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Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila
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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS
HALÓFILOS DE SUELOS SALINOS DE CUATRO CIÉNEGAS COAHUILA,
MÉXICO
Liliana Castro Piña 1 , Adriana Carolina Flores Gallegos^1 , Arturo Rodríguez Vidal^1 , Miguel Ángel Aguilar González^2 , Cristóbal Noé Aguilar González^1 , Raúl Rodríguez Herrera^1 *****
(^1) Departamento de Investigación en Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de
Coahuila. Blvd. V. Carranza e Ing. José Cárdenas V. s/n. Col. República Ote. C.P. 25280. Saltillo, Coahuila, México. Tel. +52(844)4161238, 4169213, Fax. 4390511. (^2) Departamento de Microscopía Electrónica y Propiedades Ópticas de Materiales, en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Saltillo, Ramos Arizpe, Coahuila, México. * Autor para correspondencia: [email protected]
RESUMEN
La región de Cuatro Ciénegas, Coahuila, se ha caracterizado poseer una amplia variabilidad genética de microorganismos endémicos y por su alto nivel de salinidad. A partir del agua de sus pozas se han aislado diferentes microorganismos halófilos con potencial biotecnológico. Sin embargo, los microorganismos presentes en los suelos salinos de dicha región han sido poco estudiados. En el presente trabajo se estudiaron 8 distintas muestras de suelo del Valle de Cuatro Ciénegas. Estas muestras de suelo se caracterizaron por su contenido de cloruro de sodio, humedad, materia orgánica y características texturales. Posteriormente, a partir de estas muestras de suelo se aislaron bacterias halófilas utilizando medios de cultivo con concentraciones altas de sales, además se determinaron las características bioquímicas, morfológicas y potencial biotecnológico de las cepas aisladas. Los suelos de las localidades El Mezquite 1 y 2 presentaron el mayor contenido de cloruro de sodio. Los medios de cultivo caldo nutritivo modificado, agar nutritivo modificado y HALO permitieron el aislamiento de bacterias halófilas, sin mostrar crecimiento de levaduras u hongos. La morfología bacteriana más común para los halófilos encontrados correspondió a bacilos y cocos. Las cepas aisladas en el presente estudio mostraron características metabólicas similares a las reportadas para el género Halomonas , el cual ha demostrado una gran versatilidad para crecer en distintos rangos de temperatura y pH, por lo que se utiliza en la degradación de materiales derivados de almidón. Con los resultados obtenidos en el presente trabajo, se puede establecer que las bacterias halófilas proveen oportunidades en el campo de la biotecnología al constituir una fuente potencial de enzimas de interés industrial con destacables propiedades para bio-remediación.
Palabras clave: Cuatro Ciénegas, suelos salinos, halófilos, enzimas.
INTRODUCCIÓN
La región del valle de Cuatro Ciénegas, ha sido declarada Área Nacional Protegida por el gobierno mexicano, un lugar internacional por RAMSAR y Patrimonio Mundial de Reservas de la Biósfera por la UNESCO (Stein et al ., 2000; Hendrickson et al ., 2008; Souza et al ., 2008). Esta región incluye pantanos, ríos y más de 300 lagos los cuales comparten una oligotrofia extrema y más de 70 especies endémicas de microorganismos, plantas y animales (Minkley, 1984; Badino et al ., 2004; Johnson, 2005; Carson y Dowling, 2006). Sorprendentemente, muchos de estos microorganismos se han encontrado por primera vez en este valle y la mayoría de las especies presentan diferencias a nivel del ARNr 16S así como en sus funciones metabólicas (Souza et al ., 2006; Escalante et al ., 2009; Cerritos et al ., 2008; Desnues et al ., 2008; Alcaraz et al. , 2008).
La elevada diversidad microbiana se debe a diversos factores ambientales, incluyendo la conservación geológica a través de los años (Taylor, 1966; Meyer, 1973; Minckley y Jackson, 2008; Szynkiewicza et al ., 2009), la heterogeneidad del terreno y los cambios de temporal (Escalante et al ., 2008) y, finalmente el conjunto de adaptaciones a las condiciones extremas de los lagos presentes (Souza et al ., 2008). Dentro de este último apartado esta la presencia de sal, específicamente cloruro de sodio (NaCl), el cual es uno de los factores que ha contribuido en esta diversidad microbiana. A pesar de que este compuesto es un inhibidor para el crecimiento de microorganismos, algunos de ellos han desarrollado diversos mecanismos de adaptación. Los microorganismos halófilos evolucionaron bajo condiciones que imperaban en la tierra primitiva: alta temperatura, salinidad y atmósfera
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anaerobia. Se encuentran en los ambientes hipersalinos, son capaces de reproducirse y realizar sus funciones metabólicas de una manera más eficaz en presencia de altas concentraciones de sales; tienen la capacidad de balancear su presión osmótica en relación con el medio y resistir los efectos nocivos de la sal (Meseguer, 2004). Los microoganismos que son capaces de crecer óptimamente en suelos que contienen del 15 al 25% de NaCl son considerados halófilos extremos, y como halófilos moderados aquellos que toleran desde un 3 hasta un 15% de NaCl (Grant et al ., 1998). Dentro de los halófilos extremos se encuentra principalmente a los de la familia Halobacteriaceae, aunque otros microorganismos también han sido descritos (Antón et al ., 2002). Los halófilos moderados son filogenéticamente diversos, incluyendo una gran variedad de microorganismos: algunos metagenómicos y un gran número de bacterias Gram positivas y negativas (Ventosa et al. , 1998).
Los halófilos son de interés debido a sus potenciales aplicaciones industriales (Grant et al ., 1998; Litchfield, 1998; Landis, 2001; Oren, 2002; Tehei et al ., 2002). Se espera que las proteínas producidas por estos microorganismos presenten características diferenciales de aquellas producidas por los organismos que habitan en ambientes no salinos, ya que las primeras deben mantener sus propiedades catalíticas en altas concentraciones de sal. Las proteasas son un grupo de enzimas con aplicaciones importantes en muchos procesos industriales (Rao et al ., 1998). Varias proteasas extracelulares se han identificado en halobacterias (Oren, 1994; Margesin y Schinner, 2001). Estas enzimas se caracterizan por ser dependientes de la alta concentración de sal para su actividad y estabilidad (Ventosa y Nieto, 1995). Entre ellas, una serina proteasa de Natrialba magadii ha sido profundamente caracterizada (Giménez et al ., 2000). Adicionalmente, las halobacterias tienen la capacidad de producir bacteriorodopsina, bioplásticos y enzimas, así como de degradar productos tóxicos (Ventosa et al ., 1998; Mellado y Ventosa, 2003).
Por otro lado, la producción de enzimas extracelulares por halófilos moderados no ha sido ampliamente investigada. Sin embargo, en los últimos años, se han hecho esfuerzos para explorar el potencial de este grupo versátil de bacterias halófilas. En este sentido, se han reportado una serie de enzimas extracelulares como proteasas, amilasas, DNasas, pululanasas y lipasas producidas por bacterias halófilas moderadas (Mellado et al ., 2004). Las bacterias halófilas moderadas también poseen algunas aplicaciones industriales, como son la biodegradación de residuos y la mejora de los procesos de extracción de petróleo (Ventosa y Nieto, 1995; Ventosa et al ., 1998; Margesin y Schinner, 2001). La mayoría de las especies endémicas reportadas en Cuatro Ciénegas están asociadas a los hábitats acuáticos en la cuenca y muy poco se ha estudiado la presencia de éstas en los suelos de dicha región. El objetivo del presente trabajo fue determinar las características edafológicas de ocho suelos salinos del Valle de Cuatro Ciénegas, así como aislar e identificar microorganismos halófilos y determinar su potencial biotecnológico en la industria de los alimentos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de muestreo y toma de muestra Para la selección de los sitios de muestreo se realizó una búsqueda cartográfica del Estado de Coahuila apoyándose en las cartas edafológicas del INEGI. De esta manera, se determinaron los sitios que estaban reportados con mayor presencia de sales en el Estado. Ocho regiones fueron seleccionadas, incluyendo: 1) Ranchería, San Buenaventura; 2) Acequia, Nadadores; 3) Huizachal, Nadadores; 4) Lamadrid, Lamadrid; 5) El Vergel, Lamadrid; 6) El Mezquite, Cuatro Ciénegas; 7) El mezquite 2, Cuatro Ciénegas; y 8) Las Playitas, Cuatro Ciénagas.
Cada uno de los ocho sitios muestreados se dividió en 10 cuadrantes con una superficie aproximada de 100m^2 por cuadrante. La muestra se tomó a una profundidad de 0-30 centímetros. Las muestras de cada sitio se mezclaron entre sí, para obtener a partir de esta muestra homogenizada, una muestra representativa del sitio. Se realizaron dos colectas en distintas épocas del año (marzo y octubre) en aquellos suelos en donde se encontró el mayor contenido de sales (Mezquite 1 y Mezquite 2), para determinar el efecto de las condiciones climatológicas en el contenido microbiano.
Textura de suelo Las muestras de suelo se dejaron secar en una manta a la luz solar por varios días hasta que no presentaran humedad. Después, se tamizó el suelo pasándolo progresivamente por los tamices número 30, 60, 80, 100, 120, 170 y 200. Las fracciones obtenidas se pesaron para determinar la textura con base en el triángulo de textura.
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paramétrico, utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Arbitrariamente se seleccionó el valor “1” para desarrollo de bacterias o levaduras y “2” para ausencia de crecimiento, dado que los datos generados eran cualitativos y no cuantitativos.
Obtención de cultivos puros, conservación e identificación de cepas Una vez desarrolladas las colonias en las cajas Petri, se registraron las características morfológicas de las colonias y se prepararon frotis a fin de realizar observaciones microscópicas. Con el propósito de conservar los cultivos obtenidos puros, estos se colocaron en tubos de ensaye y se les agregó 3 mL de suero salino comercial al 0.9 %, se taparon los tubos de ensaye con tapa de rosca y se refrigeraron.
Producción de metabolitos y enzimas La capacidad enzimática y/o producción de algún metabolito por parte de los microorganismos, se evaluó empleando diferentes medio de cultivo: 1) agar de hierro y lisina (LIA), 2) Movilidad-Indol-Ornitina (MIO), 3) Prueba del indol (SIM), 4) Agar de hierro y triple azúcar (TSI), 5) Citrato de Simmons, 6) Urea, y 7) Agar de hierro de Kligler.
Todos los medios se prepararon según las indicaciones de los fabricantes y se esterilizaron a 121º C/ 15lb/ 15 min. Se inocularon por punción con las colonias de los cultivos puros. Los medios se incubaron a 37 ºC por 24 a 72 h, observando cada 12 h. Adicionalmente, se determinó la presencia de oxidasa con el reactivo de B. D. Oxidase Reagent Droppers ® y la prueba de producción de catalasa.
Microscopía electrónica de morfología celular La morfología celular de los microorganismos aislados fue observada por medio de fotografías tomadas con un microscopio electrónico de barrido. Para ello, los microorganismos se conservaron en suero de hidróxido de sodio y se almacenaron en refrigeración. Las muestras refrigeradas se turnaron al Departamento de Microscopía Electrónica y Propiedades Ópticas de Materiales, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Saltillo, Ramos Arizpe, Coahuila, México, en donde se realizaron técnicas habituales de fijación, deshidratación, secado por punto crítico y recubrimiento en oro. Las fotografías de los microorganismos fueron tomadas con el microscopio electrónico de barrido Philips Ambiental Modelo XL30ESEM con sistema de espectrometría de energías dispersivas de rayos X (EDAX) modelo PEGASSUS de bajo vacío. Las muestras se recubrieron con oro electrolítico en una evaporadora de vacío marca Jeol, Modelo JEE-400 bajo las siguientes condiciones: distancia de trabajo: 10 mm, energía en KeV: 20 KeV y detector GSE (electrones secundarios).
Producción potencial de enzimas de uso industrial Para determinar la capacidad de producción de enzimas de uso industrial por parte de los microorganismos aislados del suelo, se preparó medio Czapek Dox modificado con las siguiente composición (g/L): NaNO 3 (7.65), KH 2 PO 4 (3.04), MgSO 4 (1.52), KCl (1.52), y fuente de carbono (almidón, ácido tánico, carboximetilcelulosa, inulina, pectina, peptona y sacarosa) (30.0). Una vez preparado el medio de cultivo con su respectiva fuente de carbono, se distribuyó en tubos de ensaye para su esterilización a 121 ºC/15lb / 15 min y se inoculó con cada uno de los cultivos microbianos puros, posteriormente los tubos fueron incubados a 37 ºC durante 72 h.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con base en los porcentajes obtenidos de arena, limo y arcilla para cada uno de los suelos muestreados (Cuadro 2), se estableció que presentan una textura arenosa, a excepción de la muestra de San Buenaventura, la cual presenta textura franco-arenosa. En lo que respecta a humedad, se observaron valores cercanos al 15% para El Mezquite y 10% para Las Playitas y Acequia. Estos datos pueden atribuirse a que anteriormente, El Mezquite era una poza de agua la cual con el tiempo fue secándose, reteniendo humedad en su interior, mientras Acequia y Las Playitas son zonas cercanas a estanques.
El mayor contenido de cloruro de sodio se encontró en los suelos Mezquite 1 y 2 (18.2 y 17.1 % respectivamente) seguidos por Las Playitas (16.4 %). Esto se puede deber a que, antiguamente, las tres localidades fueron pozas de agua, que con el tiempo se secaron permitiendo la acumulación de sales, principalmente de cloruro de sodio, lo que puede explicar el alto contenido de este compuesto en estos suelos en comparación con los demás sitios muestreados. Estos suelos, por lo tanto, constituyen una fuente potencial de microorganismos halófilos. Los suelos restantes presentaron un contenido de cloruro de sodio inferior al 10 %.
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Por otra parte, los sitios con mayor contenido de materia orgánica fueron Lamadrid (3.73 %), San Buenaventura (3.63 %), la Acequia (3.57) y El Mezquite 2 (3.23 %). A pesar del bajo contenido de humedad presente en Lamadrid, su alto porcentaje de materia orgánica podría estar dado por la adaptación de la vegetación de la zona a las condiciones presentes en el suelo y la descomposición de esta materia orgánica. Se sabe que la materia orgánica contribuye al crecimiento vegetal mediante sus efectos en las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo. Además, la materia orgánica reduce el impacto de la lluvia, y permite que el agua se filtre con suavidad en el suelo. Por lo tanto, reduce el escurrimiento superficial y aumentando el agua disponible para el desarrollo de la vegetación, aún en forma limitada en suelos arenosos), lo que impacta directamente en el tipo y concentración de especies microbianas que habitan este tipo de suelos (Tamhane y Motiramani, 1970).
Análisis comparativo El Mezquite 1 fue uno de los tres sitios con mayor contenido de cloruro de sodio y de mayor porcentaje de humedad. Sin embargo, presentó baja cantidad de materia orgánica, posiblemente debido a que la alta salinidad no permite el crecimiento de plantas o de algunos organismos superiores. En contraste, El Mezquite 2 mostró una mayor concentración de cloruro de sodio y se encuentra entre los tres sitios con más alto porcentaje de materia orgánica, aunque en por ciento de humedad ocupa el último lugar. Posiblemente las plantas presentes en esta área se han adaptado a los medios salinos para la supervivencia, influyendo positivamente en el contenido de materia orgánica. Por otra parte, en esta región los niveles de evaporación de agua podrían ser mayores, disminuyendo así el contenido de humedad y favoreciendo un alto contenido de cloruro de sodio. En contraste, no se observaron diferencias significativas en el muestreo 1 y 2 de los suelos Mezquite, por lo que la temporada del año resulta indistinta para el aislamiento de microorganismos halofilos.
Cuadro 2. Características de los ocho suelos muestreados en la zona Valle de Cuatro Ciénegas.
Localidad
Característica San Buenaventura
Acequia Huizachal Lamadrid El vergel El Mezquite 1 El Mezquite 2^ Las Playitas
Textura Arena franca
Arena Arena Arena Arena Arena Arena Arena
Humedad (%) 2.94 9.55 1.47 2.57 2.21 15.08 0.64 9. Materia orgánica (%)
NaCl (g) 8.40-^4 6.89-^4 6.89-^4 6.65-^4 5.95-^4 17.1-^4 18.2-^4 16.4-^4
Cuadro 3. Características fisco-químicas del suelo colectado en dos fechas diferentes en dos localidades El Mezquite 1 y El Mezquite 2.
Característica El Mezquite 1 El Mezquite 2 M1 M2 M1 M Cloruro de sodio (g) Humedad (%) Materia orgánica (%) Textura
17.1-^4
Arena
18.7-^4
Arena
18.2-^4
Arena
18.3-^4
Arena
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Cuadro 4. Características bioquímicas y morfológicas de las bacterias halófilas de suelos salinos.
Colonia Gram Morfología MIO LIA TSI Kliger SIM Citrato Urea Catalasa Oxidasa 2 + Bacilos esporulados
7 + Diplococos - - - - + - - - +
9 + Cocos - + - - - - - - -
10 + Bacilos en media luna
11 + Bacilos en cadena - - - - - - - - -
12 + Cocos - - - - - - - - -
13 + Triplococos - - - + - - - - -
14 + Triplococos - - - - - - - - -
15 + Bacilos cortos - - - - - - - - +
16 + Bacilos + - + - + - - - -
26 + Cocos + + - - - + - - -
27 + Cocos + + - - - - - - -
Cuadro 5. Características diferenciales de especies del género Halomonas
Característica H. elongata H. eurihalina H almeriensis H. halmophila H. salina H. halophila Morfología celular (^) Bacilos largos Bacilos cortos Bacilos cortos Bacilo Bacilos cortos Bacilo Rango NaCl (% p/v) (^0) - 25 3.5- 25 5 - 25 3 - 35 2 - 20 2 - 30 Oxidasa (^) - - - + + + Hidrólisis de urea (^) + + - - + + Producción de ácido a partir de: Glucosa (^) + - - + - + Lactosa (^) + - - + - - Sacarosa (^) + - - + - - Arahal et al. (2002), Mata et al. (2002), Garrity et al. (2005), Lim et al. (2005), Martínez-Checa et al. (2005) y Vreeland (2005)
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Figura 2. Morfología de las colonias mediante microscopio electrónico de barrido. a) colonia 7 (2 μm), b) colonia 10 (5 μm), c) colonia 2 (2 μm), d) colonia 11 (5 μm), e) colonia (5 μm) y f) colonia 9 (2 μm).
La morfología irregular, parecida a círculos ondulados, y la respuesta Gram de la colonia 7 (Figura 2a) es semejante a la de Halococcus morrhua, la cual puede presentarse en forma de coco, con diámetro de 0.8 y 2 μm, o en forma de bacilo con 0.3 y 1.2 μm de ancho y de 1 a 15 μm de largo. Puede ser móvil (flagelos polares) o inmóvil. Los bacilos son generalmente Gram negativo, mientras que los cocos pueden ser tanto Gram positivo como negativo. Se presentan en forma simple, pares, tétradas o racimos retráctiles irregulares. Halococcus morrhuae requiere de al menos 1.5 M de NaCl para crecer aunque su requerimiento óptimo es entre 2 y 4 N de NaCl. Esto ocurre de manera natural cuando las concentraciones de sal en el medio son altas, como en lagos salados, salinas, mares o suelos salinos (Holt et al. , 2004). Codina (2004) encontró bacterias cuadradas, parecidas a la colonia 10 (Figura 2b) aislada del suelo del Valle de Cuatro Ciénegas. La bacteria Haloquadratum walsbyi , descrita por este investigador, es de forma cuadrada y delgada, y vive en ambientes con elevadas concentraciones de sales.
En lo que respecta a la colonia 11 (Figura 2c), se observaron bastones unicelulares o bacilos Gram positivos. En estos microorganismos la división celular ocurre siempre por el plano ecuatorial, que forma un ángulo recto con el eje mayor de la célula. Las Halobacterias son células bastoniformes de aspecto similar a Escherichia coli. Su crecimiento ocurre en aguas muy saladas. Son aerobias y, por tanto, cuando disponen de sustratos apropiados y suficiente oxígeno, oxidan moléculas orgánicas produciendo ATP por fosforilación oxidativa (Grant et al. , 1998).
Las bacterias de la colonia 9 (Figura 2d) son unicelulares esféricas (o cocos) y aparentemente se dividen por un solo plano. Este modo de división celular da origen con frecuencia a la formación de cadenas cortas de células cocoides. Algunas bacterias con células esféricas se dividen regularmente por dos o tres planos sucesivos que forman ángulos rectos entre sí, dando lugar así a tétradas o a paquetes cúbicos de células. De algunas especies halófilas se conoce su genoma completo como, por ejemplo, Halobacterium salinarum la cual fue la primera aislada de medios salinos. Sin embargo, se conocen otros microorganismos halófilos con estructuras en formas de bacilos, cocos, unos rectangulares muy alargados pero no se conocen el nombre de ellos todavía. (Meseguer, 2004)
Producción potencial de enzimas de uso industrial Las bacterias aisladas y cultivada en medio Czapek con diferentes fuentes de carbono no presentaron crecimiento, lo cual indica que las bacterias encontradas no degradan ninguna de las fuentes de carbono utilizadas (amilasa, tanasa, carboxilmetilcelulosa, etc.) posiblemente debido a que las concentraciones de sal presentes en el medio Czapeck modificado no corresponden a las empleadas para su aislamiento, o bien porque no poseen la maquinaria enzimática para degradar estas fuentes de carbono.
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