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Tema 1-2!
Biotecnología!
Conjunto de técnicas que manipulan organismos vivos para la obtención y mejora de productos útiles Propagación masiva de plantas: con fines comerciales, para conservar especies en peligro de extinción Resistencia a plagas Plantas resistentes a estreses abióticos Plantas con cualidades nutricionales mejoradas (ej: golden rice, que sintetiza vitamina A) Obtención de fármacos (vacunas, anticuerpos, hormonas...)
1. Introducción al cultivo de tejidos vegetales! Hay muchas diferencias entre células vegetales y animales. A partir de cualquier tipo de célula vegetal se puede regenerar una planta entera.
1.1 Plasticidad vegetal!
Es la capacidad que poseen las plantas de modificar su estructura, desarrollo, metabolismo para adaptarse al medio que las rodea. Esto se debe a su naturaleza sesil (no pueden desplazarse) Plasticidad se da gracias a la gran capacidad de iniciar divisiones celulares, gran capacidad regenerativa y capacidad de adaptar el metabolismo a los cambios. Esto supone una ventaja para el cultivo de tejidos vegetales.
1.2 Totipotencia!
Todas las células vegetales son totipotentes, tienen información genética necesaria para dar lugar a un individuo completo, es necesario aplicar un estímulo adecuado para que la célula manifieste la totipotencia.
1.3 Diferenciación y desdiferenciación!
Desarrollo de la planta se produce por divisiones mitóticas y posteriormente por fenómenos de diferenciación, que son procesos por los que una célula adquiere una estructura determinada. Se producen cambios metabólicos y estructurales. En los mamíferos la diferenciación celular es irreversible, en las plantas es reversible, una célula puede desdiferenciarse. Si cultivamos
Diferenciación y desdiferenciación celular
un explanto en condiciones adecuadas podemos conseguir que las células vuelvan a un estado meristemático. Al estado juvenil se le denomina callo, es una masa amorfa de tejido desdiferenciado, con apariencia desorganizada y proliferación continua y acelerada. En el callo podemos encontrar: Explanto no desdiferenciado Células meristemáticas (que desarrollan raíces, tallos o embriones) Masas de células vacuoladas Rediferenciación puede inducir organogénesis o embriogénesis somática.
1.4 Asepsia!
Es uno de los aspectos más importantes y más complicados de conseguir, los principales causantes de contaminación son bacterias y hongos. Para mantener la asepsia hay que tener cuidado con: Instrumentos : hay que esterilizar, flameando asas, esterilizando recipientes en estufa Medio de cultivo : esterilizar en autoclave o con filtros Área de trabajo : en campana de flujo laminar
Material vegetal : si partimos de material vegetal ex vitro debemos esterilizarlo. No es
necesario si el cultivo es in vitro Para esterilizar material vegetal lo más habitual es usar etanol e hipoclorito sódico (lejía), el tipo de desinfectante, concentración y tiempo que dura la desinfección depende de: Tipo de explanto Origen de explanto
2. Factores que determinan
crecimiento in vitro!
2.1. Características del material vegetal!
Las que condicionan su crecimiento in vitro son: Genotipo : clon de la especie que queremos cultivar. Las gimnospermas tienen capacidad regenerativa menor que las angiospermas. Genotipos que regeneran plantas enteras ex vitro con gran facilidad también lo hacen in vitro. También hay excepciones: Kalanchoe farinacea tiene poca capacidad de regeneración ex vitro pero mucha capacidad de regeneración in vitro Edad de la planta, órgano, tejido : órganos que mejor responden son los tejidos embrionarios, al ir madurando van perdiendo capacidad morfogénica. En un mismo individuo hay que tomar material de las zonas más jóvenes. Hay tratamientos para rejuvenecer
Tema 3. El medio de cultivo!
1. El medio de cultivo!
1.1 Agua. Hidratos de carbono!
95% del medio de cultivo es agua. Debe estar pretratada (destilación, intercambio iónico, ósmosis inversa...) para eliminar iones y materia orgánica, habitualmente el agua se trata de forma doble, se bidestila, o se trata por ósmosis inversa y después por intercambio iónico... En condiciones in vitro son necesarios los azúcares, a diferencia de las condiciones ex vitro. Se debe a que la fotosíntesis in vitro está muy limitada, el CO 2 se agota muy rápidamente, hay explantos que no tienen cloroplastos (fotosintéticamente no activos), puede ser necesario cultivar en oscuridad, por ejemplo para obtener callos. Por noma general el medio de cultivo contiene hidratos de carbono. Uno de los más empleados es la sacarosa, es la forma en que la planta transporta el azúcar a lo largo de sus tejidos. La concentración es variable y depende del tipo de explanto, suele estar entre el 1 y el 5%, los explantos más jóvenes necesitan más sacarosa porque son metabólicamente más activos. La sacarosa, durante los procesos de esterilización, puede hidrolizarse, caramelizarse... A veces los explantos exudan enzimas como la invertasa, que hidroliza la sacarosa
1.2 Elementos minerales!
Plantas necesitan macro y micronutrientes. Macronutrientes : N, P, S, K, Ca, Mg. Elementos que la planta necesita en grandes cantidades Micronutrientes : Ni, Mo, Cu, Zn, Fe. Elementos esenciales que la planta necesita en condiciones más pequeñas.
Agua. Hidratos de carbono
Existen compuestos orgánicos sintéticos capaces de ejercer funciones similares a las hormonas, con actividades análogas. Estos compuestos sintéticos son mucho más estables. Son necesarias cantidades mucho más pequeñas de estas sustancias para tener el mismo efecto que las hormonas. En el cultivo in vitro es habitual emplear estos compuestos. Regulador de crecimiento : engloba hormonas vegetales y sus análogos sintéticos, regulan el crecimiento y desarrollo de una planta. También se preparan en soluciones stock. Auxinas Ácido indolacético es la auxina natural que sintetiza la planta. Sintéticos están el ácido indolbutírico, el ácido naftalénico y 2,4-D Las auxinas se sintetizan en las yemas de los tallos. ácido indolacético se degrada fácilmente por la luz y por las peroxidasas que exuda el explanto, también por pH ácido. Las sintéticas son mucho más resistentes Funciones Estimulan crecimiento de raíces Favorecen división y elongación celular Inducen dormancia apical Auxinas no son solubles en agua, soluciones stock se preparan en agua basificada con NaOH o algo de etanol Citoquininas: se sintetizan en las raíces Zeatina es natural Kinetina y BAP más usadas en cultivo in vitro Funciones Inducen desarrollo del tallo Inhiben dormancia apical Favorecen división y elongación celular, sobre todo si están en el medio en conjunción con las auxinas. Para preparar la solución stock es necesario acidificar el medio con HCl Giberelinas Giberelinas son sensibles a alta temperatura, al preparar el medio de cultivo hay que añadirlas después de esterilizar en autoclave. Función Elongaición del tallo, hace que crezcan los entrenudos Rompen dormancia de semillas y embriones Ácido abscísico: perjudicial para el cultivo in vitro Etileno: lo sintetiza el explanto, en alta concentración evita el correcto desarrollo Reguladores de crecimiento
Células vegetales son totipotentes y enormemente plásticas, gracias al empleo de reguladores de crecimiento podemos regular el desarrolo y conducirlo a la ruta morfogénica que nos interese. Depende del balance hormonal. Cuando los balances de auxinas y citoquininas están igualados se induce producción de callos Si está inclinado a las auxinas se induce rizogénesis Si está inclinado a citoquininas, se inducen rutas de caulogénesis (proliferan tallos)
1.5 Compuestos de origen vegetal!
1.6 Agar!
Medios pueden ser líquidos, semisólidos o sólidos, para estos es necesario emplear agentes gelificantes, el más usado es el agar. Es un polisacárido procedente de las algas. No se degrada a altas temperaturas No reacciona con ningún elemento del medio de cultivo No es sensible a exudados de la planta No es citotóxico Es insoluble a temperatura ambiente, calentamos el medio de cultivo para disolverlo, al enfriarse forma una red tridimensional que retiene los nutrientes, hormonas y demás elementos que contiene el medio de cultivo. Concentración de agar que añadamos al medio es muy importante. Si ponemos una cantidad insuficiente el medio no solidifica Si ponemos demasiado agar en el medio, retiene con demasiada fuerza los nutrientes, agua y hormonas, el explanto no podrá absorberlos. Contacto entre el agar y el explanto será más pequeño dificultando la toma de nutrientes. Balance AUX/CK Compuestos de origen vegetal
4. Esterilización del medio de cultivo!
Calor húmedo: autoclave!
Sistema más universal para esterilizar medio 15-20 minutos a 121ºC Tener cuidado con sustancias sensibles a altas temperaturas (giberelinas, antibióticos)
Filtración: filtros de membrana!
No es lo más habitual Puede usarse para sustancias termosensibles.
Tema 4. Influencia de factores ambientales
sobre el cultivo in vitro!
Muchas de las condiciones ambientales del cultivo in vitro van a depender de las condiciones ambientales exteriores (Tª, luz...). Es importante cultivar en cámaras que controlen estos factores. Podemos emplear varias cámaras Bancales de iluminación (no regulan temperatura) Cámaras cerradas Cámaras visitables o habitaciones acondicionadas Hay factores que afectan a la parte aérea y otros que afectan a la raíz Temperatura! La temperatura idónea para el crecimiento in vitro suele estar en torno a 24-26ºC. La cámara de cultivo suele estar 2 o 3 grados por debajo de esta temperatura porque en la cámara de crecimiento hay iluminación, y las lámparas provocan un sobrecalentamiento del cultivo. Termoperiodo: no siempre es necesario cambiar la temperatura por el día o por la noche, sin embargo hay especies que requieren más calor durante el día y temperatura más baja por la noche. La temperatura se consigue por sistemas de aires acondicionados y bombas de calor. Para evitar el sobrecalentamiento debido a las lámparas hay baldas aisladas o dobles baldas para que no se calienten los cultivos de encima de las lámparas. Luz! La luz afecta a: Fotosíntesis del cultivo Fotomorfogénesis Fototropismo: cómo crece la planta Hay que controlar tres aspectos de la luz Fotoperiodo : se sabe poco del efecto del fotoperiodo sobre el crecimiento in vitro, se suele cultivar con fotoperiodos similares a los naturales. Pueden existir procesos que requieran oscuridad absoluta, por ejemplo en las primeras fases de la formación de callo embriogénico. Floración es un proceso muy regulado por las horas de luz Irradiancia : intensidad de luz. Es muy baja, por dos motivos, para evitar el sobrecalentamiento y porque el aparato fotosintético de los cultivos in vitro no está adaptado a altas intensidades luminosas. se cultiva a unos 40-50 microeinsteins por metro cuadrado (en un día soleado hay unos 1500). Punto de compensación: intensidad mínima de luz que necesita una planta para fotosintetizar. A bajas intensidades estamos en el límite de este punto de compensación. Composición espectral : La composición espectral afecta a:
Interacción de factores!
Para un genotipo, los factores físicos pueden provocar una alteración de la expresión génica de un genotipo dando lugar a un fenotipo distinto. Puede haber genes que se expresen in vitro y que no se expresen ex vitro Concentración de sacarosa con luz y CO 2 A intensidad luminosa alta, si se pudiese conseguir una concentración de CO 2 adecuada no se necesitaría sacarosa en el medio (autotrofo) Si la luz es algo más baja pero está por encima del punto de compensación y hay niveles bajos de CO 2 será necesario aportar sacarosa al medio. (mixotrofo) Para cultivos en condiciones de oscuridad, aunque el CO 2 sea adecuado hay que aportar sacarosa Si el pH es demasiado ácido se inhibe la toma de amonio, si es muy básico precipitan las sales y estan menos disponibles para el cultivo Reguladores de crecimiento/ factores físicos: Giberelinas se degradan con temperatura Ácido indolacético se degrada con la luz y pH bajo
Ψa= Ψs+ Ψm+ Ψp Potencial hídrico (Ψa) es la fuerza con la que un tejido retiene agua y está compuesto de potencial osmótico (Ψs), potencial matricial (Ψm) y potencial de pared (Ψp). Es una fuerza y por lo tanto tiene unidades de fuerza (KPa, MPa), el potencial hídrico tiene siempre valores negativos. Un Ψa de 0 es el que tiene el agua libre, no retiene con ninguna fuerza el agua, cuanto más negativo sea el valor de Ψa, indicará que el agua está retenida con más fuerza. Potencial hídrico del suelo cercano a 0, el de la planta es algo más negativo y el de la atmósfera es mucho más negativo. El agua es absorbida por las raíces gracias a que hay un gradiente de potencial hídrico, asciende por el xilema formando una columna continua de agua y sale a la atmósfera por los estomas en un proceso llamado transpiración. El agua que se pierde genera un “tirón transpiratorio”, que favorece la absorción de agua por la raíz.
‣Condiciones del cultivo in vitro!
agua en la planta el cultivo in vitro Movimiento del agua en la planta
Condiciones del cultivo in vitro
HR 99% -1,4 MPa -1 MPa La diferencia de potencial hídrico entre el aire y el medio es inferior a 1 MPa La diferencia de potencial hídrico entre el aire y el suelo es de casi 100 MPa
Condiciones del cultivo in vitro
En condiciones ex vitro hay un gradiente entre el suelo y la atmósfera de 100MPa, hay mucho tirón transpiratorio. En el ambiente in vitro el potencial hídrico del suelo es un poco más negativo que el del suelo ex vitro, el potencial hídrico de la atmósfera in vitro no es tan negativo como el de la atmósfera ex vitro, por lo tanto el gradiente es mucho más pequeño que en condiciones ex vitro. Este gradiente es fundamental para la absorción, el pequeño gradiente hace que la planta transpire muy poco, el tirón transpiratorio es pequeño y la planta tiene mayor dificultad para absorber agua del medio de cultivo.
Factores que afectan a las relaciones hídricas!
‣Baja funcionalidad estomática!
Los estomas son poros que tienen las plantas en las hojas. Estructura del estoma: aparato estomático se compone del poro, células oclusivas y en ocasiones hay células acompañantes o subsidiarias. Abertura del estoma según el estado de turgencia de las células oclusivas. Cuando el estoma se abre, el mecanismo que está detrás es que las células oclusivas empiezan a acumular iones (K, Cl...), comienzan a acumular sustratos orgánicos (malato), esta acumulación favorece la entrada de agua, porque su potencial hídrico se hace más negativo. La célula oclusiva comienza a acumular potasio, entra el agua y la célula se llena de agua y gracias a un sistema de microfibrillas de celulosa que tiene el estoma, el estoma se abre, la planta empieza a transpirar. Para el mecanismo de cierre la planta libera potasio, degrada malato, el agua sale, las células pierden turgencia y el estoma se cierra. Estomas de las células cultivadas in vitro son muy grandes, estomas de plantas in vitro son afuncionales, no responden a estímulos, siempre permanecen abiertos. No puede cerrar los estomas porque tiene las relaciones iónicas de las células oclusivas alteradas. y sistema de microfibrillas está desorganizado.
‣Excesiva transpiración cuticular!
Plantas también transpiran a través de la epidermis, aunque en menor medida. Células cubiertas por cutícula, que está recubierta de ceras para minimizar la transpiración cuticular. Las plantas cultivadas in vitro tienen bajos niveles de ceras epicuticulares. Tienen una composición diferente de esas ceras. Baja funcionalidad estomática
Abertura y cierre estomático
Azcon-Bie
Baja funcionalidad estomática
Estructura del estoma
Rubisco: Enzima clave en la fotosíntesis. La actividad rubisco cataliza la fijación de CO 2 y el producto de la reacción lo fija en una molécula de ribulosa-1,5-bifosfato para dar lugar a dos moléculas de fosfoglicerato (con 3 átomos de carbono), forma parte del ciclo de Calvin. Plantas crecidas in vitro tienen menor concentración de rubisco y la enzima está menos activa, tienen menor grado de activación. Esto se debe a que hay menos CO 2 y a las altas concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo. Sacarosa produce retroalimentación del ciclo de Calvin. Respiración y fotorrespiración:! Balance de carbono fijado: Respiración mitocondrial en plantas de patata. Fotorrespiración influye también en balance de CO 2 , se da en los cloroplastos. La rubisco tiene la capacidad de fijar una molécula de CO 2 en proceso de la fotosíntesis, se denomina actividad carboxilasa. La rubisco tiene otro tipo de actividad, contraria a la carboxilasa, denominada oxigenasa. Toma O 2 y libera CO 2 a la atmósfera. La rubisco se decanta por una de las dos actividades en base a la cantidad de CO 2 de la atmósfera y por la cantidad de O 2. En atmósfera in vitro a lo largo del día la concentración de CO 2 va disminuyendo durante el día, la rubisco aumenta la fotorrespiración.! PEPc: Emplea como sustrato el CO 2 , emplea el ciclo de Krebs para sintetizar precursores de aminoácidos, ácidos nucleicos... Actividad respiratoria en plantas de patata cultivadas in vitro (1) en relación a plantas aclimatizadas (2) y ex vitro (3)
Factores que afectan a la fijación de CO 2 in vitro
Respiración mitocondrial Balance de C fijado Factores que afectan a la fijación de CO 2 in vitro Fotorrespiración Balance de C fijado In vitro Fotosíntesis neta Activación Rubisco Transferencia a medio con sacarosa (•) Fuente: Hider and Desjardins (1994) Factores que afectan a la fijación de CO 2 in vitro Rubisco
Actividad muy exaltada in vitro, compite por el CO 2 por la rubisco disminuyendo la actividad fotosintética. Actividad disminuye con la adaptación, también lo hace el CO 2 fijado.!
‣Externos!
Intensidad luminosa Baja intensidad luminosa hace que la actividad fotosintética no pueda ser alta. Las plantas ex vitro se saturan a unos 1000 mE. Las plantas in vitro se saturan mucho antes (a unos 200-400mE aprox)
Gases (CO2, etileno...) Limitaciones para la fotosíntesis: " Azúcares : afectan a los niveles de actividad rubisco
Rubisco y PEPc
Factores que afectan a la fijación de CO
2
in vitro
Limitaciones para la fotosíntesis
Factores que afectan a la fijación de CO 2 in vitro Intensidad luminosa
