Preuzmite Dinamicke mutacije i više Rezime u PDF od Biologija životne sredine samo na Docsity!
Dinamičke mutacije
Do pre 20 godina govorilo se samo o tri tipa mutacija. To su tačkaste mutacije, frameshift mutacije i veliki rearanžmani gde spadaju delecije, insercije, duplikacije. 1991. godine otkrivene su dinamičke mutacije koje se nalaze ekskluzivno kod ljudi tj. još uvek nisu otkrivene kod drugih organizama. Dinamičke mutacije pre svega uzrokuju nasledne neurološke i najverovatnije psihijatriske bolesti kod dece i adolescenata. Dinamičke mutacije-mutacije nestabilnosti broja ponovljenih motiva u tandemski ponovljenim sekvencama DNK. Najčešći tip dinamičkih mutacija su ekspanzije broja trinukleotodnih ponovaka, ali mogu da budu i dva nukleotida, pet, dvanaest itd. Za dinamičke mutacije karakterističan je fenomen anticipacije. Anticipacija znači^ da^ se^ broj nestabilnih ponovaska (npr. tripleta) povećava iz generacije u generaciju što ima za posledicu težu kliničku sliku i raniju pojavu bolesti u sledećoj generaciji. Fenomen anticipacije je primećen početkom dvadesetog veka kod muskularne distrofije tipa I ( DM1), a kasnije je opisan i kod obolelih od FRAXA (oblik blaže mentalne retardacije) i nazvan Šermanov paradoks. Takođe je 1991. otkriveno da geni odgovorni za ovu mentalnu retardaciju i spinalnu i bulbarnu mišićnu^ atrofiju^ (SBMA)^ sadrže^ nestabilne^ umnožene trinukleotidne ponovke. Kod ljudi koji nisu oboleli od bilo koje od ovih naslednih neuroloških bolesti broj tripleta u određenim genima varira što znači da su ti lokusi polimorfni. Kada broj tripleta pređe određen prag dolazi prvo ili do premutacionog stanja ili do pune mutacije. Još jednom-biološka osnova anticipacije je ekspanzija tripleta iz generacije u generaciju. Pored za sada definisanuh 20 neuroloških bolesti postoje i neneurološke bolesti koje su izazvane ovim tipom mutacija. Osnovna karakteristika bolesti trinukleotidnih ponovaka je njihov neurodegenerativni karakter. Ovaj tip mutacija u određenim genima, npr. u genu za hangtingtin kod Hantingtonove bolesti dovodi do neurodegeneracije i smrti određene grupe neurona. Za dinamičke mutacije je karakteristično da u zavisnosti od bolesti samo određene grupe neurona odumiru. Interesantno je da kod Hantingtonove bolesti uloga proteina hantingtina nije poznata i da se taj protein eksprimira u svim drugim tkivima, ali se u tim tkivima ništa ne dešava nego samo u neuronima u određenim delovima mozga. Dakle da ponovimo- Anticipacija je povećanje ekspresivnosti mutacije u sukcesivnim generacijama usled nestabilnosti ponovaka kad pređu pražni broj. Ogleda se u pogoršanju kliničke slike i ranijoj pojavi bolesti u sledećoj generaciji. Što se tiče molekularne patogeneze i molekularnih mehanizama bolesti trinukleotidnih ponovaka mnoge stvari još uvek nisu jasne. Prisustvo patološki umnoženih trinukleotidnih ponovaka u genu odgovornom za određenu bolest ne mora biti isto. Na primer zna se da kod Hantingtonove bolesti različiti pacijenti iste dobi imaju isti broj trinukleotidnih ponovaka (taj patološki broj). Međutim u različito vreme u toku života razvijaju se simptomi Hantingtonove bolesti. Ono što je takođe interesantno za dinamičke mutacije s obzirom da su najčešće (za sad poznato), vezane za neurološke bolesti je to što se simtomi ovih bolesti i
psihijatrijskih bolesti često preklapaju. Zbog toga je molekularna dijagnostika jako bitna za utvrđivanje toga da li je taj pacijent oboleo od bolesti trinukleotidnih ponovaka. Može se desiti da pacijenti oboleli od Hantingtonove bolesti mogu imati simptome šizofrenije zbog čega bivaju smešteni u psihijatrijske ustanove umesto na neurološke klinike. Sve ove bolesti su fatalne i ne postoji lek ni za jednu od bolesti i praktično se leče simptomi. Ekspanzije trinukleotidnih ponovaka pokazuju somatski mozaicizam, znači da nije u svim ćelijama isti broj ponovaka. Nove tehnike molekularne dijagnostike kao što je PCR omogućavaju i prenatalnu molekularnu dijagnostiku (do 8. nedelje trudnoće) što je takođe jako važno. Međutim pošto se ove bolesti javljaju najčešće u kasnom životnom dobu postavlja se pitanje da li je etički saopštiti nekom da će oboleti od takve fatalne bolesti u određenom periodu života, ali pak za neke fatalne bolesti koje se ispoljavaju u ranijem periodu života prenatalna dijagnostika se primenjuje. Ekspanzije se dešavaju u mikrosatelitskim lokusima (3, 4, 5, 12 nukleotida). Mikrosateliti su jednostavne, ponovljene DNK sekvence sa osnovnim motivom (ponovkom) koga čini niz od 1 do 10 nukleotida. Broj ponovaka je polimorfan u populaciji i kreće se od 5 do nekoliko stotina. Imaju veću stopu mutacija u odnosu na ostatak genoma, a ona skoro eksponencijalno raste sa povećanjem broja ponovaka (dinamičke mutacije). Osim ekspanzija može da se desi (VRLO RETKO) kontrakcija tih tripleta. Ekspanzije su dakle ekskluzivno svojstvo humanog genoma!
Podela bolesti trinukleotida 1.U nekodirajućim delovima gena:
- Fragilni X sindrom (FRAXA)
- Fragilni XE sindrom (FRAXE)
- Miotonična distrofija tip 1 (DM1)
- Fridrajhova ataksija (FRDA)
- Spinocerebelarna ataksija tip 8 (SCA8)
- Spinocerebelarna ataksija tip 12 (SCA12) 2.U kodirajućim delovima gena: poliglutaminske bolesti-najčešće su to CAG ponovci koji kodiraju glutamin
- Hantingtonova bolest (HD)
- Spinalna i bulbarna mišićna distrofija (SBMA)
- Dentatorubralna- palidoluizijalna atrofija (DRPLA)
- Spinocerebelarna ataksija tip1 (SCA1), tip 2 (SCA2), tip 3 (SCA3), tip 6 (SCA6), tip 7 (SCA7), tip 17 (SCA17) U nekodirajućim delovima gena pored trinukleotidnih ponovaka mogu se naći i pentanukleotidi kao i ponovci od 12 nukleotida itd, međutim u kodirajućim regionima mogu se naći samo trinukleotidni ponovci. To je zbog okvira čitanja, jer ako bi tu bili pentanukleotidi npr. Došlo bi do pomeranje okvira čitanja i verovatno je taj događaj ako se i desi letalan za embrionalno razviće zbog čega takvih primera i nema.
mut:230- 00 Fragilni XE sindrom (FRAXE)
GCC FMR
(FRAXE);
Xq
wt :6- mut:
FMR
protein
X-vezano
Miotonična distrofija tip 1 (DM1)
CTG DMPK;
19q13.
wt :5- premut:35- 0 protomut:
mut:80- 0
miotonin protein kinaza
Autozomalno dominantno
Fridrajhova ataksija (FRDA)
GAA X25; 9q wt :7- premut:40- 20 mut:66- 0
frataksin Autozomalno recesivno
Spinocerebelar na ataksija tip 8 (SCA8)
CTG SCA8;
13q
wt :9- mut:100- 0
nepoznat Autozomalno dominantno
Spinocerebelar na ataksija tip 12 (SCA12)
CAG SCA
(PP2R2B)
5q31-
wt :7- mut:66-
PP2A-PR55 Autozomalno dominantno
Za većinu oboljenja se ne zna funkcija produkta kod zdravih osoba. A i ne zna se ni molekularna patogeneza u potpunosti zbog čega je vrlo teško razmatrati načine lečenja ovih bolesti.
Molekularni mehanizmi patogeneze:
- FRAXA i FRAXEekspanzija dovodi do hipermetilacije u promotoru gena i smanjenja transkripcije
- FRDAumnožena AT bogata sekvenca ometa transkripciju stabilizujući tripleks formu DNK
- DM1ekspanzija ometa ekspresiju gena, utiče na susedne gene i na druge RNK
- SCA8preko antisense RNK
Nijedna od ovih hipoteza nije baš dokazana, ali se molekularni mehanizmi patogeneze aktivo izučavaju kao bi se jednog dana došlo do adekvatne terapije ovih fatalnih bolesti. Generalno se veruje da do patogeneze odnosno do odumiranja specifičnih neurona dolazi zbog toga što povećan broj ekspanzija trinukleotida (npr. u genu za hantingtin kod Hantingtonove bolesti) dovodi do toksičnosti proteinskog produkta ili gubljenja njegove funkcije koja je vitalna za razvoj nervnog sistema. Takođe
je tu uključena sve više i uloga RNK i RNK vezujućih proteina. Sve u svemu mehanizmi patogeneze još uvek nisu sasvim jasni. Na primer u slučaju Hantingtonove bolesti znas se da je bolest u 70% slučajeva izazvana povećanjem ekspanzija tripleta CAG, ali u 30% slučajeva ti tripleti nisu nađeni a simptomi su isti što znači da još neke stvari utiču na pojavu ovih bolesti. 2012. su detektovane mikro DNK tj. ekstrahromozomalne cirkularne DNK u nukleusu i one se povezuju sa nastankom neuroloških bolesti. O njihovoj funkciji se jako malo zna. Dužine su od 200 do 400 bp i najviše ih ima u mozgu i jetri. Nije jasno zbog čega samo neuroni u specifičnim delovima mozga odumiru. (INTRIGANTNO: ekstremno duge ekspanzije u HD genu imaju za posledicu neselektivno odumiranje neurona. Ne zna se zašto je to tako-možda su ti neuroni u cerebellum -u osetljiviji na povećanje glutamina u tom proteinu, pa što je veći broj ekspanzija CAG to je više neurona osetljivo na taj protein).
Bolesti uzrokovane ekspanzijama trinukleotida u kodirajućim delovima gena (poliglutaminske bolesti)
Progresivne neurodegenerativne bolesti. Uzrokovane su manjim ekspanzijama CAG ponovaka u odnosu na ponovke u nekodirajućim regionima. CAG predstavlja kodon za glutamin, pa se ekspandovani ponovci translatiraju u poliglutaminski niz (pa je prva pretpostavka je bila da oni učestvuju kao transkripcioni faktori??). Ekspresija proteinskih produkata je ubikvitarna, a neurodegeneracija je selektivna. To znači da se ekspresija dešava u svim tkivima a neurodegeneracija je selektivna samo za određene grupe neurona u određenim delovima mozga.
Bolesti uzrokovane ekspanzijama trinukleotida u kodirajućim delovima gena (poliglutaminske bolesti): OBOLJENJE PONOVLJENI MOTIV
GEN I HROMOZOM
BROJ PONOVAKA
PROTEINSK I PRODUKT
NAČIN NASLEĐIVANJA Hantingtonova bolest(HD)
CAG IT15; 4p16.3 wt :6- mut:36- 1
hantingtin Autozomalno dominantno
Spinalna i bulbarna mišićna atrofija(SBMA)
CAG AR; Xq13-21 wt :12- mut:40-
androgeni receptor
X-vezano
Dentatorubralna- palidoluizijalna atrofija(DRPLA)
CAG DRPLA(B37); 12p13.
wt :7- mut:49-
atrofin-1 Autozomalno dominantno
Spinocerebelarna ataksija tip (SCA1)
CAG SCA1; 6p23 wt :6- mut:40-
ataksin-1 Autozomalno dominantno
Spinocerebelarna ataksija tip 2 (SCA2)
CAG SCA2; 12q24.1 wt :15- mut:35-
ataksin-2 Autozomalno dominantno
Neuropsihijatrijske bolesti su veoma interesantne. To su kompleksne bolesti jer su izgleda poligenske. Utvrđeno je da šizofrenija pokazuje anticipaciju. Praćene su tri generacije. U prvoj generaciji u kasnijem životnom dobu dolazi do jake depresije, u drugoj generaciji dolazi do nekih simptoma šizofrenije u ranijem životnom dobu dok u trećoj generaciji dolazi do punog razvoja simptoma šzofrenije. Ovo ukazuje na neku vrstu anticipaciju zbog čega se pretpostavlja da su jedan od uzroka šizofrenije dinamičke mutacije. Manično-depresivna psihoza takođe pokazuje anticipaciju zbog čega se pretpostavlja da je izazvana dinamičkim mutacijama ali pošto je takođe poligenska bolest izučavanja na DNK nivou su vrlo teška. Autizam je vrlo teško izučavati jer se dijagniza vrlo teško uspostavlja (veliki broj različitih kliničkih slika). Šizofrnija je zanimljiva i zbog toga što 3 do 4 % ljudi oboli od ove bolesti u svim populacijama (Evropa, Azija, Afrika...). Šizofrenija je danas vrlo zastupljenja. Nekada je bila zastupljenja 1% kako bi danas taj procenat skočio na 4%. Takođe je interesantno da u slučaju jednojajčanih blizanaca jedan može da oboli a drugi ne. U cilju izučavanja kako psihijatrijskih tako i neuroloških bolesti udružuju se različite zemlje kako bi se dobili što bolji rezultati i dali odgovori o uzroku ovih bolesti. Dakle kao što je već rečeno mogu se poklapati simptomi psihijatrijskih i neurodegenerativnih bolesti. Postoji još čitav niz bolesti koje pokazuju anticipaciju. Još se ne zna zbog čega su dinamičke mutacije otkrivene samo u humanoj populaciji..
Molekularna dijagnostika
Sa sigurnošću mogu dijagnostifikovati na DNK nivou kako prenatalno, već u drugom mesecu trudnoće, tako i postnatalno (presimptomatski i simptomatski).Molekularno-genetička dijagnostika je od izuzetne važnosti - prenatalnom dijagnostikom može se doneti odluka o prekidu trudnoće, dok će dijagnostika pre pojave simptoma bolesti moći da obezbedi adekvatan tretman pacijenta kada budu pronađeni terapija i protokoli za lečenje.
Mehanizmi patogeneze-šta sve može biti u osnovi mehanizma???
- Alternativno splasovanje pre-iRNK
- RNK editovanje: jedan od načina da se dobiju različiti proteini sa iste sekvence DNK. Tu učestvuju i male informacione RNK i brojni proteini. Ukoliko dođe do mutacije u nekim od ovih proteina može doći do pojave određene bolesti.
- Alternativno splajsovanje proteina
- Editovanje proteina (non intein splicing)
- Alternativna poliadenilacija: imate signal za poliadenilaciju na dva, tri mesta u sekvenci i dobijate različite proteine u zavisnosti od toga koji se signal koristi
- Korišćenje alternativnih start i stop signala: dobijate drugačiji protein sa jedne sekvence
- Enhenseri i sajlenseri: koji deluju na daljinu
- Hemijske modifikacije histona: takođe su značajne za regulaciju genske ekspresije i objašnjenje patogeneze ovih bolesti. Najčešći tip midifikacija histona je acetilacija lizinskih rezidua. Sve ove hemijske modifikacije histonskih proteina dovode do promene interakcije između histona i DNK. Ta modifikacija uzrokuje da se histoni otvore od DNK koja postaje pristupačna različitim enzimima što može dovesti do ekspresije gena koji do tada nije bio eksprimiran. Veruje se da modifikacija histona leži u osnovi patogeneze nekih bolesti.
- Alternativna posttranslaciona modifikacija proteina: kompleksna i uglavnom tkivno-specifična. Ukoliko dođe do greške u ovom kompleksnom sistemu to dovodi do gubitka ili do promene funkcije proteina šti može biti uzrok bolesti.
- RNK interferencija
- ehcDNK (eccDNA=extrachromosomal circular DNA): 200-400bp, nezavisna od hromozoma. Nalazi se u nukleusu. Za razliku od nižih organizama kod ljudi nastaje od unikalnih sekvenci koje se izvlače iz hromozoma i ostavlja za sobom mikrodelecije. Uloga tih ehcDNK još uvek nije jasna. Verovatno ima vitalan značaj za život ćelije, jer sama ćelija ne bi uzalud trošila energiju na njeno isecanje i izdvajanje iz hromozoma.
Svi ovi načini genske regulacije omogućavaju da vi sa jedne genske sekvence imate 3000 do 4000 hiljade genskih produkata. Ovi sistemi genske ekspresije su se vrlo razvili kod ljudi. Translacija u nukleusu-služi za kontrolu kvaliteta nascentnih iRNK na osnovu kojih ribozomi u nukleusu započinju da sintetišu protein u nukleusu i ukoliko taj protein ima nepravilni folding znači imaće nepravilnu konformaciju, odmah se degradira ta iRNK i to je dakle prva kontrola kvaliteta. Ukoliko je sve u redu iRNK odlazi u citoplazmu gde podleže drugim načinima kontrole. Takođe se pokazalo da je otkriće lncRNK i malih regulatornih RNK od izuzetnog značaja za regulaciju genske ekspresije. Može se kombinovati više ovih sistema što dovodi do pojave ovih bolesti zbog čega je proučavanje mehanizma patogeneze izuzetno komplikovano pogotovo, jer se ne zna funkcija brojnih proteina koji su uključeni u nastanak progresivnih neurodegenerativnih bolesti.
Molekularni mehanizmi patogeneze -Jedan od mogućih mehanizama je z adobijanje nove , toksicne, funkcije mutiranog proteina ili samo gubitak funkcije proteina. Formiraju se agregati ovog proteina u citoplazmi i nukleusu. Za različite bolesti to je različito, pa se tako kod nekih formiraju agregati Poly Glu proteina u nukleusu, kod nekih u citoplazmi ili i u citoplazmi i nukleusu. Takvi agregati ometaju normalno funkcionisanje ćelija, odn. procese transkripcije i translacije.
Nov entitet DNK u sisarskim celijama. Kod viših sisara uglavnom su poreklom od unikalnih nerepetativne sekvenci. Izvlačenjem iz hromozoma ostavljaju mikrodelecije i u zavisnosti gde su se desile mogu da budu uzrok patogeneze. Smatra se da imaju velikog udela u neurodegenerativnim bolestima. Kod nižih eukariota nisu poreklom samo od unikalnih sekvenci nego su uglavnom od repetitivnih sekvenci npr. od gena za rRNK, tRNK. Kod sisara su te unikalne repetitivne sekvence uglavnom obogacene 5’ UTR , genima, exonima i CpG ostrvcima. Cirkularne dvolancane DNK najcesce su 200-400bp duge. Od posebnog interesa je generisanje varijacija ovih DNK u somatskim tkivima kao sto je mozak sisara. Homologa rekombinacija za vreme razvica mozga tokom koje se generisu mikro DNK rezultuje u miko delecijama hromozomalne DNK. Identifikovano je na desetine hiljada unikalnih mikro DNK a najvise su zastupljene u mozgu i jetri.
MOGUĆI MOLEKULARNI MEHANIZMI NASTANKA DINAMIČKIH MUTACIJA
Predložena su dva mehanizma od kojih je jedan favorizovan. Moguće je da tokom replikacije dolazi do proklizavanja polimaraze na ovim sekvencama i da to dovodi do ekspanzije takvih ponovaka. Drugi mehanizam koji je verovatniji je „otmica“ proteina koji učestvuju u mismatch repair-u (MMR). Sisarske ćelije su evoluirale i stekle sofisticirani DNK reparacioni sistem koji koriguje pogrešno sparene ili oštećene baze. Sve više podataka sugerira da je,u nekim slučajevima, DNK reparaciona mašinerija uzročni faktor u mutacijama i pojavi bolesti, pre nego da ima ulogu u odbrani genomskog integriteta. Defektivna reparacija nastaje kada imamo ogromne konformacione promene kao što su LOOPED OUT CAG nizovi (strukture tipa šnale) ili velike lezije kao što su platinum ili O6 metilguanin. U ovim slučajevima MMR ne samo da ne funkcioniše kao čuvar genoma već postaje uzročni faktor vodeći npr. CAG ekspanzijama koja je letalna mutacija u osnovi Hantigtonove bolesti (HD). Ovaj proces nazivamo HIJACKING (otmica). Najverovatnije da ekspanzije nastaju zbog nesposobnosti normalne reparacione mašinerije da radi na specifičnim mestima. Po ovom modelu proteini MMR-a verovatno normalno funkcionišu na većini mesta u genomu ali neodgovarajuće deluju na dugačkim specifičnim mestima npr. na dugim triplet alelima. Pokazano je da stabilne intralančane vodonične veze blokiraju reparaciju petlji tipa šnale ( loops) in vivo. Animalni modeli nedvosmisleno ukazuju na MMR kao uzročni faktor u ekspanzionim mutacijama.Ekspanzije su po definiciji proces u kome je ekstra DNK inkorporirana u DNK templejt, pri čemu je celularna uloga MSH2/MSH3 da ekscizira heterodupleksnu DNK. Ovi, gotovo suprotni podaci otvaraju mogućnost da MMR može prepoznati heterodupleksne petlje ali nije u mogućnosti da ekscizira leziju i reparira je. Nekoliko podataka sugerira da je ovakav model moguć in vivo. Moore i saradnici su u kvascu na His lokusu produkovali stabilne heterodupleksne petlje za najmanje 10 različitih tripleta (uključujući CAG, CTG, GTT i ATT). Heterodupleksne petlje generisane od tripleta koji su sposobni da formiraju
stabilne petlje tipa ukosnice su ostale u formi petlji i izbegle su reparaciju, dok su petlje formirane od sekvenci koje nemaju mogućnost sekundarne strukture ( engl. non-structure forming triplets) (npr. GTT) bile efikasno uklonjene iz genoma. Pravljenjem odgovarajućih tačkastih mutacija, nizovi sa trinukleotidnim ponovcima sa baznim substitucijama dizajniranim tako da destabilišu strukture tipa ukosnice su takodje efikasno reparirani. Ovi podaci sugerišu da je reparacija struktura tipa ukosnice blokirana stabilnim vodoničnim vezama (intralančanim) i aktivnom formacijom sekundarne strukture. Lahue i saradnici su kvantifikovali frekvencu ekspanzija in vivo za brojne nizove ponovljenih tripleta CAG, CTG, GTT, GAC i CGG. Njihovi rezultati su pokazali da ponovci tripleta koji imaju mogućnost formiranja sekundarne strukture povećavaju frekvencu ekspanzija kod kvasca od 5 do 1000 puta. Ekvivalentan ponovljeni niz koji nema mogućnost formiranja sekundarne strukture ne umnožava se in vivo a mutaciona frekvenca se ne može razlikovati od ostalih sekvenci. Ovi podaci ukazuju na to da ne samo da se heterodupleksne strukture formiraju in vivo , već su ključni intermedijeri u mehanizmu ekspanzija.
