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Lección 1. Los virus. Características generales.
Esquema del tema:
- Desarrollo histórico de la virología.
- Características diferenciales de los virus.
- Componentes de las partículas víricas. Ácido nucleico. La cápside. La envoltura.
- Generalidades sobre la multiplicación de virus.
- Introducción a la taxonomía de virus. 1. Desarrollo histórico de la virología.
La Virología es la materia que se ocupa del estudio de los virus. Es interesante su estudio en Farmacia por:
- Importancia clínica de estos seres. Son los causantes de numerosas enfermedades. Los virus son importantes herramientas en investigación. Utilizando virus se ha avanzado en la Biología Molecular, conocimiento de genes, de mecanismos de replicación, trascripción, ác. nucleicos, etc. Los genomas de los virus son muy usados en Ingeniería Genética como vectores para transferir genes de unos individuos a otros.
- Tienen importancia biológica. Todos los seres vivos del planeta tienen virus que los parasitan.
La virología como ciencia existía desde la antigüedad, aunque no se conocía el origen de las enfermedades infecciosas, sí que se conocían enfermedades como la Polio (poliomielitis), la rabia y la viruela. Hoy sabemos que estas enfermedades está ocasionadas por virus. También se intentaba controlar algunas de estas enfermedades de forma empírica.
Así, en China y algunos otros países, existía la costumbre de que las madres, para proteger a sus hijos de la viruela, inoculaban costras de enfermos de viruela. Esta práctica fue observada en Turquía por M. Montague ( 1721 ), quien la introdujo en Inglaterra y de esta forma muchas personas quedaban protegidos, pero otras seguían muriendo, por lo que esta práctica dejo de utilizarse.
En 1798 , el médico inglés E. Jenner , observó que las personas en contacto con ganado vacuno, a veces resultaba infectados por una forma de viruela que era muy benigna (la persona no moría) y éstas personas luego no padecían la viruela humana. Entonces comenzó a inocular a las personas con material procedente de pústulas de vacas enfermas de viruela vacuna, inventando la VACUNACIÓN.
El descubrimiento de los virus se atribuye a dos científicos: Ivanowski ( 1892 ) y Beijerinck ( 1898 ). Estos científicos descubrieron los virus de forma independiente. Trabajaban con plantas de tabaco que tenían una enfermedad llamada mosaico (las hojas tienen zonas con diversos colores), e intentaban averiguar el origen. Hacían extractos con las plantas infectadas, los cuales se hacían pasar por unos filtros que retenían los microorganismos conocidos hasta entonces (bacterias, hongos, protozoos, etc), con la esperanza de que los agentes causantes del mosaico quedaran retenidos en el filtro. Pero se comprobó que el agente pasaba los filtros ya que al inocular el filtrado en plantas sanas, éstas enfermaban. Estos autores dedujeron que el mosaico del tabaco (VMT) estaba producido por un agente muy pequeño que atravesaban los filtros y los denominaron VIRUS FILTRABLES (que viene de veneno).
El descubrimiento de los virus filtrables en animales lo hicieron en 1898 los científicos Loeffler y Frosch , dando a conocer los virus de la glosopeda de las vacas. El descubrimiento de virus en el hombre, lo hizo Walter Reed en 1900 , en personas infectadas con la fiebre amarilla. A partir de este hecho, se fueron descubriendo nuevos virus filtrables. En el año 1916 , Twort , y en 1917 , D'Herelle , descubrieron virus en
bacterias.
Todavía no se sabía cómo eran esos seres, hasta que en 1935, Stanley cristaliza el virus del mosaico del tabaco (por una técnica que cristalizaba proteínas). Entonces dedujo que los virus filtrables estaban formados solo por proteínas. Pero dos años más tarde, en 1937, Bawder y Pirie , determinaron que además de proteínas tenían ác. nucleico, siendo en el caso del VMT el ARN.
En 1940 , Delbruck descubrió cómo era el ciclo de multiplicación de los virus bacterianos. Se sabía que no podían crecer en medios de cultivo normales, pero sí que lo hacían en seres vivos. Entonces, al estudiar el ciclo, se vio que los virus necesitaban crecer dentro de las células. Más tarde se estudió en virus de células animales, haciendo cultivos de virus en células animales.
2. Características diferenciales de los virus.
En los comienzos de la virología, los virus se definían en términos negativos:
- No eran retenidos por filtros que retenían microorganismos conocidos.
- No eran visibles al microscopio óptico.
- No se podían cultivar en medios de cultivo tradicionales para bacterias.
Estas características, sin embargo, o no son del todo ciertas o no son exclusivas. Se han desarrollado filtros que son capaces de retener a virus (y sustancias más pequeñas). El tamaño de los virus es pequeño 25−300nm. Algunos se pueden ver al microscopio óptico (como el virus de la viruela). Hay virus que son más grandes que algunas bacterias, como el de la viruela, que es más grande que las clamidias. Los virus necesitan ser cultivados en células vivas. También existen microorganismos que también tienen que ser cultivados sobre células vivas.
Los virus, se definen por dos características fundamentales:
A. Organización.
Los virus no son seres celulares. Son diferentes de los organismos celulares, no tienen organización ni eucariota ni procariota. Las partículas virales constan de un genoma formado por DNA o RNA (nunca por ambos), una cubierta proteica llamada cápside y en ocasiones por una envoltura membranosa.
B. Ciclo de multiplicación.
Los virus sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas. No pueden sintetizar ATP ni proteínas, ya que no poseen las estructuras necesarias para esta síntesis. Entonces, los virus son parásitos intracelulares obligados. El ciclo de multiplicación se diferencia en dos etapas:
- Extracelular. Fuera de la célula hospedadora.
- Intracelular. Dentro de la célula hospedadora.
A la partícula viral en estado extracelular se la denomina normalmente virión. Un virión es una partícula viral completa, es decir, con ác. nucleico y cubierta protectora.
El término virus es más amplio que el de virión, ya que se aplica a todas las entidades virales presentes durante todo el ciclo de multiplicación (intra y extracelular).
Cuando los viriones (enteros o en parte) penetran en el interior de la célula hospedadora, comienza la fase intracelular y la multiplicación del virus. Normalmente el genoma queda libre de las cubiertas protectoras, y
- Helicoidales. La cápside es un cilindro hueco.
- Complejos. Tienen diferentes estructuras anejas a la cápside (cola,..).
Los virus con envoltura se diferenciar también en tres tipos:
- Icosaédricos.
- Helicoidales.
- Complejos.
A. Ácido nucleico.
Los virus son muy variables en cuanto a la naturaleza de su material genético. El material genético presente en el virión es RNA o DNA, pero nunca ambos a la vez.
Existen unos virus que pueden usar tanto RNA como DNA como material genético, pero en diferentes fases del ciclo de multiplicación. P. ej. retrovirus (los viriones tienen RNA, pero se replica el genoma a partir de una forma intermedia de DNA), hepatitis B (tiene DNA dentro del virión pero en la replicación del genoma se usa RNA como forma intermedia).
Tanto se trata de DNA como de RNA, el material genético del virus lleva la información necesaria para la replicación del virus y formación de nuevos viriones.
El tamaño del genoma de los virus es muy variable, los más pequeños tienen 3 ó 4 genes, mientras que los más complejos pueden tener varios cientos. En general, los virus son haploides, sólo tienen una sola copia del genoma, pero existen casos de retrovirus cuyo genoma está constituido por dos fragmentos de DNA iguales, lo que les hace diploides. Si existen varios fragmentos de material genético pero que son diferentes, son haploides.
1. DNA viral.
En algunos casos puede ser de cadena sencilla, monocatenario, aunque en la mayoría de los virus con
DNA, es de cadena doble.
- El DNA de cadena sencilla, puede ser:
De cadena lineal. Como los virus animales (p. ej. Parvovirus ).
De cadena circular. Como X174 (virus de bacteria).
- El DNA de cadena doble puede ser:
De cadena lineal. Como los Herpesvirus.
De cadena circular. Como los Papovavirus.
En ocasiones, primero es lineal y luego se vuelve circular, como en el caso del virus (lambda).
2. RNA viral.
La mayoría tiene una cadena sencilla de RNA. Sólo algunos tienen cadena doble. En la mayoría de los casos, es lineal, siendo muy pocos casos aislados los de cadena circular.
El RNA de cadena sencilla o doble tiene información para la síntesis de nuevos virus. Este concepto se descubrió por primera vez en el VMT. En los años `50 , trabajando con este virus se descubrió que al purificar el RNA de cadena sencilla de este virus e introducirlo en células de plantas sanas, el virus se reproduce, creándose nuevos virus. Posteriormente se descubrió que en otros virus RNA, al purificar el RNA no se conseguía infectar otras células y producir nuevos virus. Estos experimentos llevaron a la división de los virus RNA de cadena sencilla en dos grupos:
Virus RNA de cadena positiva (RNA +). Son aquellos en los que el RNA purificado es capaz de infectar a las células con producción de nuevos virus. Esto se debe a que el RNA del virus tiene la misma secuencia de bases que los RNAm, que por definición se consideran de cadena +. Entonces, el RNA puro, al penetrar en la célula, es capaz de unirse directamente a los ribosomas, actuando como mensajero y sintetizando ya proteínas víricas (enzimas y estructurales).
Virus RNA de cadena negativa (RNA −). Son aquellos que por sí solos (al estar purificados) no son capaces de infectar nuevas células y producir nuevos virus. En estos virus el RNA del genoma, tiene una secuencia de bases complementarias con los RNAm. Entonces cuando entra en la célula hospedadora, el RNA tiene que entrar acompañado de una enzima vírica que a partir del genoma sintetice RNAm.
En los virus RNA, la mayoría de los casos, el genoma está formado por una única molécula de RNA, pero hay casos de virus en los que el genoma está formado por varias moléculas de RNA (virus con genoma fragmentado o segmentado ). Esto puede darse tanto en virus de cadena sencilla (p. ej. virus de la gripe) o pueden ser varios fragmentos de RNA de cadena doble (p. ej. Reovirus ), siendo los fragmentos diferentes (entonces haploides), a excepción de retrovirus como el del SIDA (diploide).
Algunos virus de plantas tienen genoma RNA segmentado, pero los diferentes fragmentos del genoma están incluidos en cápsides diferentes, denominándose entonces virus multiparticulados, ya que el virus está formado por varias partículas. Entonces, para infectar a una célula, tiene que ser infectada por varios de estos virus a la vez.
B. Cápside.
Es una estructura que rodea y protege al genoma vírico y está formado por unas proteínas codificadas por genes del virus. Estas proteínas que forman la cápside se denominan protómeros.
Las cápsides pueden ser de 3 tipos:
- Helicoidales. − Icosaédricas. − Complejas. 1. Helicoidales.
Son las más sencilla de todas. Están formadas por un sólo tipo de protómero que se va enrrollando, formando un tubo hueco. Las proteínas se enrrollan en forma de hélice. En el centro queda un espacio para que se sitúe el genoma del virus.
Estas cápsides, en el caso de virus desnudos, son rígidas (p. ej. VMT), mientras que en los que tienen envoltura, son flexibles y se pliegan en el interior de la envoltura.
2. Icosaédricas.
Estas cápsides tienen como estructura básica un cuerpo geométrico que es el icosaedro , que tiene 20 caras triangulares y 12 aristas. En virus sencillo, la cápside es un icosaedro como tal, pero en los más complejos, cada cara triangular se divide en otra serie de triángulos. Las proteínas de la cápside se agrupan para formar
Existen virus que en su interior contienen enzimas que están codificadas por el genoma del virus. Estas enzimas son importantes en el ciclo de multiplicación del virus, y suelen acompañar al genoma porque normalmente intervienen en su replicación. P. ej.:
En virus RNA de cadena sencilla −, y virus RNA de cadena doble tienen acompañando al genoma una RNA polimerasa dependiente de RNA, que sintetiza RNA tomando RNA como molde.
En retrovirus, en el ciclo de multiplicación, a partir del RNA que forma su genoma, se forma DNA. Este proceso lo lleva a cabo una enzima que está dentro del virión, llamada DNA polimerasa dependiente de RNA (también llamada transciptasa inversa).
Los Arenavirus llevan en su interior ribosomas de la cél. hosp., pero no se sabe si tienen función.
4. Generalidades sobre la multiplicación de virus.
Los virus deben multiplicarse dentro de células vivas. En su ciclo de multiplicación hay varias etapas:
- Unión del virión a la célula hospedadora. Entrada o penetración al interior de la célula hospedadora. Según el tipo de virus, entrará en virión entero, el genoma o parte (lo importante es que entre el genoma).
Síntesis de componentes virales. El genoma del virus, suele quedar libre dentro de la célula hospedadora y usando la maquinaria biosintética de la célula se sintetizan ác. nucleicos y proteínas (enzimas, estructurales, ...).
Ensamblaje de los componentes de los virus para formar nuevas partículas víricas (proceso también llamado maduración).
Liberación de los nuevos virus de la célula hospedadora, que ya pueden infectar otras células. Pueden producirse con o sin rotura de la célula, dependiendo de los virus.
La duración del ciclo de multiplicación es variable. En bacterias pueden durar hasta 20−25 minutos (los más rápidos). En virus que afectan a animales, normalmente son ciclos más largos, durando 5− horas. Durante el ciclo de un virus se diferencian varios períodos de tiempo:
Período de eclipse. Durante este periodo de tiempo, no se observan virus dentro de la célula. En este período se están sintetizando los diferentes componentes virales. El período de eclipse dura desde que se inicia la infección hasta que se sintetiza la primera partícula de virus.
Período de acumulación intracelular. Una vez que se ha sintetizado la primera partícula, antes de que se liberen los virus. Es el tiempo en el cual se acumulan virus dentro de la célula hospedadora. Este período finaliza cuando se comienzan a liberar virus de las células.
También se habla del período de latencia , que es el tiempo que transcurre desde la infección de una célula por un virus y la liberación de virus al medio. Por lo tanto, el período de latencia puede considerarse como la suma del período de eclipse y el período de acumulación intracelular.
5. Introducción a la taxonomía de virus.
La taxonomía de virus está poco desarrollada. Los virus se dividen según el tipo de hospedador en:
− Virus de animales. − Virus de plantas. − Virus de bacterias. − Virus de hongos.
En los comienzos de la virología, los científicos que estudiaban cada grupo, no se ponían de acuerdo. En 1966 , se creó el Comité Internacional para la Taxonomía de Virus. Este organismo intenta establecer una clasificación uniforme para todos los virus. El último informe se emitió en 1995 por Murphy & Co. Este comité ha creado una serie de grupos de virus. Para ello se ha basado en unos caracteres de los virus:
Características morfológicas y estructurales. Forma del virión, simetría de la cápside (icosaédrica, helicoidal, compleja), presencia o no de envoltura, tamaño del virión.
Características del ác. nucleico (o genoma). Tipo de ác. nucleico (DNA o RNA), cadena sencilla/doble. Los de RNA de cadena sencilla, polaridad + ó −, nº de fragmentos.
Características referentes a la multiplicación. Mecanismo de entrada del virus en la célula, localización de la multiplicación/replicación dentro de la célula, peculiaridades en transcripción y traducción de proteínas, mecanismo de salida (liberación) del virus.
Características de proteínas víricas. Número de proteínas que forman el virus (estructurales y enzimas), presencia de enzimas especiales (como la transcriptasa inversa).
Propiedades clínicas y biológicas. Tipo de hospedador (animal, planta, bacteria u hongo), tipo de enfermedad que produce, modo de transmisión de la enfermedad.
- Otras características. Propiedades inmunológicas (reacción antígeno−anticuerpo).
Estos caracteres diferencian a los virus en grupos: Orden, Familia, Subfamilia, Género y Especie. El grado de Orden está en desarrollo. Hasta 1995 sólo había uno. Se están desarrollando según el ác. nucleico.
Para nombrar estos grupos, en virus, de Orden, Familia, Subfamilia y Género, deben escribirse en cursiva o subrayados, y con la primera letra mayúscula. La Especie no se escribe ni en cursiva ni subrayado.
Cada grupo tiene una determinada terminación (sufijo):
♦Orden: −virales ♦ Familia: −viridae ( Herpesviridae ). ♦ Subfamilia: −virinae ( Alphaherpesvirinae ). ♦ Género: −virus ( Simplexvirus ). Especie: no tienen una forma determinada. Normalmente se suelen denominar en animales y plantas por el nombre de la enfermedad que producen (p. ej. virus herpes humano tipo 2), y los que infectan a bacterias con nombres alfanuméricos ( , X174, T4).
nota: A veces se puede referir a los grupos, de manera informal, sin subrayar y sin poner en cursiva. Es muy frecuente referirse a las familias terminando en −virus (p.ej. herpesvirus, poxvirus). La desventaja es que puede llevar a equívocos por no poder diferenciar entre familia y género.
Lección 2. Métodos de estudio de virus.
Esquema del tema:
- Cultivo de virus.
- Métodos de detección y cuantificación de virus.
- Métodos fisicoquímicos: ♦ Observación de virus al microscopio electrónico. ♦ Ensayos de hemaglutinación. ♦ Estudios de infectividad. ♦ Métodos inmunológicos para el estudio de virus. ♦ Detección de ác. nucleicos de virus. 1. Cultivos de virus.
Los virus se han de cultivar sobre células adecuadas. Depende del virus del que tratemos (si
siendo, entonces, diferentes que el cultivo de virus de bacterias.. En virus animales, primero se realiza el cultivo celular y luego se inoculan los virus. En ocasiones los virus animales se pueden cultivar en cultivos de órganos , en medio líquido.
Los virus de planteas se pueden cultivar sobre plantas enteras, cultivos de tejidos de plantas, cultivos de células aisladas y cultivos de protoplastos.
2. Métodos de detección y cuantificación de virus.
Se basan en considerar a los virus con diferentes propiedades:
♦ Métodos fisicoquímicos.
Se basan en detectar a los virus al microscopio electrónico, como cuerpos físicos que son, o bien, se basan en una propiedad química que tienen algunos de estos virus, que es la capacidad de aglutinar glóbulos rojos ( ensayos de hemaglutinación ).
a.1. Observación de virus al microscopio óptico. Se pueden aplicar numerosas técnicas de microscopía electrónica para observar virus. Pero en los análisis de rutina, para detectar y cuantificar virus sólo se emplean los métodos más sencillos. Los más complejos (inclusión en resinas, cortes), sólo se usan en investigación.
Tinción negativa. Consiste en mezclar una suspensión donde suponemos que están los virus, con una sal densa a los electrones, p. ej. acetato de uracilo, fosfotungstato potásico (ác. fosfotungstico). Esta mezcla se deposita en una rejilla de microscopía electrónica y se observa al microscopio electrónico de transmisión. Con esta técnica, los virus no se tiñen en realidad, sino que lo que se tiñe es el medio. Esta es la más usada porque es la más sencilla.
Sombreado. Consiste en depositar a los virus sobre una rejilla y hacer incidir sobre la misma un metal, normalmente platino, con un cierto ángulo, respecto a la rejilla. El platino, cubre a los virus, pero queda en un lado una sombra de color claro (el platino queda oscuro). Entonces al observar la rejilla, se verán los virus oscuros y la sombra clara. Entonces se observa una imagen de aspecto tridimensional.
Mediante estas dos técnicas, se puede demostrar la presencia de virus en una muestra, pero también se pueden contar, por un procedimientos especial.
El método que se utiliza para la cuantificación de virus consiste en mezclar la solución de virus que se quiere cuantificar, con unas bolas de látex. La mezcla se somete a tinción negativa o sombreado, y se cuentan en el microscopio las partículas víricas y las bolas que se observan en un campo de visión, se anota y para conocer la concentración de virus en la disolución original, se aplica una fórmula:
P. ej. Si hemos contado 300 partículas de virus y 30 bolas siendo:
a.2. Ensayo de hemaglutinación. Se basan en la capacidad que tienen diferentes virus de unirse a glóbulos rojos, incluso aunque no los infecten. Un virus es capaz de unir entre sí a 2 glóbulos rojos. Pero si hay bastantes virus en una muestra, se forman unos agregados de virus y glóbulos rojos que sedimentan con facilidad, y se produce la aglutinación de glóbulos rojos o hemaglutinación.
Si en una muestra no hay virus, o incluso si hay pocos, no se formarán estos agregados. En una muestra, si no hay virus o hay pocos, no se produce hemaglutinación, se formarán
dímeros.
En una hemaglutinación se pueden detectar virus y cuantificarlos (virus hemaglutinantes). Tenemos una muestra que queremos saber si existen virus que aglutinen glóbulos rojos. En la muestra ¿Dónde hay virus? Se añaden los glóbulos rojos y se dejan incubar. Si no hay virus o hay muy pocos, los glóbulos rojos también acaban sedimentando, pero quedan en el fondo del tubo formando un sedimento pequeño en el fondo del tubo en el centro y bien delimitado.
Si existen virus y se produce hemaglutinación, los agregados precipitan por todo el fondo del tubo y se observa, visto desde arriba, un precipitado muy fino en todo el fondo del tubo (no rueda).
Para cuantificar los virus, se realiza un ensayo en unas placas de plástico que contienen pocillos. Se realizan diluciones de la muestra en los pocillos a la mitad cada vez: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, ...
A todos los pocillos se le añade igual cantidad de glóbulos rojos. Se espera un tiempo y se observa si existe o no, hemaglutinación. Entonces se calcula la denominada dilución libre, que es la última dilución de la solución de virus en la que se observa hemaglutinación, es decir, que en la siguiente dilución no hay hemaglutinación. En fotocopia 1/128.
Los resultados se suelen expresar en título del ensayo de hemaglutinación. Se suele definir como la inversa de la dilución límite. El título de nuestro ejemplo sería 128. A mayor título indica que teníamos más virus en la solución original porque hemos tenido que diluir más hasta que no existe hemaglutinación. Un título de 256, tendría más virus que en la mezcla de nuestro ejemplo.
Los métodos fisicoquímicos de cuantificación tienen una serie de inconvenientes:
Mediante microscopía electrónica, se cuentan tanto virus con capacidad de infectar células como virus que tengan algún defecto, y no puedan infectar células o incluso cápsides vacías.
Mediante el ensayo de hemaglutinación, también se pueden detectar virus que no sean infectivos y además hay virus en los que las espículas s sueltan del virus y se pueden contar en la hemaglutinación.
♦ Estudios de infectividad.
Hay otros métodos que se pueden aplicar como los estudios de infectividad. Estos estudios de infectividad nos permiten cuantificar las partículas de virus que son capaces de causar una infección. Estos métodos son varios:
b.1. Método de formación de placas.
b.1.1. Para virus bacterianos. Nos permite cuantificar los virus presentes en una solución que infectan a una determinada cepa bacteriana. Para realizar este ensayo se parte de un tubo en que tenemos la suspensión de virus, otro tubo que contiene las bacterias hospedadoras de dicho virus y otro tubo que contiene agar fundido a unos 45−50º. En el agar se deposita una muestra de los dos tubos anteriores (virus y bacterias), se agita para mezclar y se añade todo el contenido del tubo de agar con virus y bacterias a una placa petri que ya contenía un medio de cultivo sólido, y se deja enfriar para que solidifique el agar que acabamos de añadir
realiza una curva (fotocopia) y en esta curva, en el eje de abcisas (x) se pone la dilución 10−5, 10−6, 10−7, etc, y en el eje de ordenadas (y) se pone el % de individuos, o bien infectados, o bien muertos, por cada dilución de virus. Si la solución está poco diluida todos o la mayoría de los organismos prueba estarán infectadas; y en diluciones muy altas, poco o ninguno de los organismos prueba estarán infectados.
Se calcula la dilución (una vez hecha la gráfica), que produce que el 50% de los organismos prueba están infectados y esa es la DI50. Si hemos tenido como criterio la muerte de los organismos prueba, se determina la dilución que produce la muerte del 50% de los organismos prueba y entonces tenemos la DL50 (en el ej. 10−6).
♦ Métodos inmunológicos para el estudio de un virus.
Los virus cuando se introducen en el organismo actúan como Ag e inducen la formación de Ac específicos. Las pruebas inmunológicas de detección de virus se basan en reacciones Ag−Ac. Se puede abordar el diagnóstico viral de 2 formas mediante estas pruebas:
♦Identificar un virus o Ag vírico desconocido, haciéndolos reaccionar con Ac conocidos. Detectar Ac frente a un virus en el suero del paciente. Para ello se hace reaccionar el suero problema con virus o Ag víricos conocidos.
Hay numerosos métodos inmunológicos para el diagnóstico vírico. De éstos, unos ensayos muy usados, son los ensayos inmunoenzimáticos o test de ELISA, que se utilizan tanto para identificar Ag víricos como sueros problema.
Vamos a ver 3 de estos métodos:
Inmunotransferencia de proteínas (inmunobloting). Se usa como confirmación de prueba de ELISA.
- Test de neutralización (de infectividad).
- Test de inhibición de la hemaglutinación c.1. Test de inmunotransferencia de proteínas.
Se basa en hacer reaccionar Ag y Ac sobre un papel y los Ag proteínas separadas por electroforesis. Partimos de una muestra con proteínas que se aplica a un gel de poliacrilamida. A continuación se somete el gel a electroforesis en un campo eléctrico, quedando las proteínas separadas en bandas. A continuación las proteínas se transfieren a un papel o membrana de nitrocelulosa, en unos aparatos especiales para ello. Cuando la proteína está en papel de nitrocelulosa, se añaden en papel (o membrana), un suero con Ac. Si los Ac reconocen algunas bandas de proteínas en gel, se unirá a ella. A continuación se lava porque si no existe unión Ag−Ac, se eliminan los Ac. Luego se añade a la membrana Ac secundarios (que es aquel que reconoce a otro Ac como Ag).
P. ej. Si el Ac primario es suero humano (proteínas) entonces el Ac secundario se podría obtener inyectando los Ac humanos en un animal como un conejo. Entonces el conejo reconoce como Ag a los Ac del hombre y formará antianticuerpos o Ac secundarios.
Estos Ac secundarios se unirán a los Ac primarios si están presentes y se realiza un lavado porque si no existe unión, se eliminan. Los Ac secundarios tienen que ir marcados de alguna forma, p. ej. Una enzima, con un compuesto radioactivo (lo normal es una enzima, ya que el uso de compuestos radioactivos es más problemático).
A continuación se añade el sustrato de la enzima que origina un producto coloreado. Entonces se detecta en el papel la aparición de unas bandas coloreadas.
Esto se puede aplicar para detectar Ag víricos en una muestra problema (p. ej. Para detectar virus del SIDA en una muestra). Entonces se rompen las células, las proteínas se someten a electroforesis y se sigue todo el proceso..
También se puede hacer lo contrario, intentar determinar si en un suero hay Ac frente a un virus determinado. P. ej.: si en el suero de un paciente hay Ac para el virus del SIDA. En este caso se parte de proteínas conocida del virus, se realiza todo el proceso anterior.
En el caso del SIDA, ya se venden unas membranas de nitrocelulosa con proteínas del virus ya separadas donde se realiza la prueba. Ver fotocopias.
c.2. Técnica de neutralización de la infectividad.
Estos ensayos se fundamentan en que si mezclamos un virus con Ac y éstos se unen al virus, disminuye la capacidad de los virus de infectar células.
Entonces mezclamos virus con Ac; si existe unión específica virus −Ac y añadimos todo esto a un sistema indicador (p. ej. Un organismo prueba, como plantas, embriones de pollo, cultivo de células, animales), entonces disminuimos la capacidad de los virus de infectar a éstos organismos prueba.
Si no existe unión específica (unión Virus−Ac) y se añade a un sistema indicador, entonces no queda afectada la capacidad de los virus de infectar al sistema indicador. Este método se puede realizar de dos formas:
Se puede intentar identificar un aislado vírico desconocido. P. ej. Si hemos aislado un virus y se trata del virus de la gripe, entonces lo que se hace es mezclar el virus desconocido con Ac. Conocidos, se añade al sistema indicador y se observan los resultados. Si se disminuye la capacidad infecciosa de los virus, respecto a un control (en el que no están los Ac) entonces hemos identificado al virus problema.
Por otro lado se puede intentar identificar o detectar en el suero de un paciente la presencia de Ac frente a un virus determinado. En este caso se hace reaccionar el suero problema con virus conocido (p. ej. De la gripe) y se realiza el proceso. Entonces se disminuye la capacidad infectiva, entonces se identifica.
c.2. Inhibición de hemaglutinación.
Se basa en que si hacemos reaccionar virus con Ac y se produce una unión de los virus con los Ac y se produce una unión de los virus con los Ac. Si añadimos a continuación glóbulos rojos, se produce una disminución de la capacidad de los virus de aglutinar glóbulos rojos. Si no existe unión, disminuye la capacidad de producir hemaglutinación.
Estos ensayos se realizan sólo para virus que son capaces de llevar a cabo la hemaglutinación. Sólo se usan para determinar la presencia de Ac frente a un virus en el suero de un paciente (no se usa la otra posibilidad).
♦ Detección de ácidos nucleicos.
♦ Multiplicación de los bacteriófagos.
Existe gran diversidad de estrategias de multiplicación de los fagos, pero un esquema general podría ser este:
Ahora vamos a centrarnos en dos tipos de ciclos de multiplicación, que son los más conocidos:
A. Ciclo lítico. Tomamos como ejemplo a los virus llamados Tpar (T2, T4, T6) que pertenecen a la familia Myoviridae, que son virus desnudos, con DNA de cadena doble y parásitos de E. Coli. Muchos virus bacterianos tienen un ciclo de multiplicación al que se denomina lítico porque los virus se multiplican en el interior de la bacteria ay salen de la misma matando o lisando a la célula. A éste tipo de virus con este ciclo, se les denomina virus virulentos. Vamos a tomar como ejemplo al virus T4 como característico del ciclo lítico.
