Cromosoma: Estructura, Replicación y Superenrollamiento del ADN, Apuntes de Biología

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BIOSÍNTESIS

DE MACROMOLECULAS

Y SU REGULACIÓN

TEMA 1.1: GENES Y CROMOSOMAS

• Gen: unidad de material genético que se halla dispuesta en un orden fijo a lo largo de un cromosoma, y que determina la aparición de los caracteres hereditarios en los seres vivos.
• Cromosoma: estructura altamente organizada formada principalmente por ADN y que contiene la mayor parte de la información genética de un individuo.
• Hipótesis gen-enzima (1948), Beadle y Tatum: Se basa en la idea de que cada uno de los genes que existen en el DNA codifica un enzima diferente y específica. No es cierta: lo que subyace a esta hipótesis es que cada gen codifica un producto funcional (puede codificar RNA u otro tipo de proteína). Experimento del moho: este moho crece en medios que contienen aminoácidos esenciales, un medio mínimo que tiene muy pocos nutrientes. Sin embargo, cuando le generan mutaciones, el moho ya no es capaz de crecer en ese medio mínimo (necesita más nutrientes). Explicación → las mutaciones afectaban a genes que daban lugar a enzimas.

1. TAMAÑO Y ESTRUCTURA DE LAS MOLÉCULAS DE ADN

• ADN vírico: Puede ser ADN o ARN (ARN pequeño, pero ADN de diferentes tamaños). Fuera de la célula es ADN circular pero dentro puede adquirir conformaciones distintas. En algunos casos, el ADN es más grande que la partícula vírica, como en Bacteriófagos T4.
• ADN bacteriano: Molécula de ADN muy grande. ADN cromosómico + ADN extra-cromosómico (ADN plasmídico). Los plásmidos no codifican ninguna proteína o RNA esencial para la bacteria, pero está involucrado en la resistencia a antibióticos. Es ADN circular.
• ADN eucariótico: Es más grande que las células procariotas. Hay ADN nuclear, pero también hay ADN en mitocondrias y cloroplastos. Este DNA no sigue el ciclo de replicación del ADN nuclear. La mayoría de proteínas necesarias para la mitocondria, se codifican en el núcleo. Estructura secundaria del ADN, formas estructurales:
• Forma A : Diámetro: 26 Å Longitud: 28 Å Temperaturas bajas.
• Forma B : Diámetro: 20 Å Longitud: 36 Å, 10,5 pb. La más habitual, descrita por Watson y Crick. Dextrógira, enrollada hacia la derecha.
• Forma Z : Diámetro: 18 Å Poco habitual. Levógira, enrollada hacia la izquierda.

TEMA 1.2: EL SUPERENROLLAMIENTO DEL ADN

Para que las moléculas de ADN quepan en el interior de las células, este tiene que superenrollarse. Cuando el DNA está relajado, se encuentra enrollado, la doble hélice gira sobre su propio eje. Cuando existe una tensión, la molécula tiende a superenrollarse para disminuir esa tensión. En un ADN circular cerrado, un ligero desenrollamiento provoca una tensión que puede producir el superenrollamiento. Desenrollamiento (se quita un giro) → 12 pb/giro (ADN tensionado). Dos soluciones para estabilizar la tensión:

• Separación de hebras (aprox. 10 bases). Menos habitual porque hay que romper los puentes de hidrógeno.
• Superenrollamiento del ADN. Hay enzimas específicas para desenrollar y generar tensión.

1. ÍNDICE DE ENLACE (LINKING NUMBER Lk)

El índice de enlace representa el número de veces que las dos hebras de una molécula de ADN circular se entrecruzan o se encadenan. Es una característica topológica del ADN circular. Aunque se deforme el ADN, no cambia el Lk, a no ser que se rompa una hebra. El Lk siempre es un número entero.

• Lk < 0 → se entrecruzan formando hélice levógira.
• Lk > 0 → se entrecruzan formando hélice dextrógira.
• Desenrollamiento → ΔLk < 0 → Superenrollamiento negativo.
• Sobre-enrollamiento → ΔLk > 0 → Superenrollamiento positivo. Cálculo → Lk = pb/10, Topoisómeros: cuando dos moléculas de ADN se diferencian en un cambio topológico (por ejemplo, en el índice de enlace), pero no cambia el número de pares de bases (tamaño).

2. TOPOISOMERASAS

Enzimas que catalizan el enrollamiento y desenrollamiento del ADN (cambio del Lk). Presentes en todas las células. Electroforesis:

• Calle 1: diferentes topoisómeros. La forma relajada corre más lento que la forma superenrollada.
• Calles 2 y 3: se ha tratado el ADN con topoisomerasa I a dos tiempos diferentes. Se observan distintos niveles de superenrollamiento. Dos tipos en eucariotas: I y II.
• Tipo I: Corta una hebra de ADN, permitiendo de esta forma liberar las tensiones internas debidas a un excesivo enrollamiento o a un enrollamiento deficiente. Una vez que la tensión se ha relajado, pega los extremos de la hebra cortada. No requiere de ATP para su funcionamiento.
• Tipo II (girasa): Corta ambas hebras de la cadena de ADN y pasa otra doble cadena intacta por le hueco formado en la ruptura. ATP dependiente. E. coli:

1. Topoisomerasa con conformación cerrada se une al ADN.
2. La tirosina del sitio activo de la enzima rompe el enlace fosfodiéster de una hebra. Se crea un enlace 5’-fosfo-tirosil entre la enzima y el ADN.
3. La enzima coge una conformación abierta. La hebra que no se ha cortado pasa por el corte.
4. La enzima adquiere de nuevo la conformación cerrada. El grupo hidroxilo libre (3’) ataca el enlace 5’-fosfotirosil que hay entre la proteína y el ADN. Se unen los extremos de la hebra de ADN que estaba cortada.
5. La enzima y el ADN se separan. Empieza un nuevo ciclo.

3. SUPERENROLLAMIENTO PLECTONÉMICO

Para compactar y empaquetar el ADN se necesita un tipo concreto de superenrollamiento. Superenrollamiento plectonémico: el ADN aislado en solución tiende a adoptar una forma extendida y estrecha en lugar de compacta y suele presentar ramificaciones múltiples. Superenrollamiento solenoidal: inestable, por eso se une el ADN a proteínas → cromatina.

TEMA 1.3: ESTRUCTURA DE LOS CROMOSOMAS

Cromosoma: estructura altamente organizada formada principalmente por ADN y que contiene la mayor parte de la información genética de un organismo. Durante el ciclo celular eucariota, el ADN cambia de estructura:

• Células que no están proliferando (G 0 ) o en interfase (G 1 , S y S 2 ): ADN sin forma, esparcido en el núcleo. Cromatina.
• Células en mitosis: cromatina condensada, cromosomas. Cromatina: estructura fibrosa con proporciones similares (en masa) de proteínas y ADN. También en cantidades pequeñas pueden aparecer pequeñas moléculas de ARN.
• ADN + histona = nucleosoma. Unidad de la cromatina.
• Enlace entre nucleosomas: ADN.

1. HISTONAS

Histonas: proteínas que aparecen en la cromatina de todas las células eucariotas, cuya función principal es empaquetar el ADN. Son proteínas pequeñas y básicas: ricas en Lys y Arg. Hay 5 tipos en células eucariotas:

• H3 y H4: casi idénticas en diferentes organismos eucariotas, función conservada.
• H1, H2A y H2B: más diferencias interespecie. Las histonas pueden sufrir modificaciones post-traduccionales: metilación, acetilación, fosforilación… Cambian la carga de las histonas y tienen efecto en la transcripción. Nucleosoma:
• 8 histonas: 2x H2A, 2x H2B, 2x H3, 2x H
• Unidad repetitiva cada 200 pares de bases.
• El ADN le da la histona 1,8 giros (146 pb).

2. ESTRUCTURAS DE LA CROMATINA

• Estructura secundaria: Los nucleosomas se empaquetan en estructuras cada vez más compactas formando fibras de hasta 30 nm de grosor (el ADN se compacta hasta 100x). El ADN se retuerce alrededor del nucleosoma. Inicialmente el tamaño del ADN se compacta 7 veces (en un cromosoma 10000x). Se requiere de una H1 por nucleosoma, no hay transcripción génica. Zonas sin H1 si hay transcripción.
• Estructura terciaria: La fibra de 30 nm forma bucles. En cada bucle se agrupan los genes que codifican proteínas con funciones similares. Estructura nuclear = andamio. Hay H1 y muchas topoisomerasas de clase II. Permite el mantenimiento de la cromatina.

3. PROTEÍNAS SMC

SMC: sctructural maintenance of chromosomes. Aparecen en todos los organismos vivos, desde bacterias hasta humanos. Se encargan del mantenimiento de la estructura condensada de los cromosomas. Son ATP dependientes. Formadas por dos extremos globulares con capacidad de hidrolizar ATP. Se abren y se cierran. La bisagra permite que la proteína se cierre sobre sí misma, y que se pongan en contacto los dos extremos, formando la zona de hidrólisis del ATP. Forman dímeros. Se unen mediante la bisagra. Hidrólisis de ATP para abrir y cerrar el dímero. 2 tipos:

• Cohesina: se encarga de mantener unidas las dos cromátidas durante la replicación y la metafase (Smc1 y Smc3).
• Condensina: participa en la condensación de los cromosomas durante la mitosis (Smc y Smc4).

4. ORGANIZACIÓN DEL ADN BACTERIANO

El ADN de bacterias se organiza en nucleoides. Es una estructura en forma de andamio, parecido a las eucariotas. Se forman dominios independientes, por lo que, si se desenrolla uno de ellos, no se desenrolla todo el ADN. Organización más simple y dinámica que la cromatina. RESUMEN

1. La unidad básica de estructuración del ADN de una célula eucariota es el nucleosoma.
2. Nucleosoma: 8 histonas + 146 pb de ADN solenoidal rodeando el complejo de histonas.
3. Los nucleosomas se organizan en fibras de 30 nm para posibilitar la condensación del ADN en cromosomas.
4. Para mayor condensación → H1, topoisomerasa II y proteínas SMC. Además, las proteínas SMC son importantes para mantener la estructura de los cromosomas durante la división celular.
5. En bacterias, el ADN se organiza en nucleoides. Organización más simple y dinámica que la cromatina.

• Es secuencial y bidireccional desde los puntos de inicio: los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva a cabo la replicación. Se da bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.
• La dirección de la síntesis de ADN es 5’ – 3’ y se da de manera semidiscontinua: la hebra adelantada se sintetiza de forma continua en la dirección en la que avanza la horquilla. La hebra retrasada se sintetiza de forma discontinua mediante fragmentos de Okazaki.

3. ADN POLIMERASAS

La síntesis de ADN es llevada a cabo por ADN polimerasas. Para que las ADN polimerasas sinteticen una nueva hebra de ADN, se tienen que cumplir las siguientes 2 condiciones:

• Todas las ADN polimerasas necesitan una hebra molde: esta hebra dirige la reacción de polimerización según las normas de emparejamiento de las bases.
• Las polimerasas necesitan un cebador (primer): un pequeño fragmento de ADN complementario a la hebra molde que tiene el extremo 3’-OH libre (se le puede unir un nucleótido). Procesividad de la ADN polimerasa: la procesividad (alta, media, baja) se define como el número de nucleótidos añadidos en promedio cada vez que la enzima se asocia con el cebador y la hebra molde. La tasa de errores de las DNA polimerasas es muy baja. Además, tienen asociada una actividad correctora de errores (exo 3’ – 5’) que aumenta aún más su fidelidad (son las únicas enzimas que poseen esta capacidad). Esta característica se denomina actividad exonucleasa: elimina los nucleótidos mal añadidos en dirección 3’ – 5’ antes de que se genere el enlace fosfodiéster. Discriminación entre nucleótidos bien y mal añadidos:
• Puentes de hidrógeno entre bases: si se emparejan mal faltan o sobran puentes. A-T: 2 puentes. C-G: 3 puentes.
• Geometría de las bases: afecta al sitio activo del enzima. Son capaces de realizar una lectura de prueba (proofreading).

4. OTRAS ENZIMAS Y FACTORES NECESARIOS

Replisoma: complejo formado por más de 20 enzimas y proteínas necesarias para la replicación del ADN en E. coli.

• Helicasas : avanzan por cada horquilla de replicación desnaturalizando el ADN. Hay dos helicasas por cada burbuja de replicación, formada a partir de cada origen de replicación, y avanzan en sentidos opuestos. Necesitan ATP.
• Topoisomerasas : deshacen los superenrollamientos del ADN para facilitar la entrada a la maquinaria replicativa.
• Proteínas SSB : estabilizan las hebras separadas uniéndose al ADN.
• Primasas : sintetiza pequeños fragmentos de ARN sobre la cadena retrasada en la replicación del ADN. Estos fragmentos son de unos 10 nucleótidos y se llaman cebadores. Son complementarios a la hebra de ADN que se copia durante la replicación.
• Ligasas : la DNA polimerasa reemplaza el cebador de ARN por ADN (gracias a exo 5’-3’) Una vez quitado el ARN, el ADN resultante tiene ciertos enlaces fosfodiéster rotos y la DNA ligasa se encarga de arreglarlos.

5. REPLICACIÓN EN E. COLI

5.1. INICIO

La síntesis bidireccional del ADN cromosómico comienza siempre en el mismo sitio del cromosoma, oriC, que es una región de 245 pb. Secuencias claves del lugar de inicio: DUE y lugar de unión de la proteína DnaA.

o Hebra adelantada: La primasa sintetiza un cebador de ARN. Se une la polimerasa y comienza la síntesis, avanza a la vez que la horquilla de replicación, de manera continua hasta que termina. o Hebra retrasada: Se sintetiza en sentido contrario a la horquilla. Se sintetiza en fragmentos (Okazaki). Es necesario un cebador para cada fragmento de Okazaki, sintetizados por la primasa. Los fragmentos sintetizados se unen gracias a la Ligasa. Priosoma: helicasa DnaB y primasa DnaG. Los tres tipos de DNA polimerasa tienen actividad exonucleasa 3’ – 5 ’. La DNA polimerasa I, además tiene actividad exonucleasa 5’ – 3’ gracias al dominio de Klenow. Este dominio no forma parte del enzima, si no que se une a ella.

5.3. TERMINACIÓN

Las secuencias Ter están unidas a unas proteínas llamadas Tus. Cuando el replisoma entra en estas secuencias, este queda atrapado, provocando el fin de la replicación.

6. REPLICACIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS

La replicación en células eucariotas es más compleja que en procariotas. La base del proceso, así como los complejos proteicos y proteínas que participan son parecidos. Tienen la función y estructura muy conservada. En eucariotas, la replicación está coordinada con el ciclo celular, por lo que hay una regulación muy precisa. Esta regulación se asegura de que todo el ADN se duplique dentro de un ciclo celular, gracias a la acción de ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Inicio de la replicación: o Vertebrados: Regiones ricas en A-T. Variable de ciclo celular a ciclo celular. o Levaduras: ARS (autonomously replicating sequences): 400 repeticiones/16 cromosomas (haploide). Velocidad de la horquilla de replicación: 50 nucleótidos/segundo. Múltiples lugares de inicio: cada 30.000 - 300.000 bases. La clave del inicio de la replicación son las helicasas. Además, se une un heterohexamero de MCM que aporta estabilidad. En eucariotas, la replicación acaba con la síntesis de los telómeros.

TEMA 2.2: REPARACIÓN DEL ADN

1. CAMBIOS HABITUALES EN EL ADN

• Desaminación: Cuando las bases nitrogenadas pierden su grupo amino se convierten en otro tipo de bases. Ej: la adenina pasa a ser hipoxantina, la guanina pasa a xantina y la citosina a uracilo. Estos cambios provocan errores en la replicación del ADN, ya que se emparejan bases erróneas.
• Depurinación: Se rompe el enlace que existe entre el azúcar y la base nitrogenada, se hidroliza mediante una molécula de agua. Esto provoca que el nucleótido pierda la BN y que se forme un sitio apurínico o apirimidínico, es decir, un sitio abásico. Justo en esa parte del ADN el nucleótido no tiene base nitrogenada. Se repara mediante un sistema de reparación directa.
• Dímeros de timina generados por luz UV: Es un cambio estructural que sucede por la exposición del ADN a la luz ultravioleta. Dos timinas de la misma hebra se unen mediante enlaces covalentes, se pueden formar uno o dos enlaces. Suele aparecer en cáncer provocado por la luz solar.

2. MUTACIONES

Mutación: cambio estable que se da en una secuencia de ADN y que siempre tiene un efecto patogénico (frecuencia < 0,05). Tipos de mutaciones:

• Sustitución: una base cambia por otra.
• Inserción: se inserta una base.
• Deleción: se elimina una base. 2.1. TIPOS DE MUTACIONES SEGÚN SUS EFECTOS
• Efecto en el código genético:
• Mutación silente o silenciosa (silent): cambios en el ADN no esencial o que no producen cambios en la secuencia de aminoácidos y, por tanto, no son patogénicas.
• Mutación con cambio de sentido (missense): cambio puntual en el ADN que provoca un cambio en el codón que codifica para un aminoácido diferente.
• Mutaciones sin sentido (nonsense): cambio puntual que provoca el cambio de un aminoácido por un codón de terminación.
• Mutaciones por desplazamiento del marco de lectura (frameshift): cambios en el ADN por inserción o deleción de nucleótidos que provocan el desplazamiento del marco de lectura y provocan una traducción diferente a la original.
• Efecto en la proteína:
• Pérdida de función (Loss of function): pérdida de función por falta de proteína (nulo) o por reducción de la funcionalidad de la proteína.
• Ganancia de función (Gain of function): ganancia de función por aumento de la funcionalidad de la proteína.
• Efecto fenotípico:
• Neutro / Beneficioso / Patogénico.

3. REPARACIÓN DEL ADN

Para reparar el ADN hay muchos sistemas y son muy diversos. Esta reparación es posible porque existen dos hebras de ADN complementarias. Las reparaciones son energéticamente desfavorables. Tipos de reparaciones:

• Reparación de apareamientos incorrectos.
• Reparación por escisión de bases.
• Reparación por escisión de nucleótidos.
• Reparación directa.
• Respuesta SOS.

3.3. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES

1. La ADN glucosilasa corta entre la base y la estructura de desoxirribosa (enlace N- glicosilo). Se forma un sitio AP (sin BN).
2. La AP endonucleasa corta un enlace fosofodiester entre nucleótidos a la altura del sitio AP.
3. La ADN polimerasa I quita el fragmento de hebra que contiene el error (5’ – 3’ exo) y sintetiza el nuevo fragmento (5’ – 3’).
4. La DNA ligasa une los dos fragmentos. La ADN glicosilasa es muy específica, ya que solo elimina los uracilos. La mayoría de las bacterias tienen un única Uracil ADN glicosilasa pero los humanos tenemos 4 diferentes. Proteína Función UNG Trabaja a nivel de replisoma → en la replicación quita los uracilos mal introducidos de cualquier hebra. Se mueve con la horquilla de replicación. hSMUG1 Durante la replicación, quita los uracilos de una sola hebra (100 veces más habitual en una sola hebra). TDG y MBD Quita los uracilos y las timinas mal emparejados con guaninas creadas desde la desaminación de las citosinas o las 5’-metilcitosina. Otras Desapareamientos debidos a introducción de hipoxantina (creada desde la desaminación de la adenanina), bases alquiladas, oxidación de purinas… 3.4. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS
5. 2 x UvrA rastrean el DNA hasta encontrar una distorsión estructural (ej. Dímero de timina).
6. UvrB queda unido en la zona lesionada, UvrA es eliminado y se recluta UvrC.
7. UvrC produce dos cortes endonucleotídicos a ambos lados de la lesión. En E. coli: corta un fragmento de 13 nucleótidos. Unos 5 nts en dirección 3’ y unos 8 nts en dirección 5’. En humanos: corta un fragmento de 29 nucleótidos.
8. UvrD, que es una helicasa, desplaza el oligo que incluye la distorsión.
9. La DNA polimerasa I rellena el huevo a partir del extremo 3’ OH libre y la ligasa lo sella. La unión de las proteínas UvrA, UvrB y UvrC forma un complejo llamado ABC escinucleasa.

3.5. REPARACIÓN DIRECTA

En esta reparación se revierte la lesión directamente, sin escisión de bases ni de nucleótidos. o Reparación de dímero de timina producidos por luz UV. Dos timinas adyacentes en una misma banda de ADN unidas covalentemente por un anillo de tipo ciclobutano. La Fotoliasa tiene dos cromóforos, uno que absorbe la luz azul y otro relacionado con FADH. La luz UV provoca la formación del dímero, pero también activa a la fotoliasa, que va a reparar el error.

1. El primer cromóforo absorbe fotones de luz azul.
2. La energía de la excitación pasa a la molécula de FADH.
3. La molécula de FADH activada le da un electrón al dímero de timina, desestabilizando el dímero.
4. Se rompe el dímero y los electrones vuelven al radical de flavina para regenerar FADH. o O^6 - metilguanina-DNA transferasa. O^6 - metilguanina se repara por una metiltransferasa que elimina el grupo metilo, transfiriéndose al enzima y quedando esta inactivada. o 1 - metiladenina y 3-metilcitosina.