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Información y practica sobre el SDS-PAGE
Tipo: Resúmenes
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Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato. Ingeniería Farmacéutica 6FM Biotecnología Farmacéutica Práctica 7: Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) Equipo 1: Fonseca Moncayo Claudia Jacqueline García García Ingrid Cassandra Lara Romero Aylin Marisol Márquez Padilla Aranza
1. Junto con tus compañeros realiza los cálculos para preparar las siguientes soluciones, según el volumen que se indica, describe su preparación: Solución a preparar Equipo Cantidad Acrilamida-bisacrilamida al 30% Eq. 1 30 ml Dodecil sulfato de sodio (SDS al 10% p/v) Eq. 2 20 ml Persulfato de Amonio (PSA al 10% p/v) Eq. 3 10 ml Azul bromofenol 1% Eq. 4 1 ml TRIS-HCl 1.5 M (pH 8.8) Eq. 1 50 ml TRIS-HCl 0.5 M (pH 6.8) Eq. 2 50 ml Buffer de carga 2X (Tris-HCl 0.125M pH 6.8, SDS 4%, Glicerol 12%, β-mercaptoetanol 20%, Azul de bromofenol, 0.01%) Eq. 3 10 ml Buffer de corrida (Tris-HCl 25 mM pH 8.8, Glicina 192 mM, SDS 0.1%, H 2 O destilada) Eq. 4 1000 ml Solución de tinción (Azul de Coomassie R-250 0.125 %, Metanol 50.0%, Ácido acético 10.0%) Eq. 1 50 ml Solución Desteñidora I (Metanol 50.0%, Ácido acético 10.0%) Eq. 2 50 ml Solución Desteñidora II (Metanol 5 %, Ácido acético 7 %) Eq. 3 50 ml a) Acrilamida-bisacrilamida al 30%, 30 ml Materiales ❖ Tubo Falcon de 50 mL ❖ Acrilamida-bisacrilamida ❖ Agua destilada Metodología En un tubo Falcon de 50 ml agregar 9 ml de una mezcla de 37.5: acrilamida-bisacrilamida y después se afora con agua destilada. Cálculos. % 𝑣 𝑣 =^ 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥
Cálculos. % = (^) (𝑔 (^) 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜/𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) * 100 1% = 𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 ( /𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) * 100 𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
e) TRIS-HCl 1.5 M (pH 8.8), 50 ml Materiales ❖ Tubo falcón de 50 ml. ❖ TRIS-HCl 1.5 M (pH 8.8) ❖ Piseta. ❖ Agua destilada. Metodología En un tubo falcón de 50 ml se agregan 9.0855 g de TRIS-HCl 1.5 M, se agrega un poco de agua destilada, se ajusta el pH y se afora. Cálculos 𝑀 = 𝑛 𝐿 𝑛 = 𝑀 * 𝐿 𝑛 = (1. 5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 )(0. 05 𝐿) = 0. 075 𝑚𝑜𝑙 𝑛 = 𝑔 𝑃𝑀 𝑔 = 𝑛 * 𝑃𝑀 𝑔 = (0. 075 𝑚𝑜𝑙)(121. 14 𝑔 𝑚𝑜𝑙 ) 𝑔 = 9. 0855 𝑔 f) TRIS-HCl 0.5 M (pH 6.8), 50 ml Materiales. ❖ Tubo falcón de 50 ml. ❖ TRIS-HCl 0.5 M (pH 6.8) ❖ Piseta. ❖ Agua destilada. Metodología. En un tubo falcón de 50 ml se agregan 3.939 g de TRIS-HCl 0.5 M, se agrega un poco de agua destilada, se ajusta el pH y se afora.
Cálculos. 𝑀 = 𝑚 𝑉 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = 0. 5 𝑀(0. 005 𝐿) = 0. 025 𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑅𝐼𝑆 − 𝐻𝐶𝑙 𝑚𝑎𝑠𝑎 = 0. 025 𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑅𝐼𝑆 − 𝐻𝐶𝑙) 157.56 𝑔 𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑅𝐼𝑆−𝐻𝐶𝑙)
g) Buffer de carga 2X (Tris-HCl 0.125M pH 6.8, SDS 4%, Glicerol 12%, β-mercaptoetanol 20%, Azul de bromofenol, 0.01%), 10 ml Materiales. ❖ Tris-HCl. ❖ SDS. ❖ Glicerol ❖ β −mercaptoetanol. ❖ Azul de bromofenol ❖ Agua destilada ❖ Piseta. ❖ Tubo falcón 10 mL. Metodología. En un tubo falcon de 10 mL agregar 0.4 mL de SDS, 1.2 mL de glicerol, 2 mL de β − mercaptoetanol y 0.01 mL de azul de bromofenol, mezclar y aforar con agua destilada. Cálculos. ❏ SDS 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = (4%)(10 𝑚𝐿) 100 = 0. 4 𝑚𝐿 ❏ Glicerol 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = (12%)(10 𝑚𝐿) 100 = 1. 2 𝑚𝐿 ❏ β −mercaptoetanol 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = (20%)(10 𝑚𝐿) 100 = 2 𝑚𝐿 ❏ Azul de bromofenol 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = (0.01%)(10 𝑚𝐿) 100 = 0. 001 𝑚𝐿 h) Buffer de corrida (Tris-HCl 25 mM pH 8.8, Glicina 192 mM, SDS 0.1%, H2O destilada), 1000 ml Materiales.
% 𝑚 𝑉 =^ 𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = % 𝑉/𝑉(𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) 100 𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = % 𝑃/𝑉(𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) 100 ❏ Azul de Coomassie
(0.125%)(50 𝑚𝐿)
❏ Metanol
(50%)(50 𝑚𝐿)
❏ Ácido acético
(10%)(50𝑚𝐿)
❏ Agua destilada
10% á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜
k) Solución Desteñidora II (Metanol 5 %, Ácido acético 7 %, 50 ml Materiales. ❖ Matraz aforado de 50 ml. ❖ Metanol. ❖ Ácido acético. ❖ agua destilada Metodología. En el matraz aforado añadir 5 ml de ácido acético, posteriormente añadir 5 ml de etanol y aforar con agua destilada a 50 mL.
Cálculos.
10% Á𝑐. 𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜
2. Ahora ve al simulador: http://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm Lee las instrucciones, realiza varias corridas con el simulador: A. ¿Qué efecto tiene el voltaje en la velocidad de corrida? El efecto que provoca el tener un mayor voltaje es el tener una mayor velocidad en la corrida, mientras que por el contrario si se tiene un voltaje bajo la velocidad de la corrida también será bajo. En otras palabras, la velocidad de la corrida es proporcional a el voltaje utilizado en dicha corrida. B. Selecciona 4 muestras problema, y corre el gel seleccionando todas las proteínas del marcador de peso molecular, con un % de acrilamida bajo y otro más alto. ¿Qué diferencias observas en la corrida? Añade a tu reporte las 8 corridas, ubica la proteína problema y ubica las proteínas del marcador con sus pesos moleculares en kDa. Tabla 1. Parámetros para la muestra problema 1 Parámetros Cubeta de electroforesis Peso molecular de proteína (kDa)
experimental de 48.568 kDa. La movilidad relativa para un bajo porcentaje de acrilamida es
Tabla 2. Parámetros para la muestra problema 6 Parámetros Cubeta de electroforesis Peso molecular de proteína (kDa) Al realizar la corrida para la muestra problema 6 con diferentes porcentajes de acrilamida, se observa que la muestra problema obtenida es la Piruvato-cinasa, la cual en teoría debería de tener los siguientes datos:
Fig. 2. Datos de la proteína 6 Al correr la muestra con un porcentaje bajo de acrilamida (7.5%), el peso molecular de manera experimental es de 55.754 kDa, mientras que el teórico es de 56.773 kDa. Mientras que al correr la muestra con un alto porcentaje de acrilamida (15%) se obtuvo un peso experimental de 47.491 kDa. La movilidad relativa para un bajo porcentaje de acrilamida es
Tabla 3. Parámetros para la muestra problema 8 Parámetros Cubeta de electroforesis Peso molecular de proteína (kDa)
Tabla 4. Parámetros para la muestra problema 10 Parámetros Cubeta de electroforesis Peso molecular de proteína (kDa) En este caso al realizar la corrida con diferentes porcentajes de acrilamida, se observa que al tener la proteína Ribonucleasa H como muestra problema, la cual en teoría debería de tener los siguientes datos:
Fig.4 .. Datos de la proteína # Al realizar la corrida con un porcentaje bajo de acrilamida (7.5%), de forma experimental se obtuvo un peso molecular muy similar al teórico ya que se obtuvo un peso igual a 16. kDa, mientras que para la corrida con un alto porcentaje de acrilamida (15%) se obtuvo un peso experimental de 13.904 kDa. También cabe mencionar que se obtuvo una movilidad
Microarreglos
3. Recorre el simulador: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ A. En la parte experimental, enlista los materiales, reactivos y equipos utilizados. Haz un diagrama de flujo de la metodología que seguiste. Tabla 5. Materiales, equipos y reactivos Materiales Equipos Reactivos Bisturí Microcentrífuga Solución buffer Pipetas Vórtex Columnas con perlas de oligo-dT Micropipetas Escáner y estación de trabajo de los microarreglos Solución de solvente Puntas de micropipetas Mezcla de etiquetado (verde y rojo) Tubos eppendorf Solución de lavado de microarreglos Tejido sano y con melanoma
El apareamiento de bases entre las moléculas de ADN se ve afectado por condiciones químicas como la concentración de sal y el pH. Las condiciones químicas de este tampón no permiten la hibridación, por lo que el ARNm se separa de las perlas de poli-T. A continuación, haremos una copia del ADN del ARN. Mientras hacemos eso, le daremos algo de color al ADN. Agregaremos un poco de mezcla de lavado a nuestras dos muestras de ARN. Usaremos una mezcla de etiquetado verde para el ARN de células sanas. Para el ARN de las células cancerosas, usaremos una mezcla de etiquetado que contiene un tinte rojo fluorescente. D. De acuerdo al simulador ¿para qué se sintetiza un cDNA? ¿A quién corresponden los puntos verdes de la imagen final? ¿A quién los puntos rojos? ¿Por qué tenemos que hacer una copia de cDNA? ¿Por qué no usar simplemente ARNm? Cuando hacemos una copia de ADNc de nuestro ARNm, incorporamos una etiqueta fluorescente en nuestra molécula de ADNc. Esta etiqueta nos permitirá visualizar el cDNA más adelante. Además, el ADN es mucho más estable que el ARN. El escáner de microarreglos puede fusionar la imagen roja con la imagen verde y mostrar la imagen compuesta. aquí están las manchas rojas y verdes, fusionadas. Cualquier mancha que contenga ADNc rojo y verde se muestra en amarillo. Una mancha amarilla contiene un gen que se hibrida con ADNc verde y rojo, lo que significa que ese gen se expresó tanto en células cancerosas como en células sanas. Los genes que aparecen como manchas amarillas probablemente no sean muy interesantes para nosotros, ya que su actividad no es casual cuando la célula se vuelve cancerosa. ¡Pero mira todas las manchas rojas y todas las manchas geniales! Las manchas rojas muestran genes que producen más ARNm en las células cancerosas que en las células sanas; están "detectados" en el cáncer. Las manchas verdes muestran genes cuya expresión está "disminuida" en las células cancerosas.
4. SDS PAGE Acude al sitio: https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:227cccb5:lx_simulation: A. Lee el protocolo y contesta las preguntas que el simulador hace acerca de controles positivos y negativos. Elabora tu predicción del gel de proteína. Toma un pantallazo de tus respuestas y la predicción.
Fig. 5. Predicciones del gel de proteína B. Recorre el simulador. ¿Cuáles son las muestras que se usan para obtener proteína? ¿Cuál es el control (+) y el negativo (-), y las muestras desconocidas? Consulta un método para extracción de proteínas a partir de un cultivo celular. ❖ Control positivo: Se utiliza CCR5 que es una línea celular de tipo salvaje. ❖ Control negativo: Está diseñado para no poder producir respuesta después del tratamiento, en este caso se usa celulas del pancreas C. ¿Qué sustancias/condiciones se usan para desnaturalizar proteínas? Consulta su fórmula química ¿Cuáles para darle carga a las proteínas? Busca dos marcadores de peso molecular de proteínas que muestran los pesos moleculares de las proteínas que contienen, añade su foto. El gel que se utilizó en la electroforesis para desnaturalizar las proteínas es el gel de poliacrilamida. La función del gel de poliacrilamida es separar las proteínas o los pequeños oligonucleótidos. Fórmula química de la poliacrilamida: (𝐶 3
5
𝑛
D. ¿A qué condiciones se corren los geles de SDS PAGE? ¿Cómo se tiñen los geles de SDS PAGE? Se corren en la cámara de electroforesis a 150 V durante una hora, se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las proteínas o los ácidos nucleicos. En el primer caso suelen ser colorantes orgánicos que interaccionan con las proteínas de forma poco selectiva, principalmente electrostática. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau. Para los ácidos nucleicos se usa el azul de metileno o, más frecuentemente, compuestos fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio (véase figura). Un compuesto intercalante es aquél que se introduce entre los pares de bases apilados del DNA. Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se espera a que esté se impregne y así el colorante se une a las moléculas separadas en el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se observa o cuantifica mediante densitometría. Fig.8. Tipos de tinción en los geles de SDS-Page. E. Contesta las últimas preguntas del simulador y adjunta tus respuestas.
Referencias ➔ Alda, F (2009). Ácidos nucleicos III: el ARN, estructura y función. Consultado en mayo 21, 2021. Sitio web: http://b-logia20.blogspot.mx/2009/12/acidos-nucleicos-iii-el-arn-estructura.html ➔ C Menor-Salván. (2019). SDS-PAGE: ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. consultado en mayo 21, 2021, de ChemEvol Sitio web: http://www3.uah.es/chemevol/index.php/sds-page-electroforesis-en-gel-de-poliacrila mida/ ➔ Qiagen. (2005). BioSprint DNA Plant Handbook. Consultado mayo 21, 2021. Sitio web: www.qiagen.com/hb/biosprintplantdnakit
