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TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Esta área está relacionada con otros campos de la biología y la química, particularmente ingeniería genética y bioquímica. La biología molecular concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo que incluye relaciones tales como las que existen entre el ADN y el ARN, la síntesis de proteínas, el metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un correcto funcionamiento de la célula. ·Propiedades distintivas de los sistemas vivos.
- Autorreproducción.
- Otras: ·Complejos y altamente organizados. ·Todas las estructuras desempeñan una función. ·Los sistemas vivos están comprometidos en transformaciones energéticas. ADN->ARN->Proteínas 3 reinos en la biología molecular:
- Arqueobacterias
- Eucariota
- Procariotas Los tres reinos animales tienen en común la replicación del ADN, ya que el código genético es prácticamente universal. Elementos químicos de las moléculas orgánicas Macroelementos Primarios (96%) : H,O, C y N Macroelementos Secundarios (3%):Na, K, Mg,Ca, Cl, S y P Oligoelementos (<0,01%): Fe, Zn, I y Se Tipos de organización celular
- Células procariotas
- Células eucariotas Datos random: la primera vacuna fue la de la viruela; la primera enzima que descubrió la humanidad fue el alcohol deshidrogenasa. Tipos de enlaces
- Enlace iónico o puente salino Se establece entre elementos cuya electronegatividad es muy diferente (metal-no metal). El metal pierde sus electrones y se transforma en un catión (ion positivo), mientras que el no metal acepta esos electrones y se convierte en un anión (ion negativo). El resultado es la formación de una red iónica o cristal. Son muy fáciles de romper.
- Enlaces covalentes Se comparten electrones. Es el tipo de enlace más fuerte. Un ejemplo es en las proteínas la estructura primaria sí tiene enlaces covalentes, en el resto no.
- Puentes de hidrógeno Es un tipo de unión débil. Se trata de la atracción entre dos regiones moleculares que tienen carga iónica parcial de distinto signo (se establece entre polo positivo y polo negativo de dos moléculas dipolares con H, unido por enlace
covalente a un elemento muy electronegativo). El ADN presenta puentes de hidrógeno en su doble hélice. La molécula de agua se forma mediante puentes de hidrógeno. Los enlaces son muy importantes, siempre que vayamos a construir algo necesitaremos energía, por el contrario, siempre que vayamos a romper algún enlace se liberará la energía. Ejemplo: en las proteínas encontraremos muchos enlaces débiles para cambiar su estructura. La Km es una concentración de sustrato. A menor km vamos a tener mayor afinidad por el sustrato, lo cual la enzima que tenga una menor km trabajará más. Las células eucariotas tienen isoenzimas. las células procariotas por cada gen tienen 4 proteínas mientras las eucariotas tiene por cada gen una única proteína. Interacciones débiles no covalentes · Puente salino · interacciones hidrofóbicas · interacciones de Van der Walls: son interacciones muy débiles y se produce por cercanía de las células. · Puentes de hidrógeno Interacciones moleculares no covalentes · carga-carga (iónico) · dipolo-dipolo: el enlace de agua. · dipolo-dipolo inducido · Fuerzas de Van der Walls LA MOLÉCULA DEL AGUA=> es polar Las propiedades físicas del agua son importantes para los seres vivos Es un dipolo, lo que significa que tiene carga parcial ya que el oxígeno es más electronegativo que el hidrógeno. El agua puede actuar como: Lubricante, facilitando movimientos (mucus, líquido sinovial) Agente protector frente a daños mecánicos (líquido amniótico) Regulador de la temperatura (por su elevado calor específico puede absorber gran cantidad de energía sin que aumente su temperatura) El agua se caracteriza por: Elevado punto de fusión y de ebullición y elevado calor de vaporización. Alta tensión superficial y alto calor específico. Descenso de densidad por congelación. Elevada constante dialéctica => permite interaccionar con moléculas cargadas. Es un disolvente que tiene gran capacidad de disolver solutos. El agua tiene capacidad de disociarse en un ión hidronio y uno hidroxilo. Esta capacidad de disociación me genera que tenga protones.
Tampones: amortiguan cambios en el pH Tampón fosfato: tampón biológico intracelular. (citoplasma) tiene capacidad de perder. Tampón bicarbonato: tampón sanguíneo. Pregunta de examen= poner un rango de ph y decir si tiene capacidad de tamponar. pH óptimo de algunas enzimas ¿Por qué las enzimas cambian según el ph? El pH varía según como están los aminoácidos, cambia como están ionizados sus grupos. ¿Qué ocurre cuando tienen la misma carga? Alcanza el punto isoeléctrico. Molécula neutra. TEMA 2: PROTEÍNAS Las proteínas están formadas por aminoácidos. Las proteínas son: Son las macromoléculas más abundantes de las células, constituyen más del 50% del peso seco de las mismas. Tienen funciones muy variadas (catalítica, reguladora, inmunológica, de sostén, transportadora, etc.), reflejo de sus variadas estructuras. Son cadenas lineales de aminoácidos. Se forman mediante combinaciones de 20 aminoácidos. La estructura y la función de la proteína están determinadas por sus aminoácidos componentes y por la secuencia de estos en la cadena polipeptídica. -Los aminoácidos son bifuncionales: grupos amino y carboxilo, ambos unidos al átomo de carbono α. -Los aminoácidos proteicos son α-aminoácidos. Cuando el pH sea 2 tiene la capacidad de tamponar, va a depender de la carga de la molécula. Punto isoeléctrico: la misma carga de positivos que de negativos. Hay 2 pK por cada aminoácido. Cuanto más porcentaje de moléculas polares tenga es más soluble en agua. ESTEREOISOMETRÍA (MUY IMPORTANTE) Una de las propiedades de los aminoácidos es la isometría. Todos los aminoácidos obtenidos de la hidrólisis de una proteína, excepto la glicina, tienen al menos un carbono asimétrico (carbono alfa), es decir unido a cuatro radicales diferentes. Como consecuencia de ello, pueden presentar dos configuraciones espaciales D (dextrógiros, de carga positiva) y L (levógiros de carga negativa, se dan de forma natural) según sea la orientación del grupo amino a la derecha (D) o a la izquierda (L). Estas dos configuraciones esapciales se denominan esteroisómeros. Todos los aminoácidos proteicos son de la serie L, ya que la transcriptasa no es capaz de reconocer la forma D. Estado de ionización de un aminoácido con cadena lateral no ionizable en distintas condiciones de pH -A pH 7 se encuentra en su forma de ión dipolar con carga neta cero.
- A pH ácido dominan las formas protonadas con carga positiva. -A pH básico domina la forma totalmente desprotonada con carga negativa. Los aminoácidos pueden funcionar como tampones, estos serán los que tienen el grupo R en pH 7 el resto no. ¿Qué es el pK? El pK es igual que el pH cuando la concentración de ácido y de base son exactamente iguales. La molécula puede ser neutra entre el pK 2 y pK 4. Las plantas suelen hacer todos los aminoácidos y nosotros como no podemos los integramos en la dieta. Los aminoácidos esenciales son los que no fabricamos. (mirar tabla) Clasificación de los AA Estado de ionización que domina a pH7. Solo 20 aminoácidos proteícos están codificados genéticamente. Los aminoácidos esenciales son los que no fabricamos directamente. Las plantas si logran fabricarlos y a través de ellas nosotros logramos adquirirlos. Llamaremos aminoácidos no esenciales a todos aquellos que el organismo pueda sintetizar. Funciones no proteicas de los aminoácidos y derivados o Glucosa y Glicina son neurotransmisores. o Aminas derivadas con actividad biológica: histamina, serotonina, dopamina, epinefrina y norepinefrina. o Algunas hormonas vegetales (auxinas). Los aminoácidos se unen covalentemente entre sí para formar las proteínas. EL ENLACE PEPTÍDICO: es de tipo amida (muy importante) Propiedades del enlace peptídico: el enlace peptídico es un híbrido de resonancia Los aminoácidos se unen covalentemente entre sí para formar las proteínas. El enlace peptídico tiene carácter parcial de doble enlace. Al ser el oxígeno más electronegativo que el nitrógeno, los electrones deslocalizados están más desplazados hacia el oxígeno, quedando éste con carga parcial negativa y el nitrógeno con carga parcial positiva. Por lo tanto, el enlace peptídico es polar. Como consecuencia, el oxígeno es aceptor de hidrógeno y el nitrógeno es dador de hidrógeno en los puentes de hidrógeno.
o Toxinas o Péptidos sintéticos con interés industrial Diversos péptidos regulan funciones muy variadas en el ser humano
- Ingesta de alimentos: insulina, glucagón, leptina, neuropéptido Y,... (cuando se incrementa la cantidad de azúcar en sangre, tenemos glucosa en sangre, por tanto avisa la insulina de la presencia de esta en sangre) (El glucagón es lo contrario a la glucosa, por tanto cuando no hay glucosa, el glucagón avisa de que no hay glucosa) (la leptina es la encargada de dar la señal de saciedad tanto a medio (en el hipotálamo, regulado por la leptina y por el neuropéptido Y, el cual va a dar la sensación de hambre) como a largo plazo (, es verdad que a corto no lo va a dar, eso lo hace el GCL2)
- Presión sanguínea: vasopresina (ADH) (es la encargada de regular la cantidad de agua que tenemos en sangre, muy importante porque ayuda a la filtración de los riñones)
- Producción de leche y contracciones del parto: oxitocina (ejemplo de la secuencia primaria en la función de una proteína. Solo va a cambiar un aminoácido entre la vasopresina y la oxitocina) (la oxitocina es la encargada de la generación de leche y de provocar el parto. A parte, esta es la encargada de generar ese sentimiento de apego al bebe en el momento del parto para no generar rechazo hacía la cría) (la oxítona es un nonapéptido)
- Sensación de dolor: sustancia P, bradiquinina, péptidos opiáceos (Leu-encefalina, Metencefalina)
- Estado redox de las células: glutatión. Pregunta de examen: ¿cuánto emigrará un aminoácido glutámico atraído a un polo positivo? (pK1: 2, pK2:9, pKr:4) a) Ph=1: no puede ser posible porque a ph1 tiene carga positiva. Por tanto, positivo con positivo no se atraen. b) Ph=3: no puede ser posible, porque a este ph la molécula es neutra. c) Ph=8: es la respuesta correcta, debido a que tenemos una molécula negativa con la positiva. d) ninguna Muchos organismos utilizan péptidos como sustancias tóxicas
- Existen venenos neurotóxicos (serpientes, arañas…), hemolíticos (serpientes) o de otro tipo (setas): calciseptina, agatoxina, apamina, conotoxinas, amanitina…
- Los microorganismos producen antibióticos: valinomicina, gramicidina… Algunos péptidos sintéticos tienen interés industrial o comercial
- Péptidos edulcorantes: aspartamo.
- Péptidos inmunogénicos: vacunas sintéticas. NIVELES ESTRUCTURALES DE LAS PROTEÍNAS
- ESTRUCTURA PRIMARIA LA FUERZA QUE DETERMINA ESTA ESTRUCTURA SON LOS ENLACES COVALENTES. La estructura primaria de un péptido o proteína consiste en la secuencia de aminoácidos que lo constituyen. La importancia de la secuencia de aa reside en que va a condicionar los niveles de organización superiores. La secuencia de aminoácidos es una proteína, esto es una característica única de cada proteína. Cada secuencia está codificada por la secuencia de nucleótidos del ADN. En el proceso de traducción se pasa de un código de tripletes de bases nitrogenadas a un código de aminoácidos, tal que así: Estudiando la estructura primaria se pueden deducir relaciones evolutivas entre las proteínas.
- ESTRUCTURA SECUNDARIA
LA FUERZA QUE DETERMINA ESTA ESTRUCTURA SON INTERACCIONES DÉBILES (puentes de H, Van der Walls, interacciones hidrofóbicas). Importante porque hay pocas diferentes y se encuentran en todas las proteínas.
- ESTRUCTURA TERCIARIA Considera enlaces débiles. Es única para cada proeína. Es importante porque es el plegamiento con el que la proteína se encuentra en la naturaleza y tiene actividad biológica.
- ESTRUCTURA CUATERNARIA Considera enlaces débiles y disposición en el espacio de varias cadenas polipeptídicas. Solo aplicable con proteínas con varias subunidades. Estructura hélice alfa la hélice alfa es más estable que la lámina beta porque los puentes de hidrogeno se forman dentro de la cadena. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógenos intracatenarios formados entre el grupo NH de un enlace peptídico y el grupo CO del cuarto aminoácido que lo sigue. Lámina Beta Los enlaces se forman entre las cadenas, es decir los enlaces son intracatenarios, se establecen entre el CO Y NH de cadenas adyacentes. Las láminas betas puedes ser paralelas o antiparalelas. La disposición antiparalela es más compacta que la paralela y aparece con mayor frecuencia en las proteínas. Conformación local de residuos consecutivos Tres combinaciones de baja energía de los esqueletos: Hélice dextrógira Extendida Hélice levógira Enlaces de hidrogeno entre átomos del esqueleto peptídico proporcionan estabilidad a las estructuras secundarias. El colágeno es una hélice exclusiva levógira, extracelular y rica en glicina y prolina. Forma grandes fibras extracelulares, en tejidos conjuntivos, de sostén: piel, huesos, tendones… Se asocia con otras macromoléculas extracelulares y forman parte de la matriz extracelular.
- ESTRUCTURA TERCIARIA Fuerzas que mantienen la estructura terciaria: Interacciones débiles (no covalentes) Iónicas (puentes salinos) Hidrofóbicas Enlaces de hidrógeno Fuerza de Vaan der Walls Clasificación de proteínas en función de su forma y solubilidad ·PROTEÍNAS FIBROSAS -Tienen una estructura básicamente lineal. -Predomina un único tipo de estructura secundaria. -Función estructural, resistencia de tipo mecánica. -Insolubles en agua. Tipos:
Las cadenas se pliegan espontáneamente porque la estructura plegada corresponde a un mínimo de energía libre (AG) del polipéptido en condiciones fisiológicas. Formula: G = H - T S Contribuciones a la energía libre del plegado de las proteínas globulares. o Cambio de entropía conformacional desfavorable (el plegamiento disminuye S) o Cambio de entropía favorable del enterramiento de los residuos hidrofóbicos en el interior de la proteína (efecto hidrofóbico) o Cambio de entalpía favorable (disminuye ∆H) de las interacciones internas entre las cadenas laterales IMPORTANTE DIAPOSITIVA 88 Dominios estructurales
- son regiones de plegamiento independiente
- están asociados a determinadas funciones
- un mismo dominio se puede encontrar en proteínas distintas Que diferencia hay entre un dominio y una estructura cuaternaria pregunta de examen Los dominios es una sola estructura de una cadena mientras que la estructura cuaternaria es el plegamiento de la estructura terciaria. La regulación de la estructura cuaternaria es global. En el plegamiento de muchas proteínas intervienen proteínas conocidas como chaperonas moleculares (Protegen la cadena recién formada de interacciones indeseables con otras moléculas): Chaperonas Hsp70. Chaperoninas, Hsp60. GroEL y GroES de Escherichia coli. Pero también pueden intervenir otras proteínas: Proteína disulfuro isomerasas. Peptidil prolil cis trans isomerasas.
TEMA 3: ENZIMAS
Los catalizadores en sistemas biológicos son, en su gran mayoría, proteínas: enzimas. Existen excepciones, en las que la catálisis es realizada por ARN: los ribosomas. Características de las enzimas: ·Elevado poder catalítico: velocidad de reacción muy incrementada ·Condiciones suaves de reacción (P,T, pH) ·Especificidad: ausencia de subproductos ·Posibilidad de regulación de su actividad Cuando las enzimas actúan generan un intermediario que es una especie de sustrato actuando, por eso la temperatura y la presión influyen. Los catalizadores bajan la energía de activación. Las enzimas pueden necesitar componentes no proteicos: cofactores, principalmente para procesos redox y muchas transferencias de grupo. Clasificación general de las enzimas según el tipo de reacción que realizan:
- Hidrolasas: realizan hidrólisis en presencia de agua.
- Liasas: catalizan la liberación de grupos funcionales diversos, adicción de grupos a los dobles enlaces.
- Transferasas: transferencia de grupos funcionales o radicales de una molécula a otra. Ej: Hexoquinasa
- Isomerasas: transforma una molécula en su isómero.
- Oxidorreductasa: catalizan reacciones de óxido-reducción.
- Sintetasas/ligasas: cataliza la síntesis de moléculas de ATP formando enlaces. ¿Como funciona una enzima? Lo que tengo que tener es un sustrato y una enzima. La reacción se lleva a cabo en el centro activo. Las enzimas se unen de manera específica al sustrato, formándose así un complejo llamado “enzima-sustrato”. La unión se realiza en el centro activo. Éste es asimétrico en muchas ocasiones. En el complejo enzima-sustrato, la enzima induce cambios en la molécula de sustrato que hacen disminuir su energía de activación y conducen a la formación del producto final y la liberación de la enzima, inalterada, que puede actuar de nuevo. (E) + (S) => (ES) => (P) + (E) Diapositiva 10 importante. El centro activo puede estar formado por residuos de aminoácidos lejanos en la estructura primaria. Diapositiva 16 importante. Estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente. (ver en el libro)
rápidamente hasta anularse. Las enzimas de microorganismos que viven en condiciones de elevadas temperaturas (grietas de fondos marinos, volcanes, géiseres) han evolucionado para no desnaturalizarse a esas temperaturas. La cinética enzimática
Cada enzima posee una cinética característica para cada sustrato. En condiciones intracelulares, las
enzimas no se hallan saturadas por sus sustratos y por ello no funcionan a la velocidad máxima.
Las condiciones ambientales influyen en la actividad enzimática.
-Podemos modificar las condiciones como el pH y la temperatura. Las células no suelen cambiar la
temperatura, ya que operan con rangos de tolerancia estrechos.
-Sin embargo, las células eucariotas poseen orgánulos con diferentes condiciones de pH.
Cada enzima tiene un pH óptimo diferente.
Inhibición enzimática La actividad enzimática puede ser inhibida por moléculas específicas, como mecanismo de control en los sistemas biológicos. También muchos fármacos y sustancias tóxicas actúan inhibiendo las enzimas. Utilizando inhibidores específicos podemos identificar residuos importantes para la catálisis y así deducir el mecanismo de acción enzimática. Inhibidores irreversibles: se unen a la enzima mediante enlace covalente impidiendo de manera definitiva su actividad (toxinas, venenos). Inhibidores reversibles: se unen a la enzima mediante interacciones no covalentes (débiles por lo que se puede disociar de ella permitiendo de nuevo su actividad). Puede ser: Inhibición competitiva. Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por la unión al sitio activo de la enzima, por lo tanto, debe tener alguna característica estructural común con el sustrato. Una vez unido al centro activo no puede ser transformado por el enzima. IMPORTANTE DIAPOSITIVA 42. buscamos una molécula que es muy parecida al sustrato, la enzima no es capaz de distinguir cual es el sustrato y cual es el inhibidor por tanto se van a unir. Cuando tenta la misma concentración del sustrato y del inhibidor. Si se une a un centro regulador no importa la concentración que tenga. Inhibición no competitiva. Un inhibidor no competitivo puede unirse tanto al enzima libre como al complejo enzima-sustrato. Por lo tanto, el inhibidor no competitivo se une al enzima en un lugar distinto al centro activo. La unión del inhibidor no impide la unión del sustrato, pero su actividad queda bloqueada. Ejemplo: A menor Km, mayor afinidad por el sustrato. ¿qué concentración de glucosa tengo que tener para que salga fructosa en vez de glucosa?
- No competitiva: depende de la concentración si hay una mayor inhibición o no.
- Competitiva: la enzima trabaja peor, ya que va a tardar más.
Regulación de la actividad enzimática Hay dos tipos:
- Regulación alostérica. Las enzimas alostéricas son aquellas cuya actividad catalítica es modulada por la unión no covalente de un metabolito específico (hay especificidad igual que con la enzima y el sustrato) a un sitio de la proteína distinto del centro activo (poseen otro centro de unión la parte del centro activo, llamado centro alostérico, mediante el cual interactúan con otra molécula denominada efector/modulador. Casi siempre son oligoméricas (estructura cuaternaria 🡪 varias subunidades). Pueden ser de dos tipos: Moduladores alostéricos positivos o activadores. Estimulan la actividad de la enzima al unirse al centro alostérico. (Favorecen la forma R). Moduladores alostéricos negativos o inhibidores. Inhiben la actividad de la enzima al unirse al centro alostérico. (Favorecen la forma T). Ejemplo: tengo hambre Si aumenta la glucosa en sangre aumenta la insulina Si tengo baja glucosa en sangre aumenta el glucagón (el musculo esquelético glucagón; aunque haya baja glucosa te vas a seguir moviendo para buscar comida). Estas señales se mandan por regulación por modificación covalente.
- Regulación por modificación covalente. consiste en modificar la conformación de una enzima como consecuencia de la unión reversible que se establece entre los grupos químicos de la proteína y una molécula de baja masa molecular. Hay distintos tipos de modificación covalente reversible de la actividad enzimática. -Regulación por fosforilación, adenililación, uridililazión, ADP ribosilación, metilación. -Otras modificaciones covalentes. (Prenilación, Miristoilación, Palmitoilación: La adición covalente de grupos acilo hidrofóbicos, o isoprenoides a proteínas solubles puede alterar su localización intracelular). Estas modificaciones covalentes generalmente provocan que las proteínas se asocien con una membrana. Ejemplo: Glucógeno: la forma en la que almacenamos los hidratos de carbonos en los músculos y en el hígado. Cuando como mucho, aumento mucho la glucosa, y el hígado la coge y la almacena (glucógeno) Tengo poca glucosa, quiero romper el glucógeno para conseguir glucosas sueltas => uso el glucógeno sintasa Creo glucógeno con grupo fosfato => se inhibe, porque la quieren romper por lo que usa el glucógeno fosforilasa. Zimógenos o proenzimas: Es un precursor enzimático inactivo, es decir, no cataliza ninguna reacción como hacen las enzimas. Para activarse, necesita de un cambio bioquímico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo donde pueda realizar la catálisis (variación en la velocidad de una reacción química producida por la presencia de un catalizador). (enzimas digestivas) Enzimas proteolíticas digestivas: Son un tipo de enzimas que actúan principalmente para ayudar a digerir distintos tipos de proteínas (incluido el gluten). Todas ellas se sintetizan como precursores inactivos (zimógenos). Deben sufrir una modificación covalente para activarse (proteólisis). Esta activación proteolítica es irreversible. Isoenzimas Son proteínas que catalizan la misma reacción enzimática, pero están codificadas por distintos genes, de modo que difieren en su composición de aminoácidos. Cada isoenzima puede tener moduladores alostéricos diferentes, e incluso valores de Km y V máx distintos.
Las principales bases son las de la diapositiva 5. Funciones de los nucleótidos: Transmitir el ATP. Actúan como señales químicas de los sistemas celulares en respuesta a hormonas y otros estímulos celulares. Son componentes extracelulares de una serie de coenzimas e intermedios metabólicos (NAD+, FAD, NADP+). Para generar una hebra de ADN voy generando nucleótidos en sentido 5’ a 3’ La unidad fundamental estructural de la cromatina son los nucleosomas. Doy cargas positivas a las proteínas y como están rodeadas de cargas negativas eso es lo que hace que estén unidad. Así consigo obtener la estructura básica de la cromatina. Durante la división celular, la cromatina se condensa formando estructuras definidas llamadas cromosomas. Los procariotas, la molécula de ADN es circular y no está unido a proteínas. Hidrólisis de ATP: Cada vez que a una molécula de ATP con 3 fósforos le quito un fosforo, libero energía. (Por cada enlace que rompa, estoy liberando energía). Nuestras células no almacenan energía, no pueden generar ATP si no tienen ADP, estoy continuamente convirtiendo uno en otro y viceversa, necesito un equilibrio en el que la célula tiene prácticamente la misma cantidad de ATP que ADP, por eso no ahorra energía, y si en algún momento genera más ATP, construye más cosas, por lo que nunca ahorra. (Estamos siempre creando y rompiendo proteínas, la célula siempre está rompiendo y creando, generando y gastando energía continuamente.) Modelo de la doble hélice del ADN. James Watson y Francis Crick. El DNA es una doble hélice dextrógira donde el azúcarfosfato se encuentra hacia el exterior interaccionando con las moléculas de agua del medio y las bases nitrogenadas se disponen hacia el interior de la estructura. También hay estructura Z y B. Las dos hebras tienen direcciones opuestas, por tanto, son antiparalelas. En la estructura de doble hélice, las bases nitrogenadas de una de las cadenas de DNA, están unidas por puentes de hidrógeno con las bases nitrogenadas de la cadena complementaria. La PCR: La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. La PCR lo que hace es amplificar el genoma del virus permitiendo detectar un fragmento de su material genético. Los melting son muy importantes para las PCR (reacción de cadena polimerasa), lo primero que tengo que hacer al hacer una PCR es desnaturalizar las cadenas de ADN, desnaturalizando los puentes de hidrógeno con calor, el melting es la temperatura necesaria para que se abra una cadena entera. Originalmente la PCR se originó para multiplicar el numero de cadenas exponencialmente dependiendo del numero de ciclos que hagas Para hacer una PCR necesito una proteína, un tampón, nucleótidos y un cebador/ primer y para acabar la PCR necesito tener una fase de elongación Hoy en día existen las rt- PCR (real time PCR) y la retrotranscripción-PCR en las que se pasan de RNA a DNA. La forma normal es de DNA a RNA y luego a proteína, por eso es “retrotranscripción” porque no sigue el curso normal, sino que va de atrás a adelante. Las PCR se hacen para aumentar la cantidad de DNA (por eso es tan importante en la biología molecular) por eso si encuentro una prueba en un crimen hago una PCR para tener más cantidad y poder realizar experimentos con la tranquilidad de que si falla el experimento, tengo más muestra y puedo realizar aún más.
Desnaturalización del material genético. Sucede debido a la temperatura sobre la molécula de ADN. La temperatura de fusión se define como aquella temperatura en la cual el DNA está semidesnaturalizado. Es necesario aplicar mayor temperatura a los triples enlaces C-G que a los dobles enlaces A-T. El problema de que se desnaturalice la hebra es que, luego, cuando se vuelva a naturalizar es posible que dos nucleótidos que tuvieran complementariedad, se puedan unir de diferente manera que al inicio y de lugar a una forma de hélice rara. (Por eso es importante que este proceso sea guiado). Localización celular En el núcleo de las células eucariotas el ADN se encuentra unido a proteínas (las histonas) formando la cromatina. La doble hélice de ADN se enrolla alrededor de octámeros de histonas (proteínas) formando los nucleosomas (unidad fundamental de la cromatina). La resultante (en forma de “collar de cuentas”) se pliega sobre sí misma en hélice (en forma de “muelle”) formando una estructura conocida como solenoide. Esta hélice se vuelve a plegar sobre sí misma formando un bucle. En sucesivos niveles de compactación, los bucles de cromatina se van asociando a proteínas que van a funcionar como “esqueleto” hasta alcanzar el estado de empaquetamiento más denso que constituye el cromosoma metafásico. En los orgánulos intracelulares, mitocondrias y cloroplastos, de las células eucariotas y en las células procariotas, la molécula de ADN es circular y no está unida a proteínas. La estructura del ARN El grupo azúcar en la molécula de ARN es la ribosa. La timina se sustituye por el uracilo Las moléculas de ARN son por lo general monocatenarias El grupo OH de la ribosa confiere dos propiedades fundamentales a la molécula:
- Impide la conformación B
- Promueve la reacción química Tipos de ARN ARN mensajero: transporta la información genética del ADN a los ribosomas responsables de la síntesis de proteínas. ARN ribosómico: es parte constitutiva de los ribosomas y representa un 75% del ARN total celular. ARN de transferencia: transporta los residuos de aa que se van adicionando a las cadenas polipeptídicas durante la síntesis de proteínas. ARN nuclear pequeño: pequeñas moléculas de ARN de localización nuclear que participan principalmente en la maduración del ARNm. Nucleasas y enzimas de restricción Las nucleasas son enzimas que hidrolizan (descompone sus elementos mediante la adicción del agua) los enlaces fosfodiéster en los ácidos nucleicos se pueden clasificar en: Ribonucleasas (ARNsas): específicas de ARN. Desoxirribonucleasas (ADNsas): específicas de ADN. También pueden clasificarse según la localización del enlace que va a romper la enzima: Exonucleasas: se unen a un extremo 5’ o 3’ terminal y van separando los nucleótidos uno a uno. Endonucleasas: actúan en posiciones internas dentro de la molécula.
Se produce el desenrollamiento y la apertura de la doble hélice: una enzima llamada helicasa rompe (sentido 5’🡪3’) los enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de la doble hebra de ADN y las separa (las helicasas no pueden iniciar el desenrollamiento del DNA bicatenario. Son las proteínas iniciadoras las que separan las cadenas). Por otro lado, interviene la enzima topoisomerasa (girasa) , la cual evita las tensiones que se producen en el desenrollamiento de la cadena de ADN. En el lugar de origen de la replicación, se forman unas burbujas de replicación en las que hay dos zonas con forma de Y, llamadas horquillas de replicación , donde se van a sintetizar las nuevas hebras de ADN y que se extienden en los dos sentidos ( bidireccional ). En procarióticos los cromosomas tienen un único origen de replicación (llamado OriC) al que se unen numerosas proteínas DnaA (proteínas iniciadoras) iniciando la separación de hebras, mientras que en eucarióticos los cromosomas, debido a su longitud, presentan múltiples orígenes de replicación (si no, tardaría mucho tiempo en completarse). Desenrollamiento. Las proteínas implicadas en la síntesis de una y otra hebra (en cada horquilla de replicación) se encuentran formando un complejo proteico denominado replisoma que contiene un primosoma (primasa-RNApol + helicasa), necesario para iniciar cada fragmento de Okazaki, y dos holoenzimas ADN pol III, una de las cuales sintetiza la hebra conductora y la otra, junto con el primosoma, sintetiza la hebra retardada. La helicasa desenrolla el ADN uniéndose al molde de la cadena retrasada en cada horquilla de replicación y se desplaza en dirección 5’🡪 3’. El tetrámero de SSB (proteínas de unión a la cadena simple que vitan que se cierre la horquilla de replicación abierta por la helicasa) estabiliza el ADN monocatenario (cada tetrámero abarca de 35 a 65 nucleótidos). La ADN girasa soluciona la tensión que originan las helicasas por el desenrollamiento del ADN (alivia la tensión por detrás y delante de la horquilla de replicación) para ello cortan las hebras y, una vez eliminadas las tensiones, las vuelven a empalmar (esta acción requiere de ATP). Elongación. Las grandes protagonistas de esta fase son las enzimas ADN polimerasas que actúan recorriendo la hebra molde, seleccionando el desoxirribonucleótido cuya base es complementaria con dicha hebra y uniendo entre sí los nuevos nucleótidos. También realizan la función de eliminar nucleótidos cuyas bases están mal apareadas, es decir, tienen actividad exonucleasas (Cuando se da cuenta de que tiene que corregir y ya se ha pasado del nucleótido que está defectuoso porque va muy rápido, es decir, ya ha puesto varios cuando se da cuenta de que hay uno que está defectuoso, en ese momento para y quita los nucleótidos que ha puesto hasta llegar al que está mal, cambiarlo y seguir poniendo nucleótidos, esto ocurre gracias a la exonucleasa 3’🡪5’). Es por ello que tienen una importante función de corrección de errores. En cada horquilla de replicación se fabrica una hebra adelantada y una retrasada, sintetizadas de forma simultánea. Sea cual sea la hebra, la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de una nueva cadena de ADN desde 0. Necesita un fragmento de unos diez nucleótidos de ARN, llamado cebador/primer que es sintetizado por una ARN polimerasa , llamada primasa. Una vez comenzada la síntesis, la propia cadena de ADN sintetizada actúa
como cebador. (La primasa (RNA pol) sintetiza segmentos cortos de nucleótidos de RNA y proporciona un grupo 3’- OH al que la DNA polimerasa III puede añadir nucleótidos de DNA). La ADN polimerasa recorre las hebras molde en el sentido 3’-> 5’ por lo que las nuevas hebras formadas crecen en el sentido 5’-> 3’. Como las dos cadenas de ADN son antiparalelas, habrá variaciones en la elongación en función de la hebra de la que se trate: Hebra conductora, líder o adelantada: Se sintetiza de manera continua y requiere un único ARN cebador. Hebra retrasada o retardada : La síntesis se hace de manera discontinua conforme se va abriendo la horquilla y requiere muchos ARN cebadores. Se produce la síntesis discontinua de pequeños fragmentos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki , que requiere cada cierto intervalo de ADN, de un cebador de ARN sintetizado por la primasa. Finalmente, la ADN ligasa se encarga de soldar todos los fragmentos obtenidos para completar la síntesis de esta hebra. (Lo que hacemos es avanzar y construir a pedazos, voy hacia delante para poder ir hacia atrás, se colocan pequeños pedazos de cebador o primer creando la hebra retardada, la cual va más despacio porque se tiene que desanclar y anclar para poder acceder a los otros cebadores e ir así en la dirección 3’5’ ya que la polimerasa no puede hacerlo directamente, los fragmentos de Okazaki luego son retirados por la polimerasa lll.) En procarióticos existen 3 tipos de ADN polimerasa mientras que en eucarióticos hay hasta 5 tipos , que se reparten las tareas de elongación y corrección de errores: la ADN polimerasa lll lleva a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN durante la replicación y, posteriormente, interviene la ADN polimerasa l , que va a retirar los fragmentos de ARN del cebador y los va a sustituir por ADN. En procarióticos podemos destacar que el tamaño de los fragmentos de Okazaki es de 1000 a 2000 nucleótidos mientras que en eucarióticos es de 100 a 200 así como la velocidad de elongación es más lenta en eucarióticos. DNA Pol I funciona para escindir los fragmentos de RNA, DNApol II ha sido implicada en la reparación del DNA y DNApol III ha sido relacionada con la elongación del ADN (replicasa). Más tarde se descubrieron la DNApol IV y V, implicadas también en la reparación del DNA. Una polimerasa tiene actividad polimerasa 5´-3´no es como tal una actividad, porque cuando yo añado un nucleótido a una hebra, lo que estoy haciendo es una unión de un enlace fosfodiéster (esta actividad realmente se llama actividad pirofosfatasa, cualquier polimerasa tendrá esta actividad) Cada nucleótido que coloco siempre tienen que ser trifosfato y siempre se liberan dos grupos fosfato). Es un proceso muy caro energéticamente hablando. Actividad ADN polimerasa III: Sintetiza ADN mediante adición nucleótido a nucleótido al extremo 3’ terminal de la cadena creciente. El sustrato entrante es un desoxinucleósido 5’-trifosfato (dNTP) cuya identidad está determinada por el apareamiento de bases. La ADN polimerasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster 5’ 🡪 3’ entre en dNTP entrante y la cadena creciente. Una vez liberado el pirofosfato, la DNA pol III avanza un residuo, se une a un nuevo nt y así elonga la cadena nucleótido a nucleótido. Traslado de una mella en el ADN polimerasa I: La función principal de la ADN pol I es eliminar el ARN cebador y reemplazarlo por ADN en la síntesis del ADN de la hebra retardada. En este proceso actúan de forma concertada las actividades 5’🡪3’ exonucleasa y polimerasa de la pol I. Recibe el nombre de desplazamiento de mella porque la mella se desplaza hacia el extremo 3’. Esta reacción consiste en la eliminación de ribonucleótidos del extremo 5’ del cebador acoplada con la extensión simultánea del extremo 3’ del fragmento de Okazaki precedente mediante la incorporación de desoxirribonucleótidos. La Pol I tiene funciones indispensables en la replicación y la reparación del ADN dañado, aunque no es responsable de la mayoría de síntesis de ADN. La ADN ligasa une los huecos creados por la eliminación de los RNA cebadores en la hebra retardada. El paso final en la maduración de la hebra de DNA recién sintetizada es la formación de los enlaces fosfodiéster entre los fragmentos de Okazaki. Una vez eliminados todos los ribonucleótidos, la DNApol I topa con una estructura que no puede cerrar, es decir, una mella en la que hay un extremo 3´hidroxilo del último nt añadido por la DNApol I y otro 5
