un altro modo: rivolgersi a chi è in grado di sintetizzare (costruire ex novo) una particolare sequenza di nucleotidi (Khoran, premio nobel, fu il primo nel 1965 a riuscirci). L’ibridazione però non funziona bene su frammenti di DNA inclusi nel gel di agarosio e perciò, se lo scopo è separare frammenti di restrizione per poi andare alla ricerca del gene di interesse, è preferibile usare una procedura chiamata Southern Blotting. Esso consiste nel coprire con una carta assorbente e una membrana il gel di agarosio su cui sono corsi i frammenti di DNA. Così si potrà osservare tali frammenti attraversare per capillarità la carta assorbente e trasferirsi sulla membrana; solo a quel punto sono pronti per ibridarsi alle sonde. Questa tecnica è spesso utilizzata per le ricerche da effettuare nelle biblioteche di DNA.
PCR e Taq-polimerasi
Un’altra sfida che si sono proposti i biologi è come poter analizzare campioni biologici contenenti piccolissime quantità di DNA e poiché a ogni divisione cellulare le cellule duplicano il loro genoma, hanno capito che sarebbe stato possibile inserire un frammento di DNA all’interno del genoma per generare a ogni divisione una copia in più del frammento del DNA in questione. Ciò è possibile grazie alla purificazione della DNA polimerasi, insieme di enzimi cellulari che copiano il DNA a partire da un filamento stampo. Essa però, non essendo in grado di produrre filamenti polinucleotidici ex novo (allunga un filamento già esistente), ha bisogno per iniziare bisogno di un frammento di DNA a singolo filamento (che nella duplicazione derivava dallo “srotolamento” del doppio filamento). Alla soluzione in provetta si aggiunge quindi una breve molecola di DNA sintetico a singolo filamento, usata come molecola di innesco (primer). Per riuscire ad alimentare ripetuti processi di sintesi di DNA e ottenere in poco tempo milioni di copie di una stessa sequenza bersaglio, Mullis inventò la reazione a catena della polimerasi (PCR). Per attuare questo meccanismo è necessario denaturare lo stampo di DNA (temperatura di 95°) e far si che, una volta scese le temperature, due molecole di innesco si ibridino alle estremità dei due filamenti opposti di esso grazie alla DNA polimerasi. Questo ciclo viene ripetuto molte volte per arrivare alla sintesi finale di milioni se non addirittura miliardi di copie del segmento di DNA di partenza e per questo motivo prende anche il nome di amplificazione del DNA. Bisogna prestare attenzione ad utilizzare DNA polimerasi in grado di sopportare le alte temperature, poiché diversi enzimi a 95° vengono denaturati e non funzionano più. Enzimi come la Taq polimerasi invece (DNA polimerasi del batterio Thermus aquaticus) riescono a fronteggiare ripetuti cicli di riscaldamento e consentono l’automatizzazione del processo della PCR. La scoperta di questo enzima fruttò a Mullis il premio nobel nel 1983 e da allora la PCR ha avuto grande importanza nella ricerca genetica e trova tuttora straordinarie applicazioni: studi sull’evoluzione, ricerca forense, isolamento di geni, diagnosi di infezioni, diagnosi di malattie ereditarie e tumori, mutagenesi diretta, monitoraggio di terapie associate al cancro, studi sull’identità e sulle parentele. Un altro modo per sintetizzare DNA, è avendo origine da uno stampo di RNA. La trascrittasi inversa infatti permette agli scienziati di sintetizzare il DNA di un gene a partire da una molecola di mRNA.
CLONAGGIO
Uno degli scopi della tecnologia del DNA ricombinante è il clonaggio (o clonazione molecolare). Con questo termine si intende il trasferimento di un frammento di DNA all’interno di cellule (che dopo quest’operazione si chiameranno transgeniche) in modo da utilizzare il suo normale processo di replicazione per produrne copie multiple (siano esse geni, sequenze di nucleotidi o cellule intere). La cellula ospite può essere procariote od eucariote. I primi risultati di scambio di geni si ottennero per mezzo dei batteri (trasformazione, traduzione, coniugazione, plasmidi), ma ben presto si capì che essi non erano gli organismi ideali per lo studio e l’espressione dei geni eucariotici. Quando si vuole ottenere ciò infatti, è meglio scegliere un ospite eucariotico, come una drosofila, un topo, una pianta o un lievito (i più usati). È importante, in ogni caso, che una volta entrato esso si duplichi
resistenza agli antibiotici: solo le cellule che incorporano il DNA ricombinante sopravvivono, tutte le altre muoiono.
Biblioteca di DNA (biblioteca gnomica)
Per prima cosa occorre che l’intero genoma dell’organismo venga digerito con enzimi di restrizione e i frammenti inseriti all’interno di più vettori. L’insieme delle cellule che li accoglieranno costituiscono la biblioteca di DNA dell’organismo di partenza dal momento che, seppur divisa in frammenti, contiene l’intera sequenza del suo genoma (che si tratti di DNA codificante e non, di geni espressi e non). Essa può essere utilizzata come sorgente di informazioni anche se non è possibile sapere in partenza all’interno di quale vettore, e quindi di quale cellula, si trovi il gene di nostro interesse. Per avere tale informazione è necessario passare al vaglio l’intera biblioteca.
Biblioteca di cDNA
Una biblioteca di DNA di dimensioni molto più ridotte, contenente soltanto i geni trascritti da un particolare tessuto, può essere ottenuta dal DNA complementare o cDNA. La prima tappa della produzione di cDNA è l’estrazione di mRNA da un tessuto. Questo mRNA funziona da stampo per l’enzima trascrittasi inversa, che sintetizza DNA a partire da RNA. Si forma così un filamento di cDNA complementare all’mRNA di partenza. L’insieme dei cDNA ottenuti da un particolare tessuto in un determinato momento del ciclo biologico di un organismo viene definito biblioteca di cDNA. Gli mRNA non durano a lungo nel citoplasma e spesso sono presenti in quantità ridotte; perciò una biblioteca di cDNA è un modo per fissare nel tempo lo schema di trascrizione della cellula e darci un’immagine istantanea dell’insieme degli mRNA trascritti da un certo tipo di cellule in un dato momento (trascrittoma).Le biblioteche di DNA complementare si sono rivelate di enorme utilità per confrontare l’espressione genica nei diversi tessuti a vari stadi di sviluppo. Il DNA complementare è anche un ottimo punto di partenza per la clonazione dei geni eucariotici, soprattutto per i geni espressi a livelli bassi e solo in pochi tipi di cellule.
CLONAZIONE DI ORGANISMI COMPLESSI
Per clonazione si intende la produzione di una o più copie identiche non di una molecola (clonaggio), ma di un intero organismo vivente. Il termine si applica sia ai complessi organismi pluricellulari, sia a quelli unicellulari. La mitosi, per esempio, è un processo di divisione cellulare durante la quale il numero dei cromosomi rimane inalterato; essa produce pertanto un insieme di cellule uguali che chiamiamo appunto clone cellulare. Tale processo è cruciale per l’accrescimento e il mantenimento degli organismi pluricellulari: nel nostro corpo, infatti, le cellule si dividono per mitosi quando è necessario riparare dei tessuti danneggiati e sostituire le cellule ormai vecchie. Anche le fasi iniziali di sviluppo dell’embrione, dopo che la cellula uovo è stata fecondata da uno spermatozoo, dà origine a cloni. Da quell’unica cellula si generano due cellule figlie identiche e il processo si ripete almeno per le prime tre divisioni, cioè fino a quando le cellule mantengono la loro totipotenza. L’unico caso di identità genetica umana naturale fra individui distinti è quello dei gemelli omozigoti o identici, che originano dalla precoce separazione dell’unica massa di cellule totipotenti deriva dallo zigote. La clonazione esiste dunque in natura e sui vegetali è sempre stata praticata. Per quanto riguarda gli animali, invece, il primo clone “puro” è la pecora Dolly, ad opera nel 1996 dell’inglese Wilmut. Essa è infatti il primo organismo clonato partendo da una cellula differenziata della madre genetica. Partì estraendo il nucleo (e quindi il DNA) dalla cellula somatica
della mammella di una pecora adulta e lo mise al posto del nucleo di una cellula uovo non fecondata appartenente ad una pecora adulta di razza diversa (così da evitare confusioni). Questo embrione, infine, geneticamente identico alla prima pecora, fu trasferito nell’utero di una terza pecora, di razza ancora diversa, che portò a termine la gravidanza, dando alla luce Dolly. Questa tecnica viene chiamata trasferimento nucleare di cellula somatica in un uovo e l’eccezionalità consiste proprio nel fatto che riesca a far regredire una cellula adulta già specializzata, come una cellula mammaria, allo stadio di cellula embrionale totipotente (cosa che prima gli scienziati non ritenevano possibile). Per smentire ogni falsa diceria, è importante ricordare che la clonazione non genera la copia identica, e quindi già adulta dell’individuo di partenza, ma un neonato geneticamente identico allo “stampo” ma con esperienze, ricordi e condizionamenti propri, dovuti alla sua personale esperienza d’interazione con l’ambiente esterno. Ciò è osservabile anche dai gemelli omozigoti che, pur essendo geneticamente identici e sviluppandosi nello stesso ambiente uterino, manifestano con il tempo delle differenze. Inoltre studi recenti stanno dimostrando che il DNA stesso può modificarsi nel corso della vita, attraverso meccanismi detti epigenetici, il che accresce le differenze. Un’ultima prova è data dal fatto che una piccola porzione del DNA eucariotico si trovi nei mitocondri e quindi fuori dal nucleo. Tenendo conto di queste differenze ci si aspetta che un clone generato con questa metodica sia meno simile al genitore che dona il nucleo di quando lo siano fra loro i gemelli omozigoti.
