TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO I CURSO 2011-12
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
Absorción UV-Visible
1.- A280 = 0.13 = E 0.1%, 280, 1 cm x C (mg/mL) x l (cm)
E 0.1%, 280, 1 cm = 0.75 C = 0.173 mg/mL
M = 60000 Da C = 2.89 x 10-6 M = 2.89 M
2.- 280 = 25000 M-1cm-1 M = 23000
E 0.1%, 280, 1 cm = 1.087
3.- C = 1.8 nmol Lys/50 L = 36 nmol Lys/mL = 36/15 nmol proteína/mL = 2.4 x 10-6 M
A280 = 0.344 = 280 x C (M) x l (cm) = 280 x 2.4 x 10-6 x 1 280 = 0.143 x 106 M-1cm-1
4.- C = 2.940/20 mg/mL = 0.147 mg/mL = 0.147/48000 M = 3.0625 x 10-6 M
A280 = 0.437 = 280 x C x l = 280 x 3.0625 x 10-6 M x 1 280 = 0.143 x 106 M-1cm-1
A280 = 0.437 = E(0.1%, 280 nm, 1 cm) x C x l = E(0.1%, 280 nm, 1 cm) x 0.147 mg/mL x 1
E(0.1%, 280 nm, 1 cm) = 2.973
A280 = 0.233 = E(0.1%, 280 nm, 1 cm) x C x l = 2.973 x C x 1 C = 0.78 mg/mL
5.- Al representar los valores de absorbancia a 295
nm vs. pH se obtiene la gráfica adjunta. En ella
parece apreciarse que hay dos poblaciones de Tyr.
La primera tendría un pK de alrededor de 10, y
representaría cerca del 60% de las Tyr tituladas,
mientras que la segunda lo tendría alrededor de 11.5.
El valor final de A295 es 0.345, y se puede utilizar
para calcular el número total de Tyr tituladas:
A295 = 295 x C x l = 0.345 = 1500 (M-1cm-1)x C x 1
C = 2.3 x 10-4 M (Tyr tituladas)
Cproteína = 5 x 3.0625 x 10-6 M = 0.153125 x 10-4 M
nº Tyr = 2.3 x 10-4/0.153125 x 10-4 = 15
nº Total de Tyr tituladas = 15
6.- CTrp = (A288/3103)-(A280/10318) = 0.288/3103 – 0.894/10318 = 9.28 x 10-5 -8.66 x 10-5 M
CTrp = 0.62 x 10-5 M Cproteína = 0.3/48000 = 6.25 x 10-6 M nº Trp = 1
CTyr/CTrp = (0.592 A294.4 - 0.263 A280.0)/ (0.263 A280.0 - 0.170 A294.4) = (0.592 x 0.313 - 0.263 x 0.234)/
(0.263 x 0.234 – 0.170 x 0.313) = (0.1853 – 0.0615)/(0.0615 – 0.0532) = 0.1238/0.0083 = 14.9
valor que era el esperado, pues la proteína tendría un total de 15 Tyr
7.- En la gráfica se aprecia el momento en el que se
añade la disolución de enzima y se agita la mezcla.
El valor inicial de A340 es 0.440.
A340 = 0.440 = 340 x C x l = 6200 x C x 1
C= 7.097 x 10-5 M
A340/min = 0.192 (en tramo lineal)
A340/min = 0.192 = 340 x C/min x l
C/min = 0.192/6200 = 3.097 x 10-5 M/min
Vensayo = 2.001 mL
6.197 x 10-2 mol/min transformados
6.197 x 10-2 UI/1 L ~ 61.97 UI/mL
C = 0.01 mg/mL
Actividad específica = 61.97/0.01 = 6197 UI/mg
pH
8 9 10 11 12 13
A295
0,0
0,1
0,2
0,3
t (segundo)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
A
340
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
