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¿Cómo se estudian las células?
Aislando los componentes célulares:
fraccionamiento subcelular
purificación de componentes
A través de estudios por microscopía
Aislando células y cultivo celular
Utilizando técnicas de NMR para células intactas
Marcando con sustratos (radioactivos,
fluorescentes, etc)
Utilizando anticuerpos, mutaciones sitio dirigido,
proteínas de fusión (quimeras )
Métodos aplicados a animales
1.-Estudios in vivo : perfusión de individuo completo 2.-Estudios ex vivo : perfusión de órganos aislados 3.-Cortes de tejido : “tissue printing” revelando con anticuerpos, medición actividad metabólica, fijación para microscopía 4.-Explantes de tejido : crecimiento y diferenciación 5.-Células aisladas : estudio de ectoenzimas, transducción de señales, incorporación y salida de metabolitos/proteínas secretables. Ventaja respecto a tejido completo, estudio de distintos tipos celulares 6.-Homogenizados : metabolitos, actividades enzimáticas 7.-Organelos subcelulares aislados : estructura organelo, actividades metabólicas (vías), presencia de enzimas características del organelo, estudios por microscopía de enzimas, actividades enzimáticas
¿Cómo conocer el tipo de localización en la
membrana?
Proteínas de membrana
Integrales : Prot transmembrana: una o + hélices o multiples láminas Prot ancladas a lípidos: Glucosilfosfatidilinositol (tallo GPI); Farnesilo; palmitato; miristato Periféricas : interactúan con proteínas integrales de membrana o cabezas polares de fosfolípidos de la membrana.
Cascada de señalización de purinoceptores y su
modulación por ectonucleotidasas
ATP, ADP, AMP, adenosina, UTP, UDP tienen funciones en: Neurotransmisión Contactibilidad muscular, efectos inotrópicos y cronotrópicos cardíacos Vasocontricción, vasodilatación, agregación plaquetaria, formación de placas ateromatosas Respuesta inmune Funciones en proliferación y crecimiento Inducción de apotosis
Cascada de señalización de purinoceptores y su modulación por ectonucleotidasas
Cascada de señalización de purinoceptores y su
modulación por ectonucleotidasas
(Purina nucleosido fosforilasa)
Cascada de señalización de purinoceptores y su
modulación por ectonucleotidasas
¿ Cómo se demuestra que una enzima de membrana es
ectoenzima que es integral de membrana con su sitio
activo expuesto al medio extracelular?
- Cultivo celular: células intactas
- Perfusiones: capa celular endotelial, o de células
epiteliales
- Preparaciones de membrana de células asimétricas
(microvellosidades, en contacto
con el medio extracelular), y
su posterior solubilización
¿Para qué se desintegran los tejidos y romper las
células?
Para tener información sobre metabolitos, sus concentraciones y localizaciones Para conocer localización de enzimas para asociarlas a vías metabólicas o a procesos intracelulares
¿Cuáles son los problemas de desintegrar células y
qué precauciones deben tomarse?
Cambios en las concentraciones de los metabolitos y enzimas/proteínas, degradación de las proteínas por las enzimas endógenas (lisosomales). Condiciones de Tº, pH, salinidad (Fuerza iónica) compatibles con la estabilidad de los metabolitos y de las proteínas (enzimas). Homogeneización de tejidos vegetales: pared celular, vacuolas llenas de enzimas, poco contenido proteico. En plantas fotosintéticas cambia el contenido del almidón en el día y en la noche.
Precauciones que se deben tomar para conservar
actividades enzimáticas y metabolitos
Potter Elvehjem, adosado a motor
Dounce: manual
Tipos de homogeneizadores
Sonicador
Ultraturrax o Polytron
Mortero y pistilo
Prensa French (10.000 N/cm 2 )
Centrifugación diferencial
Rotor de ángulo fijo
Cabezal de ángulo fijo
“swinging bucket”
Observación de las de fracciones separadas mediante distintas técnicas microscópicas
Microscopio electrónico
Microscopios de fase invertida, constraste de fases, epifluorescencia
Microscopio confocal
Fraccionamiento diferencial de tejido hepático
Núcleos RER (microsomas) Peroxisomas
Unión a membrana celular a través de lípidos
Fosfolipasa C que hidroliza tallo GPI (glicosilfosfatidil inositol) o PI-PLC
PI-PLD
¿Cómo conocer el tipo de localización en la
membrana?
PI-PLC: fosfolipasa C que hidroliza tallo de glicosilfosfatidil inositol PLD: fosfolipasa D; PK: Proteinasa K; T: Total (inicial); S: sobrenadante; P: pella o sedimento (no solubilizado)
Citometría de flujo y FACs (cell sorter)
clasificadores de células
La citometría permite identificar y separar células en
base a tipo de fluorescencia que emitan
Marcaje fluorescente utilizando anticuerpos
específicos marcados
Determinación contenido celular de DNA o RNA
usando colorante fluorescente asociado a ellos
El FACs permite aislar poblaciones celulares
purificadas
Representación esquemática de un equipo de
FACS (clasificador de células
Células endoteliales de arteria pulmonar de
bovino, aplicaciones de distintos fluoróforos
Mitocondria (Texas red dye) Actina (Faloidina)
Núcleo (DAPI)
Referencias
Fraccionamiento subcelular Alberts B, et al, Mol Biol of the Cell Lodish H, et al, Biol Celular y Molecular Darnell et al, J Molecular Cell Biology Cooper J Cell Biology
Ectoenzimas Human placental ecto-enzymes: studies on the plasma membrane anchorage and effect of inhibitors of ATP-metabolizing enzymes. Chayet L, Collados L, Kettlun AM, Campos E, Traverso-Cori A, García L, Valenzuela MA. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 1997 Apr;96(1):14-. Nucleotide- and nucleoside-converting ectoenzymes: Important modulators of purinergic signalling cascade. Gennady G. Yegutkin. Biochimica etBiophysica Acta 1783 (2008) 673–
Cell sorting : MACS de Beckton-Dickenson. http//www.miltenyibiotec.com/macs/principle/sep_strate.htm
