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RCFB, 20 20 , Vol. 3: 13 - 23 http://www.rcfb.uanl.mx
Evaluación y selección de modelo matemático a utilizar en la curva de
calibración para la validación de métodos bioanalíticos por cromatografía
de líquidos acoplada a espectrometría de masas tándem LC-MS/MS.
Christian Tadeo badillo-Castañedaa, Sandra Lucia Montoya-Eguíaa, Luis Ángel Contreras- Sáncheza, Lourdes Garza-Ocañasa, Marco Antonio Cedillo-Ramíreza Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Toxicología Palabras clave análisis mínimos cuadrados, modelo matemático, método bioanalítico, coeficiente de correlación, coeficiente de determinación *Autor de Correpondencia correo@christianbadillo .com Recibido 14 julio 2020 Aceptado 7 diciembre 2020 Resumen Objetivo: Evaluar las pruebas estadísticas utilizadas para la selección de un modelo matemático a utilizar en la selección de la curva de calibración de métodos bioanalíticos por LC-MS/MS. Resultados: Se procesaron curvas de calibración multi-analito (loratadina, tramadol, dexketoprofeno e ibuprofeno) en plasma humano por triplicado con diez niveles de diferentes de calibración cada una. La técnica de procesamiento de muestra fue precipitación de proteínas. Discusión: El parámetro, suma de cuadrados, fue el de mayor utilidad para la selección del modelo matemático, y los modelos con menor error de concentración calculada fueron los ponderados, en sus modelos tanto lineales como cuadráticos. Los coeficientes de correlación, y determinación no se relacionaron con los mejores modelos matemáticos. Conclusión: Para un método bioanalítico se debe considerar el modelo matemático con ponderación 1/x^2 y no es recomendable la utilización de los coeficientes de correlación o determinación como criterios de aceptación. Evaluation and selection of a mathematical model to be used in the calibration curve for the validation of bioanalytical methods by liquid chromatography coupled to LC-MS / MS tandem mass spectrometry.
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 Abstract Objective: Evaluate the statistical tests used to choose the mathematical model to be used in the selection of the calibration curve for bioanalytical methods by LC-MS / MS. Results: Multi-analyte calibration curves (loratadine, tramadol, dexketoprofen, and ibuprofen) were processed in triplicate with ten different calibration levels each. The technique used in the processing of the samples was protein precipitation. Discussion: The parameter, sum of squares, was the most useful for the selection of the mathematical model. Weighted models, both linear and quadratic, obtained the lowest calculated concentration error. No relationship was found between the correlation and determination coefficients and the best mathematical models obtained. Conclusion: For a bioanalytical method, the weighted mathematical model 1/x must be considered, nevertheless, it is not recommended to use the correlation and / or determination coefficients as acceptance criteria. Introducción La aplicación de los métodos bioanalíticos consiste en la determinación de la concentración de un analito en matriz biológica, para lo anterior, es necesario la validación del método analítico y el cumplimiento de los criterios de aceptación para garantizar que el método cumple con el propósito para el que fue diseñado. Uno de los parámetros de validación o criterios de desempeño es el modelo matemático de la curva de calibración con el cual se determina la concentración del analito en la matriz. Un error común en los procesos de calibración es el uso de los coeficientes de determinación o correlación como prueba de linealidad, negar la heterocedasticidad de los datos y la no selección de un factor adecuado de ponderación.^1 En los métodos analíticos de intervalos de trabajo estrechos, los datos experimental presentan una varianza constante (homocedasticidad), sin embargo, en los métodos bioanalíticos para estudios farmacocinéticos es requisito la cuantificación del 5% de la concentración máxima (Cmáx),2,3^ lo anterior conlleva a diseños de métodos con intervalos de concentraciones muy amplios, en los cuales la varianza de los datos no es constante, la mayor varianza presente a altas concentraciones influye más que la pequeña variación obtenida a niveles bajos de concentración, por lo tanto, la
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 1260 con una columna C18 (3.0 x 150 mm, 3.5 μm) a 3 0°C. La fase móvil consistió en acetonitrilo: formato de amonio (0.01M) a pH 3. (30/70 %v/v) aun flujo de 0.7 mL/min. El volumen de inyección fue de 6 microlitros con una temperatura en el automuestreador de 12°C. El tiempo total de análisis fue de 3.0 minutos. Para el análisis instrumental se utilizó un espectrómetro de masas en tándem marca Agilent Technologies modelo G6410B. Se utilizó una fuente de ionización por electrospray operada en modo de ionización positiva a 300°C, 11 L/min y 45 psi, El voltaje del capilar fue de 1200 V. Las condiciones adquisición para cada analito se muestran en la tabla 1. Tabla 1. Analito Ion precursor Ion producto Voltaje del fragmentad or Energía de colisión Loratadina 383.3 337.2 122 26 Tramadol 264.3 58.1 104 15 Dexketoprofen o
Ibuprofeno 224.3 161.1 66 14 Condiciones de adquisición en el espectrómetro de masas. Preparación de curvas de calibración. A partir de la sustancia de referencia se prepararon soluciones stock en metanol, y se procedió a preparar la curva de calibración en un pool de plasma humano compuesto por 18 plasmas individuales, al añadir el diluyente en ningún se excedió del 5% en apego a la norma oficial mexicana NOM- 177 - SSA1-2013. Las concentraciones fueron 0.65, 1.30, 2.60, 5.21, 10.42, 20.83, 41.67, 62.50, 83.33, 111. ng/mL para loratadina, 2.90, 5.80, 11.61, 23.21, 46.43, 92.86, 185.71, 371.43, 278.57, 371.43, 495.24 ng/mL para Tramadol, 44.64, 89.29, 178.57, 357.14, 714.29, 1,428.57, 2,857.14, 4,285.71, 5,714.29, 7,619.05 ng/mL para dexketoprofeno, 297.62, 595.24, 1,190.48, 2,380.95, 4,761.90, 9,523.81, 19,047.62, 28,571.43, 38,095.24, 50,793.65 ng/mL. Procesamiento de la muestra, El tratamiento de la muestra consistió en una precipitación de proteínas con 0.5 mL de acetonitrilo que se añadió a 0.1 mL plasma humano. El tubo fue agitado en vortex por 9 minutos y posteriormente centrifugado a 12,500 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue transferido a un vial de con inserto de fondo plano
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 para su inyección en el equipo cromatográfico. En la figura 1, se muestra un cromatograma representativo del método. Figura 1 Figura 1a Cromatograma del ion total para la inyección de una muestra. En ella se observa que el ibuprofeno es un analito con poca ionización. Figura 1b, cromatograma de monitoreo de reacción múltiple para cada uno de los analitos indicando ion precursor y ion producto. Análisis de datos y estadístico La adquisición de datos del sistema cromatográfico líquidos masas, se realizó con el programa MassHunter Adquisición B.09, para el análisis de los datos crudos se utilizó el programa MassHunter Quantitative Analysis 10.0. El análisis estadístico de los modelos matemáticos fue realizado con el paquete Minitab v19.0 y R 3.6.1. Para la evaluación de los modelos matemáticos se emplearon los criterios de aceptación de la NOM- 177 - SSA1-2013, la Guía de
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 Figura 2. Gráfica de la varianza de la respuesta a lo largo del intervalo de trabajo de la curva de calibración para los cuatro analitos: a) Loratadina, b) Tramadol, c) Dexketoprofeno, d) Ibuprofeno Los modelos con menor error fueron los modelos con ponderación 1/x^2 ya sea el modelo lineal, o el modelo cuadrático ver figura 3. Aunque es posible usar modelos cuadráticos en las curvas de calibración en métodos bioanalíticos, 9 -^11 desde el punto de vista regulatorio para estudios de biodisponibilidad o bioequivalencia las agencias los han desaconsejado en favor de los métodos lineales por ser más sencillos. 12 - 15 0 20, 40, 60, 0 20 40 60 80 100 120 Varianza para la respuesta (^2) σ del instrumento Concentración (ng/mL) 0 5,000, 10,000, 15,000, 0 100 200 300 400 500 600 Varianza para la respuesta (^2) σ del instrumento Concentración (ng/mL) 0 6, 12, 18, 0 10000 20000 30000 40000 50000 6000 Varianza para la respuesta (^2) σ del instrumento Concentración (ng/mL) 0 5,000, 10,000, 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Varianza para la respuesta (^2) σ del instrumento Concentración (ng/mL) (a) (b) (c) (^) (d)
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 Figura 3. Porcentaje de error promedio para nivel de la curva de calibración de los diferentes modelos matemáticos: a) Loratadina, b) Tramadol, c) Dexketoprofeno, d) Ibuprofeno; cuadradado sin relleno (modelo lineal sin ponderación) circulo sin relleno (modelo lineal con ponderación 1/x), rombo sin relleno (modelo con ponderación 1/x^2 ), triángulo sin relleno (modelo cuadrático sin ponderación), cuadrado con relleno (modelo cuadrático con ponderación 1/x^2 ). Con respecto a la falta de ajuste, el modelo de regresión exhibe falta de ajuste cuando no describe adecuadamente la relación funcional entre los factores experimentales y la variable de respuesta. La mayoría de los modelos presentaron buen ajuste, con excepción de ibuprofeno en su modelo lineal sin ponderar, o lineal ponderado 1/x y tramadol ponderado 1/x y 1/x^2. En el caso de los modelos cuadráticos tanto sin ponderar como ponderados no fue posible rechazar la falta de ajuste, por lo que se puede concluir que el modelo tiene un ajuste adecuado. En referencia a la suma de los cuadrados, medida que ayuda a expresa la variación atribuida a la relación entre la concentración del analito y la respuesta del instrumento, los modelos con ponderación 1/x^2 son los que expresaron menor suma de cuadrados, en contraste con los modelos sin ponderar que mostraron mayor suma de cuadrados. El modelo matemático con menor suma de cuadrados se relacionó con un mayor cumplimiento de criterios de aceptación de la curva de calibración mencionados en la NOM- 177 - SSA1-2013, por ejemplo, en los modelos con ponderación 1/x^2 , las tres curvas de calibración cumplieron el criterio de al menos el 75% de las
- 0 20 0 20 40 60 80 100 120 % de Error Concentración (ng/mL) -
- 0 10 20 0 100 200 300 400 500 600 % de Error Concentración (ng/mL)
- 10 30 50 70 90 110 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 % de Error Concentración (ng/mL)
50 250 450 650 850 1050 1250 0 10000 20000 30000 40000 50000 600 % de Error Concentración (ng/mL) (a) (b) (c) (d)
RCFB, 2020, Vol. 3:1 3 - 23 que los pesos determinen la contribución de cada observación a las estimaciones finales de los parámetros. Es importante tener en cuenta que el peso de cada observación se da en relación con los pesos de las otras observaciones; por lo que diferentes conjuntos de pesos absolutos pueden tener efectos idénticos. Los mínimos cuadrados ponderados son un método eficiente que hace buen uso de pequeños conjuntos de datos, la principal ventaja que disfrutan los mínimos cuadrados ponderados sobre otros métodos es la capacidad de manejar situaciones de regresión en las que los puntos de datos son de calidad variable. Si la desviación estándar de los errores aleatorios en los datos no es constante en todos los niveles de las variables explicativas, el uso de mínimos cuadrados ponderados en cada nivel de las variables explicativas produce las estimaciones de parámetros más precisas posibles. En este trabajo, los métodos con ponderación 1/x son los que presentaron menor error de concentración calculada, por lo que este tipo de modelos es gran utilidad en métodos analíticos de rango amplio. Con respecto a los coeficientes de correlación (r), y determinación (R^2 ), la NOM- 177 - SSA1-2013 no establece un criterio de aceptación para métodos bioanalíticos, como si lo hace para perfil de disolución donde el coeficiente de correlación debe ser mayor a 0.99. El mismo caso de no tener un criterio de aceptación para de la curva de calibración sucede en las guías de la FDA y la agencia europea del medicamento (EMA). En este trabajo no se observó una relación líneal entre los coeficientes de correlación y determinación con el criterio de aceptación porcentaje de error para cada punto de la curva de calibración (concentración adicionada vs concentración calculada)descritos en la NOM, por lo que un mayor valor de R^2 no indica un mayor cumplimiento de porcentaje de error, por lo anterior, debe desaconsejarse el utilizar estos criterios como prueba de bondad de ajuste para la selección de un modelo matemático. El criterio de información de Akaike corregido (AICc) ha sido sugerido como una utilidad para la selección de un modelo de calibración, en la comparación de modelos se prefiere el modelo con menor valor. En este trabajo sólo en algunos casos pudo comprobarse que un menor valor de AIC indicara un menor error en los errores de la curva de calibración, ver Tabla 2. 16 -^17 Conclusiones Los modelos matemáticos resultaron ser diferentes entre sí, los modelos que mejor describen la relación concentración respuesta para un método analítico y presentan menor error son los modelos con ponderación 1/x^2 , ya sea lineales o cuadráticos. Un menor valor de suma de cuadrados resultó ser la mejor herramienta para la selección de un modelo matemático.
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