Klinicka biohemija SKRIPTA, Rezime od Klinička hemija

Preuzmite Klinicka biohemija SKRIPTA i više Rezime u PDF od Klinička hemija samo na Docsity!

Školska 2019/2020.

KLINIČKA BIOHEMIJA

RETIKULUM

1. Referentni intervali i interferencija pri izvođenju standardnih biohemijskih testova

Biohemijski testovi se koriste u svim granama medicine. Mogu se koristiti prilikom postavljanju dijagnoze i praćenju odgovora pacijenta na terapiju; mogu biti korisni u skriningu za postojanje bolesti ili proceni prognoze ukoliko je dijagnoza već postavljena. Kako bi analiza biohemijskih parametara pomogla u razlikovanju fiziološkog stranja (zdrav organizam) od bolesti, potrebno je definisati fiziološke, referentne, vrednosti biohemijskih parametara (analita). Danas je prihvaćeno da referentne vrednosti opisuju oscilacije vrednosti određenog parametra u zdravoj populaciji. Zbog prisutnih oscilacija, referentne vrednosti se češće definišu kroz tzv referentne intervale a koji obuhvataju 95% vrednosti zdrave populacije. Međutim, po definiciji, 5% zdrave populacije će imati vrednosti izvan referentnog intervala (uzimajući u obzir normalnu raspodelu, 2,5% će biti ispod a 2,5% iznad referentnog intervala). Referentni intervali su definisani od strane Internacionalne federacije Kliničke Hemije (International Federation of Clinical Chemistry, IFCC).

Između referentnih intervala za isti biohemijski parametar može postojati razlika, u zavisnosti od korišćene metode i standardizacije, tako da laboratorije mogu da definišu svoje sopstvene referentne intervale uzimajući u obzir korišćene metode i zdravu populaciju koju prate. Na referentni interval mogu uticati godine starosti, pol i rasna pripadnost što je potrebno uzeti u obzir prilikom izbora zdrave populacije za definisanje referentnog intervala.

Pored vrednosti biohemijskih parametara koje su stvarno pozitivne (SP) ili stvarno negativne (SN) i koje se određuju na osnovu referentnog intervala, postoje i lažno pozitivne i lažno negativne vrednosti.

Lažno pozitivne (LP) vrednosti se odnose na zdrave osobe čije se vrednosti biohemijskog parametra nalaze izvan referentnog intervala a lažno negativne (LN) vrednosti se odnose na bolesne ljude a čije se vrednosti određenog biohemijskog parametra nalaze u okviru referentnog intervala.

Svaki biohemijski test ima određenu senzitivnost i specifčnost. Senzitivnost testa pokazuje da će on biti pozitivan u slučaju postojanja patološkog nalaza (prisustvo bolesti). Specifičnost testa pokazuje da će on biti negativan u slučaju normalnog (fiziološkog) nalaza (odsustvo bolesti). Senzitivnost se izračunava prema formuli: SP/(SP+LN) x 100 a specifičnost prema formuli SN/(SN+LP) x 100.

***Pitanje: Merenjem koncentracije benzoilegonina u urinu kod 25 korisnika kokaina, 23 nalaza su bila pozitivna a 2 negativna. Kolika je vrednost senzitivnosti ovog testa? 92%

Kao uzorak u kliničko-biohemijskoj laboratoriji se najčešće koristi krv, čijom se daljom obradom, zavisno od potreba, dobija uzorak plazme odnosno seruma. Plazma predstavlja tečni deo krvi koji se izdvaja centrifugiranjem krvi koja je uzorkovana uz prisustvo odgovarajućeg antikoagulansa. Serum predstavlja tečni

Vrsta biohemijske metode: primenom glukozo oksidaznog testa (enzimski metod) će se dobiti preciznija vrednost koncentracije glukoze u odnosu na primenu Folin-Wu metode jer je glukozo oksidaza specifična za glukozu dok Folin-Wu metoda detektuje sve redukujuće šećere.

***Pitanje: Koja od navedenih tvrdnji koja se odnosi na očekivane oscilacije vrednosti biohemijskih parametara je tačna? Koncentracija glukoze ne zavisi od vrste uzorka (plazma/serum/puna krv), Tokom godine ne dolazi do promene koncentracije vitamina D u serumu, Tokom dana ne dolazi do promene koncentracije kortizola u uzorku seruma, Aktivnost kreatin kinaze u plazmi je povećana posle mišićne aktivnosti

Na vrednost biohemijskog parametra može uticati i kvalitet uzorka. To podrazumeva određeni način sakupljanja uzorka, korišćenje odgovarajućih reagenasa za stabilizaciju uzorka („konzervans“), odnosno određeni način čuvanja uzorka.

Poznato je da se kalcijum u plazmi nalazi vezan za proteine plazme ili slobodan jonizovan, koji je fiziološki aktivan. Kako na odnos ova dva oblika kalcijuma utiče pH vrednost plazme, uzorak za određivanje koncentracije slobodnog jonizovanog kalcijuma se sakuplja bez poveske, jer smanjanje pH vrednosti krvi, kao posledica postavljanja poveske, može dovesti do povećanja koncentracije slobodnog kalcijuma zbog smanjenja afiniteta vezivanja jona kalcijuma za proteine plazme.

Takođe, često je potrebno da sud za sakupljanje uzorka sadrži odgovarajući „konzervans“. Radi optimalne procene koncentracije glukoze u uzorku krvi ili urina često se koristi NaF koji, kao inhibitor glikolize, stabilizuje koncentraciju glukoze (u urinu, posebno u uslovima sakupljanja 24h urina i/ili prisutne bakterijske infekcije).

Izlaganje uzorka krvi/urina dnevnoj svetlosti može dovesti do smanjenja koncentracije fotosenzitivnih jedinjenja, npr bilirubina (i konjugovanog i nekonjugovanog).

Izlaganje uzorka krvi/urina delovanju atmosferskog kiseonika može dovesti do smanjenja koncentracije jedinjenja koja su osetljiva na oksidaciju. Tako se, na primer, sterkobilinogen i urobilinogen moraju određivati u svežim uzorcima stolice odnosno urina, pošto se brzo oksiduju u sterkobilin odnosno urobilin.

Uzorak mora biti sakupljen i obrađen u orgovarajućoj zapremini jer nedovoljna količina uzorka može da ograniči izvođenje analize ili dovede do nepreciznog rezultata.

Uzorci krvi se nikada ne sakupljaju iz intravenskih braunila jer sastav i zapremina infuzione tečnosti mogu uticati na biohemijski sastav ili koncentraciju određenih analita u samom uzorku (npr. povećana koncentracija glukoze kod pacijenta koji prima infuziju 5% glukoze; ili snižena koncentracija biohemijskih parametara kod pacijenta koji prima fiziološki rastvor)

Takođe je, za kvalitet rezultata biohemijske analize, značajano i vreme uzimanja uzorka. Naime, neke analize ne treba raditi pošto je pacijent bio podvrgnut određenoj dijagnostičkoj ili terapijskoj proceduri, jer one mogu dovesti do lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata. Na primer, pacijent koji je bio podvrgnut kardiopulmonalnoj reanimaciji/perkutanoj angiografiji će svakako imati povišene vrednosti kreatin kinaze. Pacijent koji je podvrgnut rektalnom pregledu prostate će imati povišene vrednosti prostata specifičnog antigena (PSA- tumor marker).

Zbog svih navedenih razloga, uzorak se mora i sakupiti i čuvati na odgovarajući način koji je u skladu sa vrstom biohemijske analize za koju je uzorak namenjen.

***Pitanje: Koja od navedenih tvrdnji o uticaju kvaliteta uzorka na vrednost određenog biohemijskog parametra je tačna? Na koncentraciju jonizovanog Ca2+ u uzorku utiče vrednost pH krvi, Metabolička aktivnost ćelija krvi ne utiče na koncentraciju biohemijskih parametara, Krv za biohemijsku analizu se može sakupljati iz intravenske braunile jednako

pouzdano kao i venepunkciojm, Koncentracija sterkobilinogena i urobilinogena se sa jednakom pouzdanošću može određivati u svežim kao i u uzorcima koji su izloženi delovanju atmosferskog kiseonika

Antikoagulansi su prisutni u epruvetama u koje se kolektuje krv radi pripreme uzorka plazme.

Antikoagulansi se razlikuju prema mehanizmu svog delovanja, što je potrebno imati u vidu prilikom njihovog izbora kako ne bi uticali na vrednost biohemijskog parametra koji se određuje. Postoje direktni i indirektni anikoagulansi. Prvi deluju direktno na faktore koagulacije time što smanjuju njihovo dejstvo, a drugi sprečavaju sintezu tih istih faktora.

Antikoagulansi koji se koriste prilikom uzorkovanja krvi su najčešće: EDTA, heparin, citrat i oksalat.

EDTA, Na-citrat i oksalat- se koriste isključivo in vitro. Deluju kao helatori jona Ca2+ čime se onemogućavaju učešće ovih jona u kaskadi kolagulacije te se ona kompromituje. EDTA se smatra pouzdanim antikoagulansom za potrebe hematoloških analiza pošto povoljno deluje na morfologiju i funkciju ćelija krvi dok se Na-citrat koristi u transfuziologiji za pripremu krvi donatora.

Heparin je polisaharid bogat sulfatnim grupama, koje ga čine negativno nelektrisanim. Može se koristiti i in vivo i in vitro. On predstavlja mešavinu mukopolisaharida koja stimuliše aktivnost antitrombina III, proteina plazme koji inaktivira trombin.

Prisustvo antikoagulansa može uticati na koncentraciju/aktivnost određenog biohemijskog parametra. Pokazano je da su koncentracije glukoze, ukupnog bilirubina, uree, kreatinina, ukupnih proteina, albumina i aktivnost AST i CK bile statistički značajno niže u plazmi izdvojenoj pomoću citrata nego u serumu. Značajno smanjenje koncentracije uree, kreatinina i ukupnih proteina uz značajno povećanje koncentracije bilirubina je uočeno u plazmi izdvojenoj pomoću heparina, dok je u prisustvu EDTA pokazano značajno smanjenje koncentracije uree, kreatinina, ukupnih proteina i aktivnost AST u odnosu na serum.

Plazma izdvojena pomoću citrata se uglavnom koristi za određivanje faktora koagulacije

***Pitanje: Koji od navedenih antikoagulanasa svoj efekat ne ostvaruje vezivanjem jona Ca2+? Heparin, EDTA, Citrat, Oksalat

Prednosti korišćenja plazme su sledeće: Vreme obrade: Za potrebe izdvajanja plazme, uzorci krvi se mogu centrifugirati odmah, dok je za izdvajanje seruma potrebno sačekati oko 30 min. da se završi proces koagulacije. Radna zapremina: Iz istog uzorka krvi se dobije oko 15 do 20 % veća zapremina plazme u odnosu na zapreminu seruma. Nedostaci korišćenja plazme su sledeći: Prisustvo antikoagulansa interferira sa mnogim metodama prilikom određivanja nekih biohemijskih parametara ili dovodi do promene koncentracije merenog parametra. Tako na primer, zbog stvaranja kompleksa EDTA i citrata sa jonima metala može doći do:  inhibicije aktivnosti alkalne fosfataze zbog vezivanja jona Zn koji je njen endogeni aktivator, inhibicije aktivnosti metaloproteinaza, inhibicije vezivanja jona Ca2+ za heparin, smanjenja koncentracije jona Ca2+  interference u distribuciji jona između unutarćelijskog i vanćelijskog prostora (npr jona Cl-, NH4 +) dok prisustvo bilo kog antikoagulansa može dovesti do:  inhibicije metaboličkih ili katalitičkih reakcija (npr. delovanje Taq polimeraze tokom reakcije lančanog umnožavanja DNK, PCR). Sa druge strane, zbog odsustva antikoagulansa pri izdvajanju seruma, ne postoji potencijalni problem od interferencije antikoagulansa sa određenim biohemijskim parametrom i njegovim određivanjem.

Lipemija značajno interferira sa hematološkim testovima kao i sa izvođenjem elektroforeze i hromatografije. Lipemija značajno interferira sa fotometrijskim merenjem apsorpcije/rasipanja svetlosti što dovodi do povećanja ili smanjenja izmerenih vrednosti biohemijskih parametara. Prisustvo lipoproteina smanjuje prividnu koncentraciju analita u uzorku jer dovodi do smanjenja raspoložive zapremine vode u uzorku (npr snižene koncentracije Na+, K+ u lipemičnom serumu). Da bi se izbegao uticaj lipemije, potrebno je da pre sakupljanja uzorka krvi pacijent ne uzima hranu tokom 12h, ili da ne prima parenteralnu infuziju lipida 8h. Lipidi se mogu ukloniti iz lipemičnog seruma centrifugiranjem, ekstrakcijom organskim rastvaračima ili precipitacijom. Postoje i biohemijski testovi koji, pored neophodnih reagenasa, sadrže i određeni deterdžent koji uklanja zamućenje plazme/seruma poreklom lipemije. Uklanjanje lipemije se vrši tek posle određivanja koncentracije lipidnih frakcija u uzorku. Uzorci sa visokim sadržajem lipida ne treba da se zamrzavaju. Postoje značajan uticaj lipemije na koncentraciju uree i K+.

***Pitanje: Koja je tvrdnja o lipemičnom serumu tačna? Lipemični serum ne pokazuje interferencu sa određivanjem niti jednog biohemijskog parametra, Lipemija značajno interferira sa hematološkim testovima, izvođenjem elektroforeze i hromatografije i određivanjem koncentracije uree i jona K+; Ne postoji način kojim se lipidi mogu ukloniti iz lipemičnog seruma; U uslovima lipemičnog seruma prvo je potrebno ukloniti lipemiju pa potom određivati lipidne frakcije u uzorku

Ikteričan uzorak je uzorak koji sadrži povećanu koncentraciju bilirubina, bilo slobodnog ili vezanog za proteine (albumine) plazme. Bilirubin vezan za albumine (nekonjugovan) je liposolubilan a slobodni (konjugovani) bilirubin je hidrosolubilan.

Konjugovani bilirubin može biti prisutan u urinu ukoliko je u plazmi povećana njegova koncentracija. Kod pacijenata sa proteinurijom, u urinu može biti prisutan čak i bilirubin vezan za albumine.

Posle intracerebralnog krvarenja, može se javiti povećana koncentracija nekonjugovanog bilirubina u cerebrospnalnoj tečnosti dok se u uslovima povećanog permeabiliteta krvno moždane barijere (uslovi inflamacije) u cerebrospinalnoj tečnosti se može pojaviti i bilirubin vezan za albumine.

Bilirubin pokazuje interferencu prilikom određivanja svakog biohemijskog parametra čija se apsorbanca meri u istom intervalu talasnih dužina kao i bilirubin (340-500nm). Često interferira i sa različitim testovima koagulacije.

Kako bilirubin reaguje sa H 2 O 2 , on interferira sa analitičkim metodama koje se zasnivaju na oksidazno/peroksidaznom principu (u reakcijama nastaje H 2 O 2 koji reaguje sa bilirubinom umesto da deluje sa sledećim aanalitom ili enzimom u samoj metodi) i dovodi do smanjenja dobijenog rezultata (npr. određivanje holesterola, triacilglicerola, glukoze, urata, kreatinina). Hiperbilirubinemija se mora potvrditi odgovarajućom biohemijskom metodom.

Uticaj hiperbilirubinemije na merenje drugih biohemijskih parametara se može smanjiti izborom odgovarajuće metode sa kojom bilirubin ne interferira ili koja obavezno sadrži slepu probu; poznavanjem koncentracije bilirubina kao granične za ispoljavanje interferencije sa ostalim biohemijskim parametrima; ultrafiltracijom seruma.

***Pitanje: Koja tvrdnja o ikteričnom serumu je tačna? Za potvrdu ikteričnog seruma nije potrebna biohemijska metoda već se vrši makroskopski; Ikteričan serum sadrži isključivo povišenu koncentraciju nekonjugovanog bilirubina; Bilirubin u ikteričnom serumu ne interferira sa određivanjem ostalih biohemijskih analita; Reagovanjem sa H2O2, bilirubin dovodi do lažno negativnih rezultata određenih analita

Najčešće biohemijske analize koje se svakodnevno izvode na nivou primarne zdravstvene zaštite (Dom zdravlja) su, sa svojim odgovarajućim referentnim intervalima, prikazane u tabeli.

***Pitanje: Pacijentkinja starosti 52 godine se javlja svom izabranom lekaru na kontrolu. U biohemijskom nalazu uočena je vrednost koncentracije glukoze od 7,5 mmol/l. Pri prethodnim biohemijskim ispitivanjima, nije uočen patološki nalaz glikemije. Koji od navedenih zaključaka koji se odnosi na tumačenje dobijenog rezultata je tačan?Odgovori: a) Za pravilno tumačenje ovog rezultata je neophodan podatak o vremenu sakupljanja uzorka pošto koncentracija glukoze od jutra do večeri može da varira i do 50% b) Uzimajući u obzir raspodelu vrednosti u okviru referentnog intervala, ova vrednost se može smatrati fiziološkom c) Ukoliko je pacijentkinja prethodno bila izložena fizičkom naporu, izmerena vrednost glukoze je očekivana d) Za pravilno tumačenje ovog rezultata je neophodan podatak o prethodnom uzimanju obroka kao i vrsti uzorka (puna krv ili plazma)

povećana liza eritrocita (hemoliza) ili gubitak eritrocita (krvavljenje), i kostna srž nije u stanju da dovoljno brzo sintetiše nove eritrocite, doći će do smanjenja ukupnog broja eritrocita – anemije. Određivanje broja eritrocita može da ukaže na problem u produkciji eritrocita i/ili njihovom životnom veku, ali ne može da odredi uzrok. Za utvrđivanje uzroka anemije potrebno je uraditi dodatne analize – razmaz krvi, određivanje broja retikulocita, određivanje nivoa gvožđa, vitamina B 12 i folata, a u nekim slučajevima i analizu kostne srži.

Uz određivanje broja eritrocita, određuje se i vrednost hematokrita i koncentracija hemoglobina.

Hematokrit (Hct) je procenat (%) zapremine krvi koji čine eritrociti. Njegove referentne vrednosti iznose 0,40– 0, 45 0 L/L za muškarce odnosno 0, 380 – 0, 42 0 L/L za žene.

Pored toga što koncentracija hemoglobina (Hb-g/L) može biti izmenjena u određenim patološkim stanjima treba imati u vidu da koncentracija hemoglobna pokazuje fiziološke varijacije u zavisnosti od životnog doba (videti tabelu)

Promena sadržaja hemoglobina u zavisnosti od životnog doba

Životna dob Koncentracija hemoglobina (g/L)

Na rođenju 250

Posle 3.meseca 200

Posle 1 godine 170

Odrasla dob (M) 150

Odrasla dob (Ž) 145

Porast koncentracije Hb koji često prati povišena vrednost hematokrita može da odražava:  smanjen volumen plazme (npr: dehidratacija, konzumiranje alkohola, cigareta, primena diuretika) ili  povećanje mase eritrocita (npr. policitemija)

Tumačenje rezultata broja eritrocita Rezultate broja eritrocita uvek treba tumačiti u sklopu ostalih parametara – koncentracija hemoglobina, hematokrit, broj retikulocita, i/ili eritrocitnih indeksa. Akutni ili hronični gubitak krvi ili eritrocita, kao i oboljenja ili stanja koja smanjuju produkciju eritrocita u kostnoj srži će uzrokovati smanjenje broja eritrocita u perifernoj krvi.

Tumačenje rezultata - Hemoglobin (Hb) i hematokrit (Hct) Koriste se za dijagnostikovanje i praćenje stanja i/ili oboljenja Er. Najčešće se rade zajedno, uz određivanja broja Er. Koriste se:  u cilju postavljanje dijagnoze i praćenje ozbiljnosti anemije (snižen broj Er, hemoglobin i hematokrit) ili policitemije (povišeni broj Er, hemoglobin i hematokrit)  radi praćenje terapijskog odgovora kod anemije ili policitemije ili drugih poremećaja koji utiču na životni vek Er  u svrhu donošenja odluke o transfuziji ili drugoj terapiji kod ozbiljnih anemija  za procenu ozbiljnosti stepena dehidratacije (hematokrit!)

***Pitanje: Na kakav nalaz ukazuje vrednost koncentracije hemoglobina od 110g/L kod odraslog muškarca? Odgovori: ova vrednost ukazuje na nedostatak folata i vitamina B12 koji su neophodni za normalnu hematopoezu, ova vrednost ukazuje na sniženu koncentraciju Hb, ova vrednost je očekivan (normalan) rezultat za odrasle osobe muškog pola, ova vrednost ukazuje na povišenu koncentraciju Hb

MCV (Mean corpuscular volume) – srednja zapremina eritrocita

[𝒇𝑳]

Ovaj indeks omogućava izračunavanje prosečne zapremine eritrocita u femtolitrima (1 fL = 10-^15 L) Referentne vrednosti za MCV su 83 - 97 fL. U odnosu na vrednosti MCV, anemije se mogu klasifikovati kao:  Mikrocitna, MCV < 80 fL  Normocitna, MCV = 80 – 100 fL  Makrocitna, MCV > 100 fL

MCH (Mean corpuscular hemoglobin) – prosečni sadržaj hemoglobima u eritrocitima

[𝒑𝒈]

Prosečna količina hemoglobina u jednom eritrocitu, izražava se u pikogramima (1 pg = 10-^12 g). Referentne vrednosti za MCH su od 27,4 do 33,9 pg. U odnosu na vrednosti MCH, anemije se mogu klasifikovati kao:  Normohromna, MCH = 27 – 33 pg  Hipohromna, MCH < 27 pg

MCHC (Mean cell hemoglobin concentration) - prosečna koncentracija hemoglobina u eritrocitu

𝑯𝒆𝒎𝒂𝒕𝒐𝒌𝒓𝒊𝒕 (%)^

[𝒈 ⁄ ]𝑳

Ovaj indeks pokazuje kolika je koncentracija hemoglobina u 1 L eritrocita i izražava se u g/L. Referentne vrednosti za MCHC su 320 - 345 g/L.

Broj retikulocita Retikulociti su nezreli eritrociti tako da određivanje broja retikulocita pomaže u dijagnostici uzroka anemije. Normalan procenat retikulocita je 0,5 - 2,0 % (30 000 - 130 000 u mikrolitru). Snižen broj reticulocita ukazuje da je uzrok anemije smanjena produkcija eritrocita u kostnoj srži dok povišen broj retikulocita ukazuje na anemiju uzrokovanu gubitkom eritrocita.

 nedostatkom činilaca neophodnih za sintezu eritrocita ( tako na primer deficit gvožđa dovodi do sideropenijske anemije; deficit vitamina B12 i folne kiseline dovodi do megaloblastne anemije; deficit pojedinih enzima neophodnih za normalno funkcionisanje Er dovodi do hemolizne anemije; poremećaj sinteze hemoglobina dovodi do talasemije)  povećanom lizom eritrocita (hemoliza) Ukoliko se ustanovi snižen broj eritrocita potrebno je proveriti hemoglobin/hematokrit:  Kod žena, da li je Hb < 120 g/L ili Hct < 0, 36 0 L/L  Kod muškarca, da li je Hb < 135 g/L ili Hct < 0, 41 0 L/L

Da bi se utvdrilo o kojoj anemiji je reč, potrebno je odrediti MCV

Ukoliko je MCV 80-100, radi se o normocitnoj anemiji. Ona se najčešće javlja u inflamatornim stanjima ili u sklopu hroničnih bolesti. U slučaju ove anemije, potrebno je proveriti indirektni bilirubin, LDH, haptoglobin i broj retikulocita.

Ukoliko je MCV < 80, radi se o mikrocitnoj anemiji. Ona najčešće nastaje kao posledica deficita gvožđa ali može biti udružena i sa hroničnim bolestima. Pored određivanja koncentracije gvožđa u serumu, potrebno je odrediti i feritin i TIBC. Ako se potvrdi nedostatak gvožđa, treba potražiti uzroke hroničnog krvarenja (obilna menstrualna krvavljenja, razmotriti kolonoskopiju). Mikrocitna anemija se može javiti i kod trovanja olovom, kod deficita bakra i u talasemiji.

Ukoliko je MCV > 100, radi se o makrocitnoj anemiji. Ona se najčešće javlja kod oboljenja jetre, u alkoholizmu ili mijelodisplastičnom sindromu. Kod sumlje na ovaj oblik anemije potrebno je proveriti nivo vitamina B 12 i folata kao i razmotriti uticaj određenih lekova (hidoksiurea, AZT, metotreksat).

Pre postavljanja dijagnoze anemije, obratiti pažnju da li je prisutno neko od sledećih stanja :  akutna krvavljenja- pad u vrednostima Hb ili Hct se može pokazati tek nakon 36 do 48 sati nakon akutnog krvavljenja (iako će pacijent možda biti u hipoten ziji).  trudnoća- u trećem trimestru, volumen i Er i plazme se povećava i to za 25 % (Er) i 50 % (plazme). U laboratorijskom nalazu će biti prisutno smanjenje Hb, Hct, i broja Er, često do nivoa anemije, ali ako se izračuna masa Er, vidi se da to nije slučaj.  smanjenje volumena (hipovolemija)-kod pacijenata kod kojih je došlo do ozbiljnog pada cirkulatornog volumena, znaci anemije će se u laboratorijskom nalazu pokazati tek nakon rehidratacije.

Povećanje broja eritrocita (policitemija) Policitemija se najbolje izražava preko ukupne zapremine eritrocita (hematokrit), jer su kliničke manifestacije pre svega uzrokovane povećanom masom eritrocita u cirkulaciji i sledstvenim povećanjema viskoziteta krvi uz specifične patofiziološke promene (npr., tromboza kod polycythemie vera, cijanoza kod kongenitalne methemoglobinemije). Policitemije se javljaju usled (1) prekomernog rasta populacije hematopoetskih progenitora—primarne policitemije (npr. polycythemia vera), (2) mutacije u eritropoetinskim progenitorima, ili (3) povećanog nivoa faktora koji podstiču eritropoezu u cirkulaciji (npr. kod hroniče bolesti pluća, trovanja kobaltom itd).

***Pitanje: Deficit kojih od navedenih vitamina/minerala neophodnih za sintezu DNK može značajno uticati na smanjenje broja eritrocita u perifernoj krvi? Odgovori: vitamin B12 i folna kiselina, vitamin B1 i B6, vitamin C, gvožđe i fosfat

Određivanje nivoa gvožđa (Fe) služi za određivanje količine cirkulišućeg Fe, kapaciteta krvi za transport Fe i nivoa Fe u depoima, kao i u diferencijalnoj dijagnozi anemija. Gvožđe se u serumu transportuje vezano za

protein ( apotransferin ) u kompleksu koji je označen kao transferin do ciljnih tkiva (kostna srž, retikulo- endotelijalni sistem slezine i jetre).

Apotransferin je β-globulin i poseduje dva vezna mesta za gvožđe. Svako od ovih veznih mesta može da veže feri oblik gvožđa (Fe+3) zajedno sa jednim jonom HCO 3 -. Nastali kompleks apotransferina sa Fe+3^ se naziva transferin. U sastavu transferina, gvožđe se prenosi do ciljnih tkiva koja moraju da poseduju specifičan receptor na površini svojih ćelija, tzv transferinski receptor, preko koga se gvožđe unosi u ćeliju endocitozom. U uslovima niske koncentracije serumskog gvožđa, povećava se nivo ekspresije transferinskog receptora na membranama ćelija ciljnih tkiva i obrnuto. Zahvaljujući ovome, određivanje serumskog transferinskog receptora se koristi kao marker potreba za gvožđem.

Feritin je ubikviratni unutarćelijski protein koji čuva unutarćelijsko gvožđe i kontrolisano ga oslobađa. Količina serumskog feriina zbog toga predstavlja meru depoa unutarćelijskog gvožđa. U hepatocitima, makrofagima kostne srži i drugih organa, feritin je rezerva gvožđa. Gvožđe koje se vezuje i ugrađuje u feritin je Fe+2^ i podleže stalnoj oksidaciji i redukciji. Kada se prevaziđe kapacitet feritina za vezivanje Fe, nastaje nerastvorni hemosiderin iz koga se Fe ne može osloboditi.

Biohemijski parametri koji se takođe koriste za procenu depoa gvožđa u organizmu su TIBC, UIBC i feritin. Ukupni vezujući kapacitet za gvožđe (total iron-binding capacity, TIBC ) predstavlja meru kapaciteta vezivanja gvožđa sa transferinom. TIBC meri sve proteine u krvi koji vezuju gvožđe uključujući transferin. Kako se sinteza transferina povećava pri povećanim potrebama za Fe, u uslovima kada su rezerve Fe niske, raste nivo transferina. Nesaturisani vezujući kapacitet za gvožđe (unsaturated iron binding capacity, UIBC) meri kapacitet rezerve transferina, odnosno deo transferina koji nije saturisan gvožđem. Nesaturisani vezujući kapacitet za gvožđe (unsaturated iron binding capacity, UIBC) se izračunava korigovanjem vrednosi TIBC za vrednost serumskog gvožđa. U uslovima anemije nastale usled niskog nivoa serumskog gvožđa, TIBC i transferin su povećani (kompenzatorni mehanizam) dok je u uslovima anemije u hroničnim bolestima nivo serumskog gvožđa nizak (unutarćelijsko zadržavanje gvožđa u kompleksu sa feritinom) kao i nivoi TIBC i transferina (pokušaj onemogućavanja gvožđa da dođe u kontakt sa patogenom povećavanjem kompleksa sa feritinom).

Referentne vrednosti pokazatelja Fe u serumu

muškarci žene

Fe 11-13 μmol/L 8-30 μmol/L

TIBC 49-72 μmol/L 49-75 μmol/L

Transferin 2-4 g/L (25-50 μmol/l) 2-4 g/L (25-50 μmol/l)

Saturacija transferina 15-45% 15-45%

Feritin 20-250 μg/l 10-120 μg/l

***Pitanje: Kakve će biti vrednosti TIBC, i feritina kod odrasle osobe sa nedostatkom gvožđa u organizmu? Odgovori: povišena vrednost TIBC i povišena koncentracija feritina, povišena vrednost TIBC i snižena koncentracija feritina, snižena vrednost TIBC i normalna koncentracija feritina, snižena vrednost TIBC i snižena koncentracija feritina

 u uslovima kada postoji sumnja na hematološka ili autoimunska oboljenja ili na stanje imunodeficijencije  periodično, u cilju praćenja efikasnosti terapije koja specifično deluje na leukocite, kao što su npr. terapija jonizujućim zraćenjem ili hemioterapija

Zastupljenost pojedinih tipova leukocita u perifernoj krvi (leukocitarna formula)

Vrsta ćelije Ref. vrednosti Jedinice Leukocitarna formula

ukupni leukociti 3,4-9,7 109 /L

neutrofilni granulociti 2,06-6,49 109 /L 44 - 72 %

limfociti 1,19-3,35 109 /L 20 - 46 %

monociti 0,12-0,84 109 /L 2 - 12 %

eozinofilni granulociti 0 - 0,43 109 /L 0 - 7 %

bazofilni granulociti 0 - 0,06 109 /L 0 - 1 %

Mogući uzroci promene broja leukocita u perifernoj krvi

Leukocitoza > 9,7 × 109 Leukopenija < 3,4 × 10^9

Infekcije Oštećenje kostne srži

Inflamatorna stanja Oboljenja kostne srži

Leukemije i mijeloproliferativne neoplazme Limfomi ili tumori koji su se proširili (metastazirali) u kostnu srž

Stanja koja dovode do oštećenja tkiva (nekroze) – opekotine, hirurške intervencije Anafilaktički šok

Tuberkuloza Poremećaji slezine

Alergijske reakcije Autoimunski poremećaji

Intenzivno vežbanje Ciroza jetre

Intenzivni emocionalni ili fizički stres Uznapredovale infekcije (sepsa)

Poslednji meseci trudnoće i porođaj Virusne infekcije imunskog sistema (HIV)

Oporavak nakon hemioterapije Perniciozna anemija

Tifusna i paratifusna groznica

Očekivane promene u broju leukocita se mogu videti kod osoba kojima je odstranjena slezina (uočava se perzistentno blago do umereno povećanje broja leukocita u perifernoj krvi); kod novorođenčeta i

odojčeta (broj leukocita je nešto veći nego kod odrasle osobe); kod starijih osoba (u uslovima infekcije može izostati povećanje broja leukocita); kod primene određenih lekova (antiepileptici, antibiotici, tiazidi, cimetidin, etanol, imunosupresivi).

***Pitanje: Koji od navedenih tipova leukocita NIJE granulocit? Odgovori: limoficiti, bazofili, neutrofili, eozinofili

Neutrofilni granulociti

Neutrofilni granulociti su diferentovane ćelije koje imaju relativno kratak poluživot i brojne receptore na membrani koji im omogućavaju odgovor na inflamatorne i fagocitne stimuluse. U citoplazmi ovih ćelijama su vrlo zastupljene granule koje sadrže faktore koji učestvuju u inflamaciji, odgovoru na infekciju i reparaciji tkiva.

Najbrojniji su od svih leukocita (60%). Ukupan pul neutrofila u cirkulaciji uključuje sve neutrofile u vaskularnom prostoru, od kojih su neki slobodni u cirkulaciji (cirkulatorni pul), a drugi se "kotrljaju" duž endotela malih krvnih sudova (marginalni pul) i ćelije se slobodno razmenjuju između ova dva pula. Neutrofili mogu preći iz marginalnog u cirkulišući pul usled fizičke aktivnosti, delovanja adrenalina ili stresa. Na koncentraciju neutrofila u cirkulaciji utiču životna dob, aktivnost, genetski i faktori sredine.

Neutropenija označava snižen ukupan broj neutrofila. Kod dece uzrasta 1 mesec -10 godina, neutropenija označava broj neutrofila u krvi niži od 1,5 x 10^9 /L. Kod osoba starijih od 10 godina, neutropenijom se smatra broj neutrofila niži od 1,8 x 10^9 /L. Treba napomenuti da postoji razlika u srednjem broju neutrofila između određenih rasnih i etničkih grupa, ali te razlike nemaju uticaja na opšte zdravstveno stanje.

Ozbiljna neutropenija je predisponirajući činilac za razvoj infekcije. Do neutropenije mogu dovesti poremećaji u nastanku neutrofila (urođeni ili stečeni) kao i činioci koji utiču na obrt i životni vek neutrofila - imunski mehanizmi, lekovi, infektivni agensi (Epstain-Barr i virusi hepatitisa, HIV, Rickettsia i Bartonella, ozbiljne infekcije Gram-negativnim bakterijama)

Neutrofilija označava povećan ukupan broj neutrofila. Na rođenju prosečni broj neutrofila u cirkulaciji je 12 x 109 /L i vrednosti od čak 26 x 10^9 /L se smatraju normalnim. Kod dece starije od mesec dana i kod odraslih neutrofilijom se smatra broj veći od 7,5 x 10^9 /L.

Do pojave neutrofilije može doći usled povećanog nastajanja ćelija, ubrzanog oslobađanja ćelija iz kostne srži u cirkulaciju, pomeranja ćelija iz marginalnog u cirkulišući pul, smanjenog prelaska neutrofila u tkiva kao i kombinacije navedenih mehanizama.

Kod zdravih osoba broj neutrofila pokazuje dnevnu varijabilnost tako da je najveći broj neutrofila u cirkulaciji u popodnevnim časovima, kao i nakon obroka, fizičkog vežbanja, u uspravnom stavu i kao posledica emocionalnih stimulusa; međutim, ove promene nisu dovoljno izražene da bi mogle da uzrokuju neutrofiliju.

Pseudoneutrofilija (demarginacija) se može javiti usled intenzivnog vežbanja ili akutnog fizičkog ili emocionalnog stresa, kada se broj neutrofila u cirkulaciji može povećati unutar nekoliko minuta, usled oslobađanja neutrofila iz slezine i redistribucije unutar vaskularnog korita, i obično je praćena porastom broja limfocita i monocita, čime se može razlikovati od neutrofilije u odgovoru na infekciju, hronični stres ili primenu glukokortokoida. Međutim, mnogo češće se neutrofilija javlja u različitim oboljenjima ili patološkim stanjima:

Pošto je broj bazofila u krvi veoma nizak, teško je zapaziti snižen broj ovih ćelija u perifernoj krvi. Povišen broj se može javiti kod imunskih (stanja preosetljivosti) i inflamatornih poremećaja ali i kod hroničnih mijeloproliferativnih oboljenja.

***Pitanje: Povišen broj eozinofila u perifernoj krvi najčešće ukazuje na? Odgovori: infekciju virusima, bakterijsku infekciju, autoimunski proces, prisustvo alergije ili infekciju parazitima

Limfociti su populacija ćelija koja se razlikuje od ostalih ćelija bele krvne loze po svojoj karakterističnoj morfologiji – jedro zauzima najveći deo ćelije a citoplazma je oskudna, bez vidljivih granula. Zreli limfociti se mogu podeliti u više tipova (T i B limfociti i NK ćelije) i podtipova. Limfociti čine 20-45% svih leukocita i imaju izuzetno važnu ulogu u specifičnom odgovoru imunskog sistema na antigene (strane proteine ili delove ćelija).

Povećanje apsolutnog broja limfocita preko 4 x 10^9 /L se naziva limfocitoza. Limfocitoza može biti primarna i sekundarna. Primarna limfocitoza je posledica poremećaja limfocitne populacije koja se prekomerno umnožava tako da u ovim slučajevima najčešće imamo monoklonsku limfocitozu. Ova stanja zovemo limfoproliferativnim oboljenjima i najčešće su posledica neoplastične akumulacije monoklonskih B ćelija, T ćelija ili NK ćelija. Sekundarna (reaktivna) nastaje sekundarno, kao rezultat fiziološkog ili patofiziološkog odgovora na infekciju, delovanje toksina, stimulaciju citokinima ili usled delovanja nekih drugih činilaca. Neki od uzroka sekundarne limfocitoze mogu biti:  infektivna mononukleoza (najčešće usled infekcije Epstein-Barr virusom)  akutna virusna infekcija  limfocitoza usled infekcije koju je uzrokovala Bordetella pertussis  limfocitoza NK ćelija  limfocitoza usled akutnog stresa (npr. trauma, hirurška intervencija, akutna srčana insuficijencija, septički šok, infarkt miokarda, hemolitička kriza kod anemije srpastih ćelija, status epileptikus itd.)  reakcije preosetljivosti  perzistentna limfocitoza (subakutna ili hronična) usled niza hroničnih stanja (npr. posle splenektomije, usled maligne bolesti, hroničnih infekcija, pušenja itd.) Limfocitopeniju karakteriše ukupan broj limfocita manji od 1,0 x 10^9 /L. Kako su T ćelije najzastupljeniji limfociti u perifernoj krvi (oko 80%) a skoro dve trećine T limfocita čine CD4+^ (pomažući) T limfociti, kod većine pacijenata sa limfocitopenijom se radi o smanjenju apsolutnog broja T limfocita, posebno CD4+^ T limfocita. Prosečan broj T limfocita kod zdrave odrasle osobe se nalazi u opsegu 1,0 do 2,3 x 10^9 /L. Srednji broj CD4+^ T limfocita je je u opsegu 0,72 do 1,4 x 10^9 /L. Srednji broj ćelija druge velike podrgupe T limfocita, CD8+, je u opsegu 0,38 do 0,97 x 10^9 /L.

Uzroci limfocitopenije mogu biti urođeni i stečeni. Kod urođenih, najčešće se radi o naslednom bolestima (nasledne imunodeficijencije, uobičajene varijabilne imunodeficijencije, limfopenije usled polimorfizama, itd) dok uzroci stečenih limfocitopenija mogu biti:  aplastična anemija  infektivne bolesti (virusne: HIV, SARS, encefalitis virusa zapadnog Nila, hepatitis, grip, HSV, virus morbila; bakterijske: tuberkuloza, tifus, pneumonija, sepsa; parazitske; akutna faza malarijske infekcije)  jatrogeni (terapije imunosupresivima, glukokortikoidima i dr, hemioterapija, jonizujuće zračenje, velike hirurške intervencije, transplantacije, dijaliza itd.)  udružene sistemske bolesti (autoimunske bolesti, Hodgkin -ova bolest, maligne bolesti, opekotine, bubrežna insuficijencija, itd)  nutritivni (zloupotreba alkohola, deficit Zn)  idiopatski (npr. idiopatska CD4+^ T limfocitopenija)

Monociti

Monociti su okrugle ćelijem sa veliki jedrom, naboranom membranom i retkim granulama u citoplazmi koje sadrže brojne enzime uključujući esteraze. Monociti spadaju u fagocite, i imaju važnu ulogu u zaštiti od različitih infekcija, kao što su tuberkuloza, lajšmanijoza, tifusna groznica, sistemske mikoze i druge.

Za razliku od neutrofilnih granulocita, koji imaju oskudan biosintetski kapacitet monociti, i iz njih izvedeni makrofagi, imaju značajnu sposobnost za sintezu makromolekula kao odgovor na signale koje dobijaju iz okolnog tkiva. Antimikrobni mehanizam delovanja monocita i makrofaga je posredovan pre svega (ali ne isključivo) različitim oksidansima koja nastaju delovanjem sistema NADPH-oksidaze i/ili inducibilne sintaze azotnog oksida.

Monociti iz periferne krvi prelaze u tkiva, gde se transformišu (sazrevaju) u makrofage. U prve dve nedelje života, prosečan apsolutni broj monocita je približno 1 x 10^9 /L. Zatim se broj monocita polako smanjuje do prosečno 0,4 x 10^9 /L kod odraslih, kada monociti čine 1 do 9 % leukocita u perifernoj krvi. Kod muškaraca je broj monocita nešto veći nego kod žena.

Monocitoza , porast u apsolutnom broju monocita iznad 0,8 x 10^9 /L, se može javiti kod pacijenata koji boluju od malignih bolesti krvi ili limfoproliferativnih oboljenja, ali i kod nekih drugih stanja, kao što su stanje posle splenektomije, zapaljenska i oboljenja imunskog sistema, zapaljenske bolesti creva, ne-hematološke maligne bolesti, hronične infekcije kao što su infekcije nekim virusima, bakterijski endokarditis, tuberkuloza, i bruceloza, teške opekotine, depresija, infarkt miokarda, porođaj, izuzetni fizički napori (trčanje maratona) itd. Posebno treba obratiti pažnju ukoliko je broj monocita u perifernoj krvi > 1,5 x10^9 /L.

Monocitopenija kao izolovan klinički nalaz je vrlo retka, i obično je bez kliničkog značaja. Javlja se u sklopu pancitopenije kod aplastične anemije, kod primene hemio- i imunosupresivne terapije

***Pitanje: Koja od navedenih infekcija će biti praćena limfocitozom? Odgovori: bakterijska, parazitarna, gljivična, virusna

Trombociti su delovi citoplazme megakariocita koji imaju ulogu da prijanjaju uz zid oštećenog krvnog suda, lepe se jedni za druge, i da pospešuju stvaranje trombina. Time doprinose hemostazi, formiranjem trombocitnog čepa, a zatim ojačavanjem čepa dejstvom trombina koji prevodi fibrinogen u fibrinske niti.

Trombocitoza predstavlja povišen broj trombocita u krvi > 500 x 10^9 /L a gornja granica referentnog intervala za broj trombocita se obično kreće između 350 - 450 x 10^9 /L. Trombocitoza najčešće nastaje u sklopu mijeloproliferativnih oboljenja, usled mutacije u genu za trombopoetin (porodična) i sekundarno kod niza akutnih ili hroničnih stanja.

Trombocitopenija je stanje kada je broj trombocita niži od 150 x 10^9 /L. Uzroci trombocitopenije su brojni, ali se mogu grupisati zavisno od distribucije trombocita. Pad broja trombocita u perifernoj krvi može biti uzrokovan njihovom povećanom razgradnjom na periferiji (usled imunskih ili drugih mehanizama), smanjenom produkcijom trombocita usled urođenog (dominantnog ili autozomno recesivnog) ili stečenog poremećaja kostne srži (infiltracija kostne srži, virusne infekcije, radio i hemioterapija, deficit vitamina B12 i folata, paroksizmalna noćna hemoglobinurija, aplastična anemija, mijelodisplastični sindromi itd); zadržavanjem trombocita u slezini (splenomegalija, hipersplenizam); tokom primene nekih lekova.

Postoje i imunski posredovane trombocitopenije (autoimunska trombocitopenijska purpura, idiopatske, sekundarne usled infekcija, trudnoće, limfoproliferativnih oboljenja, posle transfuzije itd)kao i ne-imunske trobocitopenije (trombotične mikroangiopatije, trombotička trompocitopenijska purpura, hemolitičko- uremijski sindrom itd.).