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Martha Hernández, Carol Carvajal, Margarita Márquez, Roxana Báez, Humberto Morris, Ramón Santos, María
de los Ángeles Chávez
Obtención de Preparados Enzimáticos a Partir de Tallos de Piña (Ananas Comosus) con Potencialidades de
uso en la Biotecnología y la Medicina.
Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 36, 2005
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Cuba
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Revista CENIC. Ciencias Biológicas, ISSN (Versión impresa): 0253- [email protected] Centro Nacional de Investigaciones Científicas Cuba
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Obtención de Preparados Enzimáticos a Partir de
Tallos de Piña ( Ananas Comosus ) con
Potencialidades de uso en la Biotecnología y la
Medicina.
Martha Hernández, 1 Carol Carvajal, 1 Margarita Márquez, 2 Roxana Báez, 3 Humberto
Morris, 4 Ramón Santos, 1 María de los Ángeles Chávez.^2
(^1) Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón
km 9. Ciego de Ávila. Cuba. Teléfono: 053-33 224016, Fax: 053-33 266340. Email: [email protected]. (^2) Centro de Estudios de Proteínas. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana.
Cuba. (^3) Facultad de Ciencias Médicas de Ciego de Ávila. Ciego de Avila. Cuba (^4) Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba. Cuba.
RESUMEN : El aislamiento y purificación de productos naturales a partir de plantas es una vertiente muy importante de la biotecnología moderna. La bromelina (EC 3.4.22.32) es una proteasa aislada de plantas de piña que se ha empleado tradicionalmente en la industria alimenticia. La enzima también se ha usado en la industria farmacéutica. En la actualidad existe un renovado interés por ella, desde que fue descrita su actividad antitumoral y antimetastizante frente a algunos tumores. En este estudio, se obtuvo extracto crudo de bromelina a través de un procedimiento de extracción novedoso. Los rendimientos de la tecnología fueron de 20.8 g de producto/kg de tallos, con una actividad específica de 1.36 U/mg. Tiene pH óptimo 7 para la hidrólisis de hemoglobina durante 20 minutos. El producto aislado es muy estable en un rango de pH de 3-9 y temperaturas de hasta 50°C durante cuatro horas. El extracto crudo se utilizó en la industria biotecnológica para obtener un hidrolizado proteico de Clorella vulgaris , con un rendimiento (g de hidrolizado/100 g de biomasa) de 30%. La preparación enzimática fue purificada. Se determinó la secuencia amino terminal de la mayor fracción obtenida. Se realizó un estudio toxicológico y farmacológico del producto parcialmente purificado por cromatografía de intercambio iónico en carboximetil celulosa-52 (CMC-52). La dosis letal media a dosis única fue 216.35 mg/kg y a dosis repetida 105.91 mg/kg. La proteasa, comparada con el citostático 5-Fluoracilo, mostró una marcada actividad antitumoral frente a los tumores trasplantables de ratón: leucemia P-388, carcinoma pulmonar de Lewis, tumor ascítico de Ehrlich, sarcoma-37 y adenocarcinoma mamario-755. Frente a este último se demostró por primera vez la actividad antitumoral de la bromelina.
ABSTRACT : The isolation and purification of natural products from plants is a line very important in modern biotechnology. Bromelian (EC 3.4.22.32) is a proteinase isolated from pineapple plants (Ananas comosus) , which has been traditionally employed in food industry. This enzyme has been also used in pharmaceutical industry. In recent years there has been renewed interest for this protease after its high anti-metastatic and antitumoral activity was reported. In this study, bromelain crude extract was obtained through a novel experimental procedure. The yields of technology were 20.8 g of product/stems kg, with a specific activity of 1. U/mg. An optimal pH of 7 was obtained for haemoglobin hydrolysis during 20 min. The isolated product was very stable in the pH range from 3 to 9 and till 50° C for 4 hours. Crude extract was used in biotechnological industry to obtain protein hydrolyzed from Clorella vulgaris, with a yield (hydrolyzed g/100 g biomass) of 30%. Enzymatic preparation was purified. The amino terminal sequence for major fraction obtained was determined. The enzymatic product partially purified by ion exchange chromatography in Carboxymethyl Cellulose (CMC-52), was submitted to toxicological and pharmacological studies. The lethal media doses (LD 50 ) was 216.35 mg/kg in toxicity study (unique dose). For the administration during 30 days of the enzyme the LD 50 was 105.91 mg/kg. Bromelain was compared with citostatic 5-Fluouracil and showed high anti-tumoral activity in 5 of the 6 tumors studied: leukemia p-388, Lewis pulmonary carcinoma, Ehrlich ascitic tumor, sarcoma-37 and mammary adenocarcinoma-755. This study is the first report for the latter tumor.
Palabras claves: proteasas, bromelina, actividad antitumoral, hidrolizados de proteínas
Keywords: bromelain, protease, antitumoral activity, protein hydrolyzed
sodio en una proporción 1:1.5 (m/v). A los productos se les determinó concentración de proteínas y actividad enzimática. El extracto crudo se llevó a sequedad por liofilización. Caracterización del Extracto Crudo de Tallos Concentración de Proteínas: Se cuantificó por el método 19 y se expresó en mg/mL o mg/kg de masa fresca, referidos a una curva patrón de albúmina de suero bovino.
Actividad Enzimática: Se determinó por el método 20 y se expresó en U/mL o U/kg de masa fresca. Se
empleó como sustrato hemoglobina desnaturalizada al 2%, pH 6.8. Una unidad (U) es la cantidad de
enzima que cataliza la formación de 1(mol de tirosina por minutos a 37°C y pH 6.8. La actividad
específica se calculó como el cociente de la actividad enzimática entre la concentración de proteínas).
Caracterización Cinética: Se realizó un ensayo a diferentes tiempos hasta 30 minutos para garantizar la
determinación de la velocidad inicial ([E]=0.02-1 mg/mL; [S]=2%; pH 6.8; T=37°C) y a
concentraciones de enzima de 0.025 a 0.6 mg/mL durante 20 min. El estudio de la velocidad en función
del pH se realizó desde pH 2 hasta pH 10 a [E]=0.1 mg/mL; [S]=2%; T=37°C y tiempo de ensayo de
20 min. En el caso de la temperatura se procedió de igual forma pero a pH 6.8 y a temperaturas de 5 a
70°C.
Evaluación de la Aplicabilidad del Extracto Crudo de Bromelina en Procesos de Hidrólisis
Obtención y Tratamiento de la Biomasa: Se utilizó la cepa de Chlorella vulgaris 87-1 (21). Una parte
de la biomasa (0.5 kg) se despigmentó con etanol.
Caracterización Química de la Biomasa Autotrófica de Clorella vulgaris: El contenido de cenizas y
proteína bruta se determinó por el método de microKjeldhal (22). Los ácidos nucleicos totales se
cuantificaron por el método 23. Se determinó la humedad (22), se expresaron los resultados referidos al
contenido de masa seca.
Determinación de la Actividad Específica a los Preparados Proteolíticos: Se compararon enzimas
comerciales con bromelina y un preparado de Bacillus subtilis. Se ajustó el pH de la hemoglobina
(según la enzima) y se determinó la actividad proteolítica: (pH 2) pepsina, (pH 7) papaina y bromelina,
(pH 7.5) pancreatina y tripsina, (pH 8.5) el crudo de B. subtilis.
Estudio del Efecto del Tratamiento de la Biomasa en la Hidrólisis Enzimática: Suspensiones al 10% de
Clorella vulgaris tratada con etanol, se hidrolizaron con bromelina (6.9 U/g, pH 7, 37°C) por 5 h. Se
estimó el contenido de N-amínico (24).
Influencia de la Naturaleza de la Enzima en la Hidrólisis de Proteínas Celulares: Suspensiones al 10% de biomasa extraída con etanol se hidrolizaron con 20 U de enzima/g (4 h a 37°C). Se determinó el contenido de N-amínico como se describió. Composición Bioquímica de los Hidrolizados Proteicos: Se determinó el rendimiento, pH y propiedades organolépticas del hidrolizado. La composición aminoacídica se estudió en un analizador Alpha Plus, LKB. Purificación de Bromelina de Tallo Purificación por Cromatografía de Filtración en Geles de Sephadex G-100: La columna (1.6x90 cm) se equilibró con NaAc 0.005 mol/L, pH 5 (10 cm/h). Se purificó extracto crudo de tallo y extracto previamente purificado por intercambio iónico. Cromatografía de Intercambio Iónico en CMC-52: El extracto crudo dializado (NaAc, 0.005 mol/L, pH 5) se purificó en un sistema "semibatch". Se utilizaron 2 g de CMC/10 mL de extracto. La columna (1.5x5 cm) se eluyó por etapas con NaAc (0.3, 0.5 y 1 mol/L, pH 5, 20 cm/h). En el resto de las purificaciones (20 lotes) se eluyó con NaAc 0.5 mol/L. Para purificar mayores volúmenes de extracto (100 mL) se usó el mismo sistema y una columna de 2.5x17 cm. Se colectaron fracciones de 2 mL. Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP-HPLC): Extracto crudo y bromelina purificada por CFG (2.5.1), CII (2.5.2) o la combinación de ambos, se analizaron por HPLC (LKB-Pharmacia), columna 100 RP-18 (4x250 mm). Se utilizó un gradiente 0-80% de acetonitrilo-ácido trifluoroacético 0.1%, velocidad de flujo: 0.5 mL/min por 65 min. Análisis Electroforéticos: Las electroforesis (SDS-PAGE) se realizaron por el método 25. Las electroforesis bi- dimensionales se desarrollaron como se describe en 26. Se utilizó como patrón gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH, MM 36 000 Da). Determinación de la Secuencia Amino Terminal de Bromelina de Tallo: El pico activo de la purificación por intercambio iónico y filtración en gel de extracto crudo se aplicó a la columna RP-18. A las fracciones eluidas con similares tiempos de retención a la bromelina SIGMA se les determinó la secuencia aminoacídica parcial (secuenciador Beckman LF 3000).
Evaluación de la Aplicabilidad del Preparado Semipurificado en la Terapéutica Se usaron ratones de 7 a 8 semanas de edad y peso entre 20 y 25 g, provenientes del Centro Nacional para Animales de Laboratorio, mantenidos en adaptación 7 días (27). Estudios de Toxicidad de la Bromelina a Dosis Única y Repetidas: Se empleó el método 28. Se usaron ratones BDF-1 (diez por grupo). A cinco de los grupos, se le administraron por vía intraperitoneal (IP) dosis únicas de bromelina (400, 300, 200, 100 y 50 mg/kg) disuelta en agua estéril. Un sexto se utilizó como control de solvente, el último grupo (control negativo) no recibió tratamiento. Para el estudio a dosis repetidas se aplicaron 200, 100, 75, 50 y 25 mg de bromelina/kg diarios por un mes, vía IP. Actividad Antitumoral: Se trasplantaron las líneas de tumores murinos: leucemia P-388 por vía IP, sarcoma (S-37) y tumor ascítico de Ehrlich (TAE) por vía IP; carcinoma pulmonar de Lewis (CPL) por vía intramuscular (IM); melanoma (M-B16F10) y adenocarcinoma mamario (ADC-755) por vía subcutánea (SC) (un millón de células/ratón). La evaluación de la actividad antitumoral se hizo por el cálculo del índice de aumento de sobrevida (A.S%= [(Sobrevida promedio de los ratones tratados-Sobrevida promedio de los controles/Sobrevida promedio de los controles)]·100). A tres grupos se les administró 5, 12.5 y 25 mg de bromelina/kg. El cuarto grupo se trató con 5-Fluouracilo (5-Fu, 20 mg/kg). Al quinto se le administró solución salina fisiológica (SSF). Se realizaron tres ciclos de cinco administraciones. Se evaluó la actividad antimetastizante sobre el CPL. Se usaron dosis de 12.5, 25 y 50 mg/kg. Se empleó un grupo control negativo y otro se trató con 5-Fu. Se extrajeron los pulmones de los animales sacrificados por dislocación cervical a los 21 días. Se contaron las macrometástasis.
RESULTADOS Y DISCUSION
Extracción de Bromelina a partir de tallos de piña Los procedimientos utilizados para obtener enzimas proteolíticas son costosos y complejos, lo que dificulta su producción a escala industrial. Por el método evaluado se usa un agente protector de los grupos SH del centro activo de la enzima (sulfuro de sodio Na2S, 1-3 mmol/L) que combina una buena capacidad reductora con un bajo costo y el empleo de un rango de valores de pH ácido (2-4) durante la extracción. En la tabla 1 aparecen los rendimientos de la extracción.
Tabla 1. Rendimientos de la tecnología de extracción de bromelina.
Tallos Masa fresca (kg) 0.5 a Masa del extracto liofilizado (kg) 0.010 c Rendimientos (g de producto/kg de masa fresca) 20.8 c Actividad enzimática (U/mL) 6.6 a Actividad enzimática (U/kg de masa fresca) 5357.9 a Concentración de proteínas (mg/mL) 4.8 a Rendimiento (g de prot./kg de masa fresca) 3.9 a Proteínas (%) 18.8 a Actividad específica (U/mg de proteínas) 1.36 a
- Medias con letras iguales para cada parámetro no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p< 0.05).
La presencia de bromelina en extractos de diferentes órganos de plantas de piña se conoce y se han informado varios procedimientos para su extracción (4), que se caracterizan por el uso de solventes orgánicos, precipitación por salado o fraccionamiento por cambios de temperatura. De los métodos publicados el de mayor similitud al usado en el presente estudio fue patentado en Rusia (29). Realizaron la extracción con una solución de bicarbonato de amonio (0.03-0.06 mol/L) a pH cercano al óptimo de actividad (pH 8) y sin utilizar agentes protectores del centro activo. El procedimiento aquí evaluado posibilitó alcanzar rendimientos de hasta 20.7 g de extracto/kg de tallos y 3.9 g de proteínas/kg de tallos. La comparación en términos de rendimientos con otras tecnologías descritas no siempre es posible, ya que todos los autores de patentes no informan los mismos parámetros. Sin embargo, estos valores son superiores a los informados (4, 29) para la extracción con solventes orgánicos (2 a 5 g de extracto/kg de masa fresca). Los valores de actividad enzimática obtenidos (6.6 U/mL, 6000 U/kg de tallo) fueron superiores a los logrados en todos los procedimientos descritos por otros autores. Los valores de actividad específica (1.36 U/mg de proteínas) son comparables a los citados en la literatura: 1-1.2 U/mg de proteínas (29).
a
a b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
0
5
10
15
20
N-amínico (%) Grado de hidrólisis (%) pepsina papaina tripsina pancreatina bromelina B. Subtilis
e
a
b
d e
c
0
1
peps ina papaina trips ina pancreatina bro melina B. Subtilis
GH (%)/mg de proteína
A B
Figura 1. Contenido de N-amínico y grado de hidrólisis (A) en los hidrolizados proteicos de Clorella vulgaris con diferentes proteasas (20 U/g de biomasa tratada con etanol) y eficiencia de la hidrólisis enzimática (B). Medias con letras iguales no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p< 0.05).
Composición Bioquímica de los Hidrolizados Proteicos de Clorella vulgaris con Bromelina En la tabla 3 aparece la composición bioquímica y aminoacídica del hidrolizado. Se obtuvo un polvo homogéneo, higroscópico, de color beige, olor perceptible a peptonas y sabor neutral. El rendimiento de los lotes fue de un 30% (g de hidrolizado/100 g de biomasa). Se comprobó la presencia de todos los aminoácidos esenciales para la nutrición humana (44.7% del total), cuyos valores se compararon con los informados para la proteína de referencia de la FAO. (39%, FAO, 2002). Desde una perspectiva clínica, las nuevas tecnologías de obtención de hidrolizados proteicos con bromelina a partir de fuentes no convencionales de proteínas podrían aportar soluciones a problemas de la terapéutica nutricional. La composición del hidrolizado de Chlorella vulgaris sugiere atribuir a este producto efectos bioestimulantes (32) y puede ser utilizado como base nutritiva para la formulación de medios de cultivo, destinados a propósitos generales y al cultivo de mohos y levaduras.
Tabla 3. Composición bioquímica de hidrolizados proteicos de Clorella vulgaris con bromelina. Valores promedio de tres lotes. Los aminoácidos esenciales aparecen sombreados y comparados con los valores informados para la proteína FAO (17) . Pérdidas por desecación (%) ± ET 5.18 ± 0. Nitrógeno total (%) (^) 7.88 ± 0. Nitrógeno amínico (%) (^) 1.40 ± 0. N-amínico/N-total (%) (^) 17.50 ± 4. Aminoácidos libres (%) (^) 3.30 ± 1. Carbohidratos totales (%) (^) 22.90 ± 4. Lípidos totales (%) (^) 0.20 ± 0. Minerales (cenizas totales) (%) (^) 14.00 ± 1. Cloruros (% NaCl) (^) 5.49 ± 0. Aporte calórico (cal/100 g) (^) 275.58 ±13. Aminoácidos (%) Ile Leu Lis Met Phe Thr Val Trp Tir Ala Arg Asp Cis Glu Gli His Pro Ser P. algal
P.
FAO
Procedimientos de Purificación La purificación se realizó con el objetivo de comprobar la presencia de bromelina como pico mayoritario en el extracto y seleccionar un preparado semipurificado para su uso potencial en Biomedicina. Purificación por Cromatografía de Filtración en Gel En la tabla 4 se resumen los principales parámetros de la purificación de extracto crudo de bromelina por filtración en gel. El rendimiento obtenido fue alto (87.81%) y el grado de pureza satisfactorio (3), pero la presencia de más de un pico con actividad proteolítica (dentro del mismo pico de proteínas), demostró la
necesidad de ensayar otros métodos para lograr mayor separación. La principal desventaja de este método reside en la baja capacidad de procesamiento de muestras. Tabla 4****. Rendimientos de la purificación de extracto crudo de bromelina por filtración en gel.
Etapas Vol (mL)
CP
(mg/mL)
P. Total (mg)
AE
(U/mL)
AE Total (U)
A. Esp (U/mg)
Rend (%)
G.P
Extracto 3 20.35 61.05 14.65 43.95 0.72 100.0 1. Sep-G100 24 0.74 17.78 1.61 38.59 2.17 87.81 3.
Cromatografía de Intercambio Iónico en CMC- En la figura 2 aparece un cromatograma de las purificaciones y en la tabla 5 los rendimientos correspondientes. Se colectó un pico mayoritario 2.34 veces más puro que el extracto de partida, con rendimientos en términos de actividad del orden del 40%. Este proceso es muy ventajoso para purificar proteínas en etapas tempranas e intermedias, por su alta capacidad de procesamiento de muestra y posibilidades de ser utilizado en sistemas " batch" y " semi-batch" fácilmente escalables, lo que determinó su selección para los estudios de actividad antitumoral.
0
1
2
3
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Número de fracciones
A 280 nm
0
1
AE (U/mL)
Abs 280 nm Act. Enzimática (U/mL)
1
Figura 2. Purificación en CMC-52 de extracto crudo de bromelina. Aproximadamente 500 mg de proteínas se fijaron en " batch" a la columna (2.5x17 cm) eluida con NaAc 0.5 mol/L, pH 5. Se colectaron las fracciones con actividad del pico 1.
Tabla 5. Rendimientos de la purificación del extracto crudo de bromelina por cromatografía de intercambio iónico en CMC-52, (sistema “ semi batch” ).
Etapas Vol (mL)
CP
(mg/mL)
P. Total (mg)
AE
(U/mL)
AE Total (U)
A. Esp (U/mg)
Rend (%)
G.P
Extracto 100 4.42 442.0 1.81 180.4 0.41 100 1 CMC-52 24 3.86 92.6 3.60 86.4 0.94 47.7 2.
Combinación de Técnicas de Purificación La combinación de intercambio iónico y filtración en gel permitió aislar un pico mayoritario de bromelina, que se recromatografió en RP-HPLC para determinar la secuencia amino terminal de la proteína aislada. Los picos colectados en las diferentes purificaciones se utilizaron en estudios de caracterización y verificación del grado de pureza de la proteasa. En la tabla 6 aparecen los rendimientos de la purificación.
Tabla 6. Rendimientos de la purificación por CII en CMC-52 del extracto crudo de bromelina previamente purificado por filtración en gel.
Etapas Vol (mL)
CP
(mg/mL)
P. Total (mg)
AE
(U/mL)
AE Total (U)
A. Esp (U/mg)
Rend (%)
G.P
Extracto 3 20.35 61.05 14.65 43.95 0.72 100.0 1. Sep-G100 24 0.74 17.78 1.60 38.41 2.15 87.31 3. CMC-52 10 1.02 10.20 1.81 18.06 1.78 41.15 2.
Actividad Antitumoral Uno de los aspectos más actuales y novedosos en los estudios de aplicación de la bromelina es la demostración de su capacidad antitumoral. Se ha informado que esta actividad es mayor en preparados semipurificados (34). El producto obtenido por intercambio iónico es heterógeneo en actividades proteolíticas y con una actividad específica alta y comparable con la de otros preparados utilizados en la terapeútica (30). Se evaluaron distintas dosis de bromelina frente a cada tumor, en la tabla 8 sólo aparecen los mejores resultados para cada estudio. La bromelina mostró actividad antitumoral frente a todos los tumores evaluados excepto en el melanoma B16 F10.
Tabla 8. Actividad antitumoral de bromelina frente a líneas de tumores murinos.
Sobrevida (días) Índice de sobreviva (%) Tumor
Dosis de Bromelina* (^) Control Positivo 5- Fu
Control negativo
Mejor dosis Bromelina
Control Positivo 5- Fu
Mejor dosis Bromelina Leucemia P-388 5.0 19.30 a 11.12 b 18.80 a 73.56 a 69.06 b Carcinoma pulmonar de Lewis 12.5 35.70 a 27.90 b 35.50 a 27.95 a 27.24 a Adenocarcinoma mamario -755 5.0 23.50 a 16.00 b 24.40 a 46.87 b 52.50 a Tumor ascítico de Ehrlich 12.5 29.40 b 10.60 c 34.50 a 177.35 b 225.47 a Sarcoma-37 25.0 39.30 a 14.20 c 35.31 b 176.75 a 153.60 b Melanoma B-16 F10 12.5 23.20 a 19.80 b 21.11 b 17.17 a 6.61 b
- Se ensayaron dosis de 5, 12.5 y 25 mg/kg de bromelina, sólo aparecen los resultados de la mejor dosis en cada experimento. Dentro de cada tumor medias con letras iguales no difieren para sobrevida (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p< 0.05) y (Mann-Whitney, p< 0.05) para Índice de Sobrevida.
El incremento de la sobrevida en el carcinoma pulmonar de Lewis sobrepasó el 25% para una dosis de 12.5 mg/kg. Al evaluar este modelo Batkin et al ., (11) observaron una actividad antitumoral semejante a la de este estudio. Cuando se empleó adenocarcinoma 755 para el ensayo “in vivo” de la actividad antitumoral, la mayor sobrevida (52.50%) se logró con la dosis de 5 mg/kg. Estos son los primeros resultados encontrados de la actividad antitumoral indirecta de bromelina frente al mismo. Para el tumor ascítico de Ehrlich (TAE; variante de tumor mamario espontáneo), los animales tratados con bromelina registraron un incremento muy significativo de la sobrevida, que se favoreció en los animales que rechazaron el tumor primario. En el tratamiento frente al sarcoma 37, los resultados fueron muy similares a los observados para el TAE. Las evidencias de la participación del sistema inmune en la resistencia frente a la progresión y diseminación del cáncer, da esperanzas de que su manipulación llegue a ser una forma válida de tratamiento (12). Cuando se iniciaron estos estudios mucho se especulaba sobre el posible uso de proteasas de plantas como antitumoral. Con el descubrimiento de nuevas catepsinas humanas, sus mecanismos de regulación y su implicación en la progresión del cáncer (2), se han formulado nuevas hipótesis para explicar la actividad antitumoral de proteasas como la bromelina. Resultados muy recientes de estudios clínicos y preclínicos recomiendan el uso de bromelina como medicamento complementario en el tratamiento de tumores (16). Teniendo en cuenta la actividad antitumoral mostrada por el preparado de bromelina frente a cinco de las líneas tumorales estudiadas, la profundización en estos estudios permitiría proponer el uso clínico de la proteasa. Este trabajo es una contribución importante en la explicación de la actividad antitumoral de la bromelina y las implicaciones para el uso de las cisteino proteasas exógenas de plantas como tratamiento complementario de enfermedades tumorales.
CONCLUSIONES
- Las condiciones de extracción, en las que se utilizan protectores del centro activo de la enzima, a un pH cercano al fisiológico de la planta, permitieron la obtención de un preparado crudo de bromelina de tallo de piña con altos rendimientos de proteína y actividad enzimática.
- La caracterización del extracto crudo de tallos permitió comprobar la presencia de un producto muy activo y estable, con un valor de pH óptimo 7 frente a hemoglobina, buena estabilidad en un rango amplio de pH y temperaturas de hasta 50°C.
- Se demostró la aplicabilidad del extracto crudo de bromelina en la obtención de un hidrolizado proteico de Clorella vulgaris , alga que tiene un alto valor nutricional pero muy baja digestibilidad.
- La combinación de cromatografía de intercambio iónico, exclusión en gel y cromatografía en fase reversa (RP-HPLC) permitió identificar una proteína mayoritaria desde el extracto crudo de tallo hasta el producto más purificado, que caracterizada en términos de masa molar, punto isoeléctrico y secuencia N-terminal se demostró que es bromelina de tallo.
- De acuerdo a los resultados del tamizaje farmacológico el producto semipurificado comparado con el citostático 5-Fluouracilo mostró una marcada actividad antitumoral frente a los tumores trasplantables de ratón: leucemia P-388, carcinoma pulmonar de Lewis, sarcoma-37, tumor ascítico de Ehrlich y adenocarcinoma mamario-755; frente a este último se demostró por primera vez la actividad antitumoral de la bromelina.
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