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PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
1. Objetivos Aislar y purificar colonias en medios de cultivo sólidos. Conocer aislamiento los ymétodos purificación clásicos de másmicroorganismos utilizados para a la (^) partirsiembra, de diferentes muestras. Diferenciar características morfológicas macroscópicas de microorganismos según el medio de cultivo utilizado 2. Marco teórico 2.1. Aislamiento y purificación de microorganismos Los microorganismos están ampliamente distribuidos en distintos ambientes y la manera mas sencilla para demostrar su existencia en un ambiente determinado es por el método de siembra en medios nutritivos.
De otro lado, conociendo que los microorganismos en la naturaleza viven en mezclas, la determinación de las características de un microorganismo particular requiere de su aislamiento y purificación. El procedimiento general de aislamiento consiste en usar un medio de cultivo y condiciones de incubación que estimulen el crecimiento del organismo de interés y que reduzcan o afecten el crecimiento de otros organismos. Una vez que el organismo deseado ha aumentado en cantidad con respecto a otros, se purifica (Zapata, 2004). Para el aislamiento y purificación de microorganismos generalmente se recurre a diferentes métodos de siembra. 2.2. Métodos de siembra En microbiología sembrar o inocular corresponde a la acción de introducir artificialmente una muestra (inoculo) en un medio de crecimiento adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Una vez sembrado el medio se incuba bajo oscuridad, a una temperatura y/o condiciones ambientales adecuadas para el crecimiento (Santambrosio et al., 2009). Además del aislamiento y purificación, la siembra de microorganismos se realiza con el fin de activarlos, evaluar sus características bioquímicas, morfológicas (tanto a nivel celular como de colonia), realizar recuento de células viables y verificar la presencia de agentes patógenos o infecciosos en muestras, producir biomasa, entre otras. Existen diversos métodos de siembra, no obstante, la elección del indicado dependerá de dos factores (Gutiérrez et al., 2017):
La consistencia del medio de cultivo: líquido, semisólido, sólido (en placa o tubo) La finalidad de la siembra: aislar, purificar, hacer conteos, montaje de
antibiogramas, evaluación del metabolismo microbiano, incremento, entre otras.
2.1.1 Siembra en medio sólido: Cajas Petri: se puede realizar a nivel de superficie o en profundidad, en superficie se inocula (introducción de un microorganismo a un medio artificial) sobre el medio de cultivo sólido ya sea por estrías o diseminación. La métodos: francés, clásico o radial. siembra por estrías se puede realizar empleando los En el método francés se favorece el aislamiento de colonias (grupo de células con características similares, que actúan en conjunto) y la observación de las características de un cultivo microbiano, se emplea para la purificación de un microorganismo.
Figura 3. Siembra en estría: Método francés Los presencia métodos clásico y radial de microorganismos se utilizan con el fin de determinar laen una muestra dada, de realizarse parejo y continuo se puede lograr un buen aislamiento.
Elevación: la colonia puede ser muy fina (aplanada) o gruesas (elevadas), en este caso se presentan diferentes grados de convexidad o promiencia. Superficie: lisa, rugosa, mate, brillante Borde: dentado, rizoide. Tiene relación con la forma, puede ser liso o entero, ondulado, Consistencia: Cremosa, viscosa, granulada, esta característica requiere que la colonia sea tocada por medio de un asa. Características ópticas: las hay opacas, transparentes o translucidas.
Figura 3. Caracteristicas morfologicas de las colonias microbianas. Tomado de: Manual de practicas de laboratorio (n.d) 2.4. Recomendaciones para la manipulación de microorganismos En el laboratorio de microbiología todas las actividades deben ser realizadas de manera cuidadosa procurando impedir la contaminación de la zona de trabajo, de esta manera evitamos que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos, y que las muestras y cultivos se contaminen con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador. Principios fundamentales de la técnica aséptica (Gutiérrez et al., 2017): Limpiar el área de trabajo antes y después de la sesión de laboratorio con la solución desinfectante. Usar medios de cultivo y materiales estériles para las siembras Realizar solo las manipulaciones del material que se consideren necesarias. En trabajar siempre al lado de la flama del mechero. Está flama crea a su caso de no tener a disposición una cabina de flujo laminar, alrededor una atmósfera estéril y además se utilizará para esterilizar o flamear el material usado durante la siembra (asas bacteriológicas) Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y una vez esterilizadas microorganismos con objeto de no destruirlos con el calor. El asa se deben enfriarse antes de tomar la muestra de enfría sobre el agar o sobre el material de vidrio (en zonas estériles
del material de vidrio) Después de utilizar las asas se vuelven a esterilizar. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapados antes y después de la inoculación. 2.5. Manejo de residuos Todas las prácticas en las que se trabaja con microorganismos generan Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (R.P.B.I.), estos residuos son aquellos materiales generados que contengan agentes biológico-infecciosos o causar efectos sus productos nocivos a la salud y al ambiente. Los residuos peligrosos (como los cultivos de microorganismos) y que pueden biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físicos o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos. En el laboratorio de Microbiología se utilizará la esterilización por calor húmedo a 15 libras de presión, 121 °C por un periodo de 20 - 30 minutos y posterior disposición final en los sitios autorizados (Gutiérrez et al., 2017)
3. Materiales Insumos y equipos Mechero Asas Agujas de inoculación Vinipel Cajas petriTubos de ensayo Hisopos Gradillas Cabina de flujo laminar Incubador Reactivos
Cultivo microbiano ( Saccharomyces cerevisiae o Escherichia coli ) o aislados de diferentes ambientes. Agar nutritivo o plate countCaldo nutritivo Agar PDA, Sabouraud u Ogy Agar Chromocult, VRB o EMB Solución salina peptonada (8.5 peptona, 1000 mL de agua g de NaCl, 1g de destilada)
4. Procedimiento 4.1. Aislamiento de microorganismos desde superficies. - Solicite un tubo de ensayo con solución salina peptonada y un hisopo estéril. - Seleccione en el laboratorio de microbiología o por fuera de él, una superficie desde la que desee aislar o examinar la presencia de microorganismos. - Tome el hisopo y sumérjalo en el tubo de ensayo, en las paredes escurra el exceso de agua. - Frote con el hisopo húmedo la superficie elegida e inmediatamente después introdúzcalo en el tubo - Tape el tubo, si es necesario doble o corte el hisopo.
o un microorganismo ambiental. Tiempo de incubación de 24 a 48h.
- Coloque las cajas en forma invertida para evitar que el agua de condensación se deposite sobre el cultivo. 4.2.2.Método francés Tome la caja petri y por los bordes preferiblemente, rotule con su nombre, el nombre del microorganismo que va a inocular y la fecha en la que inoculará.Flamee el asa y tome una alícuota de la muestra a analizar. Colocar el inoculo en uno de los extremos de la caja de Petri con el medio de cultivo indicado. Extienda el cultivo haciendo cuatro o cinco estrías paralelas, sin romper el agar.Flamee de nuevo el asa, enfríela y sin tomar más muestra, haga cuatro o cinco estrías paralelas formando ángulo recto con las anteriores. Este paso se repite hasta cubrir toda el área de la caja. 4.3 Cultivo en agar inclinado Tome un tubo con medio estéril y rotule con su nombre, el nombre del microorganismo que va a inocular y la fecha. Con la mano derecha tome el asa bacteriológica y flamee. Sin soltarla, deje enfriar.Sostenga la caja Petri o tubo con el cultivo en la mano izquierda, remueva la tapa o tapón y sostenga de tal manera que no toque ninguna superficie. Si la muestra microbiana se encuentra en un tubo de ensayo flamee la boca del tubo.Retire con el asa de inoculación una porción de colonia desde el cultivo suministrado. Tome el tubo con medio estéril, destápe, flamee e inocule haciendo una estría o línea recta en la superficie del agar. Flamee la boca del tubo recién inoculado, tape y coloque en una gradilla. Antes de descartar el asa de inoculación, esterilice en el mechero. Incube a 37°C por 24 a 48 horas. 4.3. Cultivo en caldo nutritivo Rotule el tubo con su nombre, el nombre del microorganismo que va a inocular y la fecha. Retire con el asa de inoculación una porción de colonia desde el cultivo suministrado.Tome el tubo con medio estéril, destape, flamee e inocule mediante la inmersión del asa en el caldo. Flamee de nuevo la boca del tubo recién inoculado, tape y colóque en una gradilla. Incube microorganismo inoculado. por 24 – 48 horas a la temperatura indicada según el
4.4. Prueba de esterilidad del material y ambiente (grupo de trabajo) Tome (zonas aledañas a la cabina de flujo o en el salón grande), se una caja petri con agar nutritivo, abrir en el laboratorio etiqueta como “ambiente”. Abra otra caja con medio de cultivo durante 30 segundos en la cabina de flujo laminar y se etiquetar como “cámara”. Conserve una tercera caja sin abrir y etiquetar como “control”. través de esta caja se evaluará el procedimiento de manipulación A de los materiales, en caso de contaminación significara que hubo una preparación inadecuada de los medios.
5. Preguntas e interpretación de resultados ¿Qué es una colonia? ¿Por qué se debe trabajar cerca del mechero o en una cabina de bioseguridad? ¿En qué consiste el aislamiento de un microorganismo y cuál es su finalidad? ¿En qué consiste la purificación de un microorganismo y cuál es su finalidad? ¿Qué sucede si se toma una muestra o colonia microbiana con el asa caliente?Revice sus cultivos en medio sólido y los de otro compañero. Describa las caracteristicas de las colonias encontradas con base en la figura 3. En caso de no encontrar crecimiento discuta las posibles razones de esta ausencia. ¿En bacterias? qué difieren las colonias de un hongo respecto a las de las Con base en las diferencias morfologicas de las colonias ¿Cuántos tipos de hongos logró aislar y cuántas bacterias? Respecto a las muestras tomadas por sus compañeros ¿cual sería la superficie mas limpia y cual la mas contaminada?¿Qué observó en los diferentes controles (ambiental, cámara, control)? ¿Qué conclusiones se pueden sacar a partir de estos resultados? Consigne en la tabla 1 las diferencias encontradas en el crecimiento microbiano utilizadas. de acuerdo con las diferentes técnicas de siembra Tabla 1. Diferencias en el crecimiento microbiano a través de las diferentes técnicas de siembra TÉCNICA DE SIEMBRA
DIFERENCIAS OBSERVACIONES
“Siembra y recuento de microorganismo”. Recuperado de: https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/ biotecnologia/practicoIII.pdf Valencia Z.H. (2004). Manual de prácticas de microbiología. Universidad Nacional de Colombia.
