bioquimica industrial, Apuntes de Bioquímica

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BIOQUÍMICA INDUSTRIAL

TEMA 1

DEFINICIÓN

Biotecnología es equivalente a bioquímica industrial. La biotecnología y su origen se remonta a principios del siglo XX, con el ingeniero Karl Ereky. Este científico invento la biotecnología en 1917, tras pensar en como desarrollar la agricultura, mecanizarla y modernizarla, ya que se veía muy atrasada ( poca comida, pocas cosechas…) Las ciencias naturales fueron las que nos sacaron del hambre cuando se fusionaron con la tecnología gracias a este ingeniero. Desarrollo de la tecnología gracias a la ciencia. Su primer experimento fue la alimentación de cerdos únicamente a base de remolacha, aumento la actividad y producción de carne porcina. La biotecnología son todas aquellas líneas de trabajo cuyos productos son productor de materias primas complementadas con materia orgánica. Se trata de una herramienta para aumentar la producción agrícola. La Biotecnología tiene muchos significados debido a que se aplica en multitud de ciencias además de ser muy difícil determinar sus límites debido a la proliferación y avances que está sufriendo continuamente, aunque TODAS las definiciones hacen referencia a la utilización de microorganismo o agentes biológicos para la obtención de bienes y servicios y para el desarrollo de actividades científicas. Informe Spinks sobre la Biotecnología en el Reino Unido (1980): Aplicación de los organismos, sistemas o procesos biológicos por parte de las empresas de manufactura i servicios. En el 82 se cambio y se digo que es la aplicación de los principios científicos y de ingeniería en la transformación de materiales mediante agentes biológicos para la producción de bienes y servicios.

1989. Integración de ciencias naturales e ingeniería para la aplicación de organismos , células parte de ellas y análogos moleculares en productos y servicios. FAO en el 2000 dice que toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos de usos específicos.

HISTORIA

Apareció antes de lo que pensamos. Hubo varias ERAS. Época empírica, pre-­‐Pasteur , las cosas se hacían pero no se sabia bien lo que estaba pasando. Era Pasteur, se llega a observar el microorganismo, Pasteur fue el que observo por el microscopio los diferentes organismos. Era de los antibióticos. Era de la Biotecnología moderna, post-­‐ antibióticos. Aa, proteínas unicelulares, enzimas (detergentes) , gasoil, cultivos celulares… empezamos a utilizar todo esto. -­‐Proteína unicelular, enmascara microorganismos derivados del petróleo. Era biotecnológica o Ingeniería Genética. Aparece el DNA recombinante, se descubre la insulina humana en E. coli., la PCR, secuenciación automática, hibridomas etc. El pilar de la evolución BIOTECNOLÓGICA es la aparición del DNA recombinante. 9 6000 a.C.: Elaboración de cerveza por Sumerios y Babilonios 9 4000 a.C.: Elaboración de pan y vino Egipcios 9 1400: Destilación de licores en China, Brandy en Francia 9 1687: Descripción de microorganismos (Leeuwenhoek) ¾ Epoca empírica Era pre-Pasteur (antes de 1865) Historia de la Biotecnología Epoca científica Era Pasteur (1865-1940) 9 1883: Primer cultivo puro de levadura cervecera (Hansen) 9 1873: Levaduras y fermentación (Pasteur) 9 1897: Descubrimiento de las enzimas (Buchner) 9 1914: Producción microbiana de glicerol (Carl Neuberg, fermentación gliceropirúvica) y acetona (Chain Weizman, fermentación butanol-acetona) Historia de la Biotecnología 9 1942: Producción industrial de la penicilina (Florey y Chain) Era de los antibióticos (1940-1960) 9 Vacunas contra virus 9 1944: Estreptomicina (S. A. Walksman) 9 1928: Descubrimiento de la penicilina (Fleming) 9 Gran variedad de antibióticos 9 Tecnología de la estructura de la célula animal 9 Transformaciones microbiológicas de esteroides 9 Tecnología de la fermentación sumergida Historia de la Biotecnología Historia de la Biotecnología Biotecnología moderna Era post-antibióticos (1960-1975) 9 Aminoácidos 9 Proteína unicelular (SCP) 9 Enzimas (detergentes) 9 Tecnología de células y enzimas inmovilizados 9 Tratamiento anaeróbico de aguas residuales 9 Polisacáridos bacterianos 9 Gasohol 9 Diseño de fermentadores con sistemas de Agitación, aireación y termorregulación 9 Inmovilización de enzimas y células 9 Mejora genética de cepas 9 Cultivo de células 9 1973: Tecnología del DNA recombinantes (Stanley Cohn y Herber Boyer) 9 Tecnología de hibridomas: anticuerpos monoclonales 9 Kits de diagnóstico basados en anticuerpos monoclonales 9 1974: Ingeniería genética 9 Vacunas 9 1978: Insulina humana en E. coli (Genentech) 9 1988: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 9 Secuenciación automática del ADN 9 1996: Fármacos sintetizados mediante ingeniería genética Era de la nueva biotecnologia Ingeniería genética (1970- ) Historia de la Biotecnología

TEMA 2-­‐ IMP ECONOMICA BIOTEC

Siempre se considere un sector de riesgo para la inversión.

Sectores industrial

Hay muchos sectores que se pueden aprovechar de la biotecnología, tanto el sector químico, como el farmacéutico, alimentario y agropecuario. La tabla inferior hace una comparación entre los países mas influyentes y mayores inversores en biotecnología, con cuantas compañías y empleados cuentan y cuantas de ellas son publicas , estos países son los que mayor porcentaje destinan a investigación y desenvolvimiento. Por el momento la mayor potencia mundial biotecnológica es EEUU.

Sectors industrials

Química Alimentació Energia Medi ambient Farmàcia Sanitat Animal Agricultura Ramaderia

BIOTECNOLOGIA

Etanol Acetona-butanol Àcids orgànics i aminoàcids Enzims en química fina Biopolímers Extracció de metalls Aliments i begudes fermentats Proteïna unicel·lular Additius alimentaris Antibiòtics Vitamines Hormones Enzims Anticossos monoclonals Vacunes Reactius diagnòstic Teràpia gènica Tractament aigües Aprofitament residus Extracció petroli Biocombustibles Adobs Pesticides Pinsos Llavors Transgènics

Desarrollo farmacológico

En el desarrollo de un fármaco hay un proceso que es largo y costoso, es un proceso que puede llevar hasta 12 años. Cuando un producto farmacéutico nuevo sale al mercado hay un coste de unos 1000 millones de dólares. La patente es indispensable, por lo que las empresas apuran por obtenerla una vez sacan el producto, de todos modos el beneficio no llega hasta 5 años después del lanzamiento, algunas veces hay q buscar estrategias antes de que expire la patente. De lo que consideramos biofármacos, hay mas de doscientos aprobados y mas de 400 en fase clínica.

Innovation gap

Cada vez desarrollar un fármaco es más complicado y mas costoso, aunque la tecnología e innovación avancen, se observa que el desarrollo farmacológico de nuevos fármacos y la aparición de estos no varia a lo largo de los años, aparecen cada año aproximadamente el mismo numero de nuevos fármacos, esto se debe al largo y costoso periodo de desarrollo. Se crea entonces el denominado innovation gap, que cada vez es mas grande. Muchos medicamentos se encuentran a punto de expirar, estas empresas buscan entonces una estrategia que les permita continuar con el mismo numero de ventas, cuando la patente expira, hay una caída de ventas.

Valor añadido

Representa el coste adicional que el producto ha tenido para la empresa por la inversión en investigación y repercute en el precio que habrá que pagar por el producto. En la imagen izquierda tenemos la relación entre Metà Etanol Biomassa Pinsos Tractament aigües Àcids orgànics i aminoàcids Productes alimentaris Llevat panificació Acetona-butanol Biopolímers Extracció metalls Llavors transgèniques Antibiòtics Vitamines Hormones Enzims Vacunes Reactius diagnòstic Volum de producció vs valor afegit VOLUM VALOR AFEGIT

NOVARTIS

Novartis es una de las grandes empresas farmacéuticas, segunda potencia mundial, y es resultado de la fusión de muchos ámbitos empresariales, genero diversos satélites de la empresa general. Algunas de las pequeñas empresas absorbidas son de origen universitario, las spin-­‐off, empresas que vieron que tenían un producto que en el momento en que se patentase podrían comercializarlo. Hay otras empresas que se dedican aa captar capital para dejarlo en los spin-­‐off como la AB biotics de la autónoma.

MATERIA PRIMA TEMA 3

A partir de ella obtenemos nuestro producto. Dentro de la materia prima deberemos diferenciar entre nutrientes y sustratos. Decimos nutrientes cuando estamos usando como agentes biotransformantes, catalizadores los microorganismos mientras que cuando hacemos referencia a sustrato lo hacemos cuando utilizamos enzimas, aunque también microorganismos. Lo mas importante es no denominar a los enzimas nutrientes. El mismo nutriente puede utilizarse para diferentes tipos de microorganismos y para la obtención de diferentes productos, mientras que el sustrato da lugar a producto cuando contamos con un enzima que lo cataliza, reacción mas especifica, cada enzima tiene un sustrato para dar un producto concreto ( solo los enzimas) El origen de la materia prima puede ser natural, agricultura y explotación forestal etc. , subproductos, son los deshechos de la actividad humana ( reciclado) y derivados del petróleo que por ejemplo son las reservas fósiles. Derivados del petróleo, con intereses farmacéuticos y médicos, para la obtención de fármacos y medicamentos es necesaria la biotecnología. Materia prima Agente Biológico Productes Producto final Pretratamiento Upstream processing Procesamiento Downstream processing Normalmente, microorganismos: bacterias, hongos, levadura, algas unicelulares, protozoos. Nutrientes Substratos Materia prima Células Enzimas Materia prima Derivados de Natural Subproductos petróleo Agricultura Explotación forestal Reciclados derivados de la actividad humana Reservas fósiles

BIOCATÁLISIS TEMA 4

Proceso de transformación de la materia prima a producto utilizando catalizadores biológicos. Estos biocatalizadores pueden ser enzimas , anticuerpos catalíticos, RNA catalítico y células enteras. Si no tenemos disposición de biocatalizadores debemos de recurrir a una excepción, la catálisis química cuyo mayor inconveniente es la quiralidad de las moléculas. Aquí tenemos en cuenta un proceso químico. En la catálisis química obtenemos dos enantiómeros (isómeros) , SIEMPRE obtenemos las dos moléculas, los dos enantiómeros, ya que los catalizadores químicos no pueden distinguir entre ambas moléculas, obtenemos la mezcla racémica en nuestro tubo, de modo que debemos de separarlos, no podemos suministrar las dos moléculas a nuestro ‘’paciente’’. Sin embargo los biocatalizadores si pueden distinguir entre las dos moléculas. Ejemplo del limoneno , este tiene dos enantiómeros, en la catálisis química se generan ambas, el L limoneno huele a limón, y el D limoneno huele a naranja. Otro ejemplo es el thalidomina , hay R y L , un fármaco contra los vómitos, se administró la mezcla y se comprobó que el R tenía el efecto deseado en las pacientes, mientras que el L causaba problemas. No se debe administrar la mezcla. ELEMENTOS DEL PROCESO BIOTECNOLÓGICO Agente Biológico Productos Producto final Pretratamiento Upstream processing Procesamiento Downstream processing Biorreactor Normalmente, microorganismos: bacterias, hongos, levadura, algas unicelulares, protozoos. Nutrientes Substratos Materia prima Células Enzimas Si no se dispone del catalizador biológico L Quiralidad Catálisis química Inconvenientes ( R )-Limonene (L)-Limonene ™ Limonene L-Thalidomide R-Thalidomide ™ Thalidomide

Hay algunos enantiómeros que tienen diferentes efectos, puede que ambos tengan efectos positivos, pero para distintos problemas. Por tanto para obtener solo uno de los enantiómeros debemos de sintetizar un catalizador químico que sea QUIRAL ( asimétrico) que sintetice solo el enantiómero que nos interesa. Un catalizador asimétrico que conllevó un premio nobel es el que generan la L-­‐ DOPA , una molécula utilizada como tratamiento para el párkinson. La L-­‐DOPA tiene todos sus radicales diferentes, asimétrico en los dos fosfatos, solo acepta un tipo de enantiómero, si no fuese asimétrico, tendríamos como resultado el aminoácido en la forma D y en la forma L, en este caso obtenemos solo la forma L-­‐DOPA. à premio nobel.

CARACTERISTICAS DE LOS ENZIMAS COMO BIOCATALIZADORES

Eficiencia en comparación con los agentes químicos son mucho más efectivos. Hasta

Selectividad Pueden distinguir ( sobretodo la más importante) entre enantiómeros, también entre dos componentes diferentes en una reacción. Hay una mayor cantidad de sustrato a utilizar. Versatilidad Para cada reacción de síntesis orgánica, existe un equivalente enzimático. Para obtener este enzima, o creamos un análogo o modificamos un enzima conocido con una función similar. Suavidad las reacciones enzimática se realizan en condiciones normales, no necesitan condiciones extremas de pH, T, presión… Necesitamos pH neutro, presión atmosférica, solución acuosa y T ambiente. Sin embargo las reacciones químicas si que necesitan condiciones extremas para realizar la reacción. Knowles exchanged the non-chiral phosphine triphenylphosphine in A to the chiral phosphine B and obtained a catalyst for asymmetric hydrogenation. Purificación de los enantiomeros In this industrial synthesis of L-DOPA developed by Knowles and co- workers the compound C was used as the starting material. In the chiral hydrogenation one of the enantiomers of DiPAMP was used. The enantiomer D was 97.5% of the product and after acid hydrolysis of D, L-DOPA was obtained.

CRITERIOS DE EFICACIA DEL PROCESO

Eficiencia , debemos averiguar la productividad del catalizador. Según los valores TON y TOF. TON = cantidad de producto/ cantidad de catalizador, si la cantidad de producto es menor que la de catalizador, es poco eficiente nuestro proceso, cuanto menor enzima utilicemos para cierta cantidad de producto mejor, cuanto mayor sea ton mejor eficiencia TOF = TON/ tiempo , cuanto menor es el tiempo significa que el enzima es mas eficiente. Cuanto mas ciclos de reacción haga un enzima en menor tiempo, mejor. Rendimiento del producto X = grado de conversión = cant. de sustrato transformado/ cant. De sustrato introducido. σ = selectividad = cant. De producto deseado/cantidad de producto indeseable o secundario Y= X ·∙ σ à Muy inferior al 100% es inaceptable económica y ecológicamente [P] = [S] 0 ·∙ X ·∙ σ = [S] 0 Y

ENZIMAS EN DISOLVENTES ORGÁNICOS

La mayoría de enzimas trabajan en solución acuosa, se está investigando si se puede utilizar solventes orgánicos en los procesos de forma que el enzima trabaje de igual manera. Debido a la insolubilidad de algunos reactivos en solución acuosa Cuando disolvemos una reacción enzimática en condiciones orgánicas el enzima esta en suspensión, no en disolución facilitando mucho su extracción. Algunos enzimas son mas estables en medios orgánicos que en acuosos. Dependiendo del medio en medio orgánico, el enzima adopta un comportamiento u otro en cuanto a especificidad y selectividad mientras que en el agua no. Cuanto mas pueda evolucionar un enzima mejor, ya que así podremos ahorrar ya que podremos modificar un mismo enzima para diferentes experimentos

ESTRATEGIA DE DESARROLLO DE ENZIMAS EFICIENTES

Debemos ver todas las posibilidades que nos permitan obtener el mayor rendimiento del producto.

Cuanta menor afinidad tiene el enzima con el sustrato mejor. Si el enzima tiene mucha afinidad puede llegar a una inhibición del primero. Cuanta menos afinidad mejor para la obtención del producto. Lo más importante es que la actividad catalítica sea mayor. Acerca del enzima debemos saber si lo conocemos, su nivel de actividad, su estabilidad, si es viable y si es desarrollable. Aquí entramos en la selección de nuestro enzima. Podemos, desde un mismo enzima, someterlo a diferentes mutaciones y seleccionar aquella cepa con las mejores condiciones. Podemos modificar su estabilidad, actividad, viabilidad etc. Por ejemplo podemos hacer una mutagénesis dirigida en cisteínas en una molécula modificando su estabilidad. Las condiciones de la reacción son importantes, sobretodo económicamente. Debemos saber si nuestro enzima es viable, si necesitamos cofactor, si este se puede regenerar o no, por ejemplo una deshidrogenasa, que puede regenerarse. Aà B NADH + H -­‐> NAD+ -­‐> NADH + H C à D Aquí en NADH se regenera y se recicla para dos procesos acoplados, en la Aà B gastamos NADH + H y en la Cà D lo regeneramos de nuevo. Nuestro producto final estará finalmente mezclado con muchos otros elementos de reacción por lo tanto debemos proceder a la purificación de nuestro producto final.

ENZIMAS EN LA INDUSTRIA TEXTIL

La industria textil se centra en eliminar fibras de tela que puedan salirse de su lugar, distorsionar la fibra para formar rizos, mejorar la textura, dando suavidad y brío, generar efecto lavado en la tela tejana.

FABRICACION DE PAPEL

Para obtener la pasta que dará el papel utilizamos diferentes enzimas. Síntesis del edulcorante Aspartamo D-L-Asp-L-Phe.OCH 3 Aspartame H2/cat. D/L-Phe.OCH 3 BOC=Benzyloxycarbonyl BOC-L-Aspartame Fumaric acid NH 3 L-Asp BOC-L-Asp BOC-L-Asp benzylchloroformate D E (^) D D D E E E Enzimas en la producción del papel

FORMACION DE DETERGENTES

Enzimas en estos detergentes para mejorar la eficiencia de estos detergentes, como en detergentes para el lavado por ejemplo. Les lipases per exemple s’afegeixen als detergents per a que tinguin major capacitat de degradació. Aquí veiem alguns avantatges. Primerament reduirà la temperatura de cara a rentar, ja que els enzims actuen eficientment a temperatures moderades. D’aquesta manera s’estalvia energia. A més millora la eficàcia del rentat i implica una reducció de costos.

PRODUCCION DE FÁRMACOS

Se utilizan sobretodo anticuerpos catalíticos. Para producir estos anticuerpos catalíticos tenemos un sustrato, cuyo estado de transición sabemos su conformación y características, generamos entonces una molécula idéntica al estado de transición. Los anticuerpos catalíticos se generan a partir del estado de transición del sustrato, generamos un análogo de este, que inyectaremos en un animal que generará anti-­‐cuerpos que actuarán contra esta molécula exógena que generamos como análogo, luego los Ventajas de la utilización de enzimas en detergentes ¾ Reducción del tiempo del lavado ¾ Reducción de la temparatura ¾ Mejora la eficacia del lavado ¾ Reducción de los costes 9 Reducción de la temperatura de 95 a 40ºC 70% de Reducción en energía Análogo del estado de transición que se puede utilizar para producir anticuerpos que pueden catalizar la reacción anterior Anticuerpos catalíticos Producto Importancia de los enzimas en la industria farmacéutica

Inconvenientes: Pierden estabilidad en función del tiempo, no todos los enzimas tienen la misma estabilidad ni la misma vida media Son muy específicos en solución lo que a veces es inconveniente porque catalizan pocos procesos. Sobretodo cuando trabajamos con proteasas tenemos riesgo de hidrólisis Algunos enzimas son difíciles de obtener El cofactor suele ser caro y siempre se intenta que tenga regeneración. La obtención es equivalente a la disponibilidad, puede que sea caro el proceso de obtención para su extracción. Este rendimiento espacio tiempo es limitado. ASPIRINA Los enzimas no duran eternamente, sino que tienen caducidad, una vida media, debemos de exprimir esta actividad hasta el final, en una solución en la que tenemos un enzima que empieza a actuar, a las dos horas su actividad y estabilidad se pierden. Efecto de l’acetilsalicilitat en COX Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company Ser COX-1 i COX- 2 ¾ Estabilidad ¾ Especificidad ¾ Hidrólisis ¾ Disponibilidad ¾ Cofactores ¾ Obtención ¾ Rendimiento espacio:tiempo limitado Inconvenientes de la utilización de los enzimas como biocatalizadores Análogos de la aspirina Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company Actividad ciclooxigenasa y peroxidasa Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company Actividad ciclooxigenasa y peroxidasa de COX 0 2 4 6 0 1 2 3 4 5 6 V media 7 8 Activ.

TEMA 5 INMOVILIZACIÓN

Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas células u orgánulos confinados o localizados en cierta región con retención de actividad catalítica y puede ser usado de modo repetido y continuo, añadimos sustrato, obtenemos producto, volvemos a añadir sustrato, reobtenemos producto etc. Los enzimas están inmovilizados, en producto sale solo y no es necesario la purificación, hay un nivel de pureza alto, disminuimos el coste y aumentamos la productividad. Hay dos tipos de soportes de inmovilización, pero ambos tipos deben de cumplir una serie de propiedades, deben tener elevada resistencia mecánica, química y biológica, por si hay reactivos que lo puedan dañar, debe ser insoluble en la disolución, debe de tener hidrofílicidad alta , debe de tener una elevada área de acción enzimática, podemos optimizarlo con poros etc y ser regenerable para poder utilizarlo varias veces seguidas, y de reducido coste económico. Tenemos los soportes orgánicos, y los soportes inorgánicos. ORGÁNICOS Tienen buena relación área/volumen, muy flexibles y baratos. Ej. Celulosa (DEAE-­‐, CM-­‐), agarosa, almidón, dextrano, alginato, carragenina, poliacrilamida, colágeno, copolímeros orgánicos (anhídrido málico + etileno) INORGÁNICOS Tienen mas resistencia y regenerabilidad y propiedades físicas controlables Ej. Sílice coloidal, vidrio, nylon, carbón, policarbonato, hidroxiapatita, óxidos de titanio, níquel ... TIPOS DE INMOVILIZACIÓN Métodos de inmovilización

- Captura o atrapamiento 2/ Métodos de inmovilización de enzimas por retención física 1/ Métodos de inmovilización de enzimas por retención Química

• Adsorción
• Entrecruzamiento
• **Unión covalente
• Inclusión en membrana**