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Resistencia de Candida albicans a azoles debido a mutaciones
específicas en el último exón de su gen ERG
Sierra Holman-201815364 / Duque Nicolas-201729435 / Rodríguez Paula-
Resumen
Actualmente, la levadura Candida albicans constituye un importante problema de salud pública. Este hongo causa desde infecciones vaginales en casi el 80% de las mujeres, al menos una vez en su vida, hasta infecciones profundas en pacientes inmunodeprimidos que se refleja en altas tasas de morbilidad y mortalidad (Panizo & Reviákina, 2001). Las constantes investigaciones acerca de los mecanismos moleculares y factores genéticos que influyen en la resistencia de Candida albicans a antifúngicos está permitiendo una mayor comprensión del organismo (López-Ávila, et al. 2016). Existen varios mecanismos involucrados en la resistencia a azoles en Candida albicans. No obstante, dicho comportamiento ha sido descrito mayormente en aislamientos clínicos en los que se aprecia una disminución significativa en la expresión de la enzima lanosterol 14α-desmetilasa (Gómez, 2010). En adición a lo anterior, se ha observado la presencia de mutaciones específicas en el gen ERG11 ; involucrado en la síntesis de la Erg11p (lanosterol 14α-desmetilasa), que afectan la estructura y/o función de la enzima (Quintero, 2010). El propósito de este trabajo es entender cómo Candida albicans logra sobrevivir a azoles debido a mutaciones especificas en la última región del gen ERG11.
Palabras claves: Candida albicans , resistencia, azoles, ERG11 , lanosterol 14α- desmetilasa.
1
- Introducción
Las levaduras son comunes como comensales en humanos, Candida albicans es un ejemplo de ello. Este organismo es un hongo diploide asexual y saprófito, de la familia de los Sacaromicetos (Ryan & Ray, 2004), cuyo desarrollo es diferente dependiendo de la temperatura de crecimiento (a 37°C crece como levadura y a 25°C de forma filamentosa) (Pontón, et al. 2002). Candida albicans se encuentra principalmente en las vías respiratorias e intestinales, la vagina y la boca. (Heilmann, et al. 2009; Pardi & Cardozo, 2002).
Esta especie es de gran importancia en la medicina, puesto que, en hospederos susceptibles es capaz de causar una infección oportunista llamada candidiasis (López-Ávila, et al. 2016). La candidiasis incluye infecciones que van desde las superficiales, tales como la candidiasis oral y vaginitis, hasta las sistémicas y potencialmente mortales, conocidas como candidemias , generalmente limitadas a personas inmunocomprometidas, como pacientes con cáncer, trasplante o SIDA o incluso pacientes de cirugías de emergencia no traumáticas (Kourkoumpetis, et al. 2010). Candida albicans es la especie más patógena y su virulencia se debe a un conjunto de atributos relacionados con su habilidad para evadir a los mecanismos de defensa del hospedador, de resistir al tratamiento antifúngico, o de lesionar las células y tejidos que invade (Pontón, et al. 2002).
Es de resaltar que en América Latina, específicamente en Colombia, existen
escasos estudios que señalen las cifras puntuales de morbilidad y mortalidad a causa de candidiasis invasiva (Lazo, et al. 2018) (Tabla 1). No obstante, se estima que la candidiasis invasiva a causa de Candida albicans alcanza una mortalidad en Colombia entre 38 y 52 % y una incidencia de 2,3 casos/ 1. pacientes-día en UCI (Yapar, et al. 2011). Tabla 1. Porcentajes de incidencia y prevalencia de candidemia
Fuente: Lazo, et al. (2018). Estudios de incidencia prevalencia y mortalidad de candidiasis sistémica.
Desde hace años se ha observado un incremento en el número de pacientes con micosis (infecciones causadas por hongos que afectan a cualquier tejido; capaces de producir un cuadro clínico leve, moderado, grave o incluso mortal) que no responden a los tratamientos con antifúngicos, específicamente, azoles (López-Ávila, et al. 2016). Los antifúngicos son compuestos, naturales o sintéticos, que pueden producir modificaciones en estructuras básicas de la célula fúngica inhibiendo su desarrollo y alterando su viabilidad (Tobar, et al. 2011). Actualmente, existen varias familias de antifúngicos disponibles en el mercado siendo una
Fuente: Correa,R.A., Hernandez,J.S., Canon,W.A. and Perez,J.E. 2017
Cabe resaltar que otro programa para analizar las propiedades de los primers y evaluar si son efectivos o no a la hora de hacer una PCR es Oligoanalyzer que pone en evidencia los posibles hairpins o dímeros de primers y sus temperaturas de denaturación.
Fuente: Uniandes. (2018). “Presentación No 10: Reglas Generales para el Diseño de Primers”.
2.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Se realizó una mezcla "Master Mix", donde están todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la PCR
-Agua
-Buffer 10X: para mantener el PH neutro y estable
-MgCl2: Cofactor de la polimerasa
-Primer forward y primer reverse: para permitir que la polimerasa se una a su extremo 3’ y elongue.
-Taq polimerasa: polimerasa termoestable
- ADN molde: servirá de plantilla a la polimerasa
-dNTPs: se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato.
Tabla 3. Preparación de la Mezcla de Reacción (Master Mix)
Fuente: Uniandes, 2018.
Finalmente se mezcló por pipeteo, dicha mezcla se transfirió en tres tubos, a dos de ellos se les agregó ADN de Candida Albicans, se realizó un control negativo (sin ADN) y por último se llevaron los tubos a un termociclador. Tabla 4. Perfil térmico de la PCR
Fuente: Uniandes, 2018.
Fuente: Uniandes. (2018). “Presentación No 9: Reacción en Cadena Polimerasa” 2.4 Electroforesis. Visualización de productos de PCR
El producto de la PCR se sometió a electroforesis siguiendo los parámetros de la guía de laboratorio No 10. Así pues, se procedió primero a ajustar el polimerizador, para luego preparar el gel, para esto a la agarosa y el gel al 1,5 % se le agregó TBE 1X, posteriormente se procedió a calentar hasta que se disolvió y se agrega GelRed® para luego polimerizar. A los productos de la PCR se les añadió Loading Buffer, luego se sembró y corrió para finalmente poder visualizar con la ayuda del GelRed en un transiluminador. Fuente: Uniandes. (2018). “Guía No 10: Electroforesis. Visualización de productos de PCR” 2.5 Purificación de productos PCR
Para esto utilizamos el kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System. Con este método se hace uso de un buffer de unión del ADN a la membrana, buffer de lavado y agua Ultrapura para eluir el ADN. Se procede de la siguiente forma: Centrifugar a 14000 rpm/1min, luego, descartar contenido del eppendorf, posteriormente, Agregar 700μl de “Washing Buffer”. Después, se debe centrifugar de nuevo a 14000 rpm/1min. Descartar contenido del eppendorf por segunda vez, luego continuar realizando el lavado con 500μl “Washing Buffer” y centrifugar 5 min. Ahora, se debe eluir, primero se ensamblo la columna a eppendorf (P) de 1.5ml. Inmediatamente, se debe adicionar 50μl H2O libre de nucleasas para luego incubar a T° Ambiente 1 min y centrifugar a 14000 rpm/1min. Finalmente, se descarta la columna y se pone el contenido del tubo eppendorf nuevo 0,1 mL. No se debe olvidar de conservar a -20ºC para en una segunda ocasión secuenciar.
Fuente: Uniandes. (2018). “Guía No 12: Electroforesis. Visualización de productos de PCR y Secuenciamiento”
2.6 Secuenciación
El método de secuenciación propuesto en este caso es el Sanger Automático. Así, se secuencio la composición nucleotidica del amplicon (producto de la PCR), entonces, gracias al método Sanger automático que se basa en la capacidad que tiene el ADN de replicarse en presencia de una ADN polimerasa se logró determinar la secuencia nucleotidica.
Primero, se prepara una mezcla de amplicones, ADN polimerasa, los cuatro tipos de dNTPs sin ninguna
alteración y los cuatro ddNTPs (dideoxinucleótidos) marcados con fluorescencia y Magnesio (cofactor de la Polimerasa). Un elemento clave de esta secuenciación son los dideoxinucleótidos pues una vez se adicionan a la hebra complementaria paran la replicación debido a la falta del grupo hidroxilo en el 3’ (Gutierrez, s.f).
Luego, se prepara un gel de agarosa y se procede a hacer la electroforésis capilar. Así se deja el gel correr y a través de él pasa un láser que nos permite ver que nucleótido está en esa posición especifica según la absorbancia del receptor, pues cada dideoxinucleótido tiene una fluorescencia diferente. Fuente: Uniandes. (2018). “Guía No 12: Electroforesis. Visualización de productos de PCR y Secuenciamiento” 2.7 Bioinformática
El programa CLC Main Workbench 8.0.1 es un reconocido programa de análisis de datos a partir de la introducción de una o más secuencias de ADN, ARN o proteína. Se utilizó el programa CLC Main Workbench 8.0.1 para comparar nuestra secuencia de interés, la cual es Candida albicans resistente que, codifica para el gen ERG11, con otra secuencia del mismo gen pero sin resistencia a azoles, es decir, Candida albicans susceptible. Así se pudo determinar exactamente cuáles eran las mutaciones puntuales en el último exón de dicho gen que, confieren resistencia a los azoles en Candida albicans, cumpliéndose con el objetivo del presente artículo
resistencia a la cepa con la que se trabajó en el laboratorio, puesto que, se realizaron controles para descartar otros mecanismos ya mencionados anteriormente (Uniandes, 2018).
Para evitar formaciones de biofilms, se aseguró que Candida albicans se cultivara de forma pura, es decir, sin otro hongo en su medio de crecimiento. Lo anterior debido a que está demostrado que los hongos tienen gran capacidad para formar biopelículas lo que facilita la aparición de resistencia hacia los antifúngicos (Rivera, Ramos & Desgarennes, 2013). También, se observó que Candida albicans creció de acuerdo a los niveles normales según los estándares establecidos -pH con rango entre 2,5 y 7,5; temperatura que oscila entre 20°C y 38°C y tiempo de crecimiento, entre 48 y 72 horas después de la siembra, en el que las colonias se pueden detectar- (Webb, 1998), de esta forma se descartó que la cepa tuviese sobre-expresión de bombas de eflujo, otro mecanismo que también está involucrado en la resistencia de Candida albicans a azoles (Morschhauser, 2002).
Es importante mencionar que, en la actualidad, la mayoría de los aislamientos de Candida albicans son resistentes al fluconazol, medicamento utilizado en el tratamiento de infecciones fúngicas superficiales y sistémicas (Muñoz-Moreno, et al. 2018). Su uso descontrolado ha permitido que este hongo mute e inhiba la acción de gran parte de los azoles y es que, a partir de la introducción del fluconazol en 1990, se generó una presión selectiva a través del uso de este agente para tratamiento o
profilaxis, que pudo causar selección de microorganismos resistentes (Quintero, 2010). Lo anterior es señal de una resistencia emergente en Candida albicans a azoles, lo más importante es que dicha resistencia ha mostrado estar relacionada con un aumento en las cantidades de mARN de este hongo (Sanglard, 1996).
Ahora bien, existen mutaciones especificas en el último exón del gen ERG11 que proporcionan resistencia a azoles en Candida albicans. Este gen codifica para la expresión de la enzima lanosterol 14α-desmetilasa que es vital en la ruta de la biosíntesis del ergosterol (Karst & Lacroute, 1977), dicha enzima es el blanco de los azoles, puesto que, ayuda en la trasformación de lanosterol en ergosterol y, este último es esencial para mantener la integridad y función de la membrana plasmática de Candida albicans (Xu, Chen & Li, 2008). Entonces, cuando el gen ERG presenta mutaciones precisas se inhibe la acción de los azoles, al mismo tiempo que se confiere resistencia al hongo. Lo anterior sucede porque mutaciones como T392P, I437V y E517K cambian la estructura de la enzima y la hacen irreconocible para los azoles sin embargo dichas mutaciones no afectan el papel de la enzima en la síntesis del ergosterol (Mane, et al. 2016; Carreté, et al. 2018 y Mingjie, et al. 2009).
La mutación 392, nomenclada como T392P (figura 1), es una sustitución reportada para Candida glabrata. Se encuentra presente en el gen CAGL0J02530g de la cepa Candida glabrata M12 y hace parte de una
proteína de adhesión putativa o hipotética (Carreté, et al., 2018). Entonces, se debe establecer una función homologable de esta mutación en ambos organismos, para finalmente entender que representa dicha alteración aminoacídica en Candida albicans y en Candida glabrata.
En primer lugar, a pesar de su nombre de género, esta levadura está más estrechamente relacionada con la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae que con otros patógenos de Candida , y por lo tanto, se cree que su capacidad para infectar a los seres humanos ha surgido de manera independiente (Carreté, et al., 2018). Además, Candida glabrata tiene todos los genes necesarios para experimentar un ciclo sexual, pero se considera un organismo asexual debido a la falta de evidencia directa de la reproducción sexual, esta es una de las principales diferencias con su ‘prima’ Candida albicans (Carreté, et al., 2018). No obstante, estas son las dos levaduras patógenas más comunes en los humanos, sin embargo, son muy diferentes en términos filogenéticos, genéticos y fenotípicos (Brunke & Hube, 2013) Finalmente, el nivel observado de variación genética en Candida glabrata es significativamente más alto que el encontrado en Candida albicans (Carreté, et al., 2018). Entonces, podemos concluir que la mutación T392P; al catalogarse como una alteración aminoacídica con baja probabilidad de aparición e n Candida albicans en comparación con Candida glabrata (la mutación T392P está asociada a resistividad a antifúngicos en Candida glabrata ), es el resultado de una estrategia que Candida albicans
utiliza para evitar que los azoles ataquen su enzima lanosterol 14 α- desmetilasa.
La mutación 437, nomenclada como I437V (figura 2), es una sustitución encontrada en el gen ERG11 de Candida albicans. Esta mutación se ha encontrado en 4/5 aislados bacterianos que eran resistentes y su ubicación está entre uno de los puntos calientes: 405-488. Sin embargo, también se ha encontrado esta mutación en cepas susceptibles a azoles (Mane, et al., 2016). Lo anterior permite suponer que la mutación 437 puede clasificarse como neutra, ya que, al presentarse tanto en individuos resistentes como en individuos susceptibles no representa mayor cosa, ni da indicios de modificaciones significativas. Entonces, suponemos que la mutación I437V no confiere ventaja selectiva frente a los azoles a Candida albicans. No obstante, se asume que la presencia de esta mutación pude estar estrechamente ligada a otras alteraciones aminoacídicas que sí confieren resistencia a azoles en Candida albicans. Finalmente, un ejemplo de esta aseveración es que, en el estudio de Mingjie, et al. (2009) se encontró la mutación descrita tanto en cepas resistentes como en susceptibles_._
La mutación 517, nomenclada como E517K (figura 3), es una sustitución que no ha sido reportada aún en la literatura, por esta razón, no se puede catalogar como mutación sino más bien como un polimorfismo. A falta de literatura que refiera esta mutación como una alteración aminoacídica que
Conclusiones
En la levadura Candida albicans, la resistencia a azoles es un proceso multifactorial. En dicho proceso, una presión selectiva como la presencia del antifúngico, permitió que las células adquieran un fenotipo resistente. Se concluye que la cepa de Candida albicans, con la que se trabajó en el Laboratorio de Biología Molecular y de la cual se extrajo material genético, presenta las mutaciones T392P, I437V y E517K en el último exón de su gen ERG11 las cuales aparentemente le confieren resistividad.
La conclusión de este trabajo es que en Candida albicans, el mecanismo con mayor repercusión en cuanto a resistencia de este organismo a antifúngicos serían las mutaciones en las diferentes zonas calientes del gen ERG11 , en nuestro caso, la última región 390-560; sin embargo, es necesario un mayor número de cepas para corroborar estos resultados preliminares y así establecer puntos de corte que permitan diferenciar cepas de Candida albicans sensibles de cepas de Candida albicans resistentes para que a la final se pueda detectar de manera inmediata la resistencia a azoles u otros antifúngicos.
Finalmente, aunque este artículo no proporciona cifras cuantificables de variables como mortalidad, morbilidad y costos clínicos atribuibles a candidiasis y/o candidemia a causa de Candida albicans, se propone realizar todo lo que se indica en la sección materiales y métodos (protocolos y modificaciones) para un correcto diagnóstico y medicación por parte del clínico que se enfrente a pacientes y/o
casos similares, donde dichas herramientas le sirvan como instrumento para efectuar mejor su labor.
ANEXOS
Tabla 1. Porcentajes de incidencia y prevalencia de candidemia.
Fuente: Lazo, et al. (2018). Estudios de incidencia prevalencia y mortalidad de candidiasis sistémica.
Tabla 2. Primers utilizados para la amplificación de la región 390-560 del gen^ ERG11^ mediante RPC
Fuente: Correa,R.A., Hernandez,J.S., Canon,W.A. and Perez,J.E. 2017
Tabla 3. Preparación de la Mezcla de Reacción (Master Mix)
ANEXOS
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