Tema 2: Observación de microorganismos
Poder de resolución y contraste
Una lente es un conjunto de prismas donde los rayos convergen en el punto focal. La distancia entre el centro de
la lente y el punto focal es la distancia focal. A menor distancia focal mayor aumento, lo que supone una lente
fuerte. Con el aceite de inmersión se consigue mayor poder de resolución.
Son necesarios microscopios con dos lentes, que cambian la velocidad 2 veces, habiendo 3 de ellas (REFRACCION:
cuando la luz cambia de velocidad al pasar por una lente). Cuando pasa por el vidrio, disminuye y al salir de este,
vuelve a aumentar. En una lente, sn como un conjunto de prisma. Los rayos se concentran en un punto, punto
focal. El índice de refracción es la medida con que cambia la velocidad. Cuando menor es la distancia focal, mayor
aumento del tamaño del objeto.
Para mayor visión se tiñe, primero se deshidrata con calor (no se pueden teñir y verlos vivos). Una vez
deshidratado se tiñe (tinción simple)
Otro tipo de tinción es la de GRAM, donde se distinguen dos tipos de organismos vivos (tinción diferencial), según
su pared celular. Se tiñe con cristal violeta, luego se pone alcohol durante 20 seg., una vez se seca el etanol, se
pone otro tipo de tinción. Los GRAM+ son los violeta y los rosas los GRAM-
A parte, existen tinciones especificas, con tinta, para ver las capsulas de las bacterias.
Refracción: Cuando un rayo de luz pasa de un medio a otro, el rayo se desvía en la interfase.
Índice de refracción: medida de la intensidad con que una sustancia disminuye la velocidad de la luz.
Una lente funciona como un conjunto de primas: Los rayos de luz de una fuente distante se enfocan en un punto
focal (F). El índice de refracción del aire es distinto al del vidrio. Del aire al vidrio la velocidad disminuye. Es la
medida de la intensidad con que una sustancia disminuye la velocidad de la luz
DISTANCIA FOCAL (A MENOR distancia focal más conseguimos aumentar el tamaño del objeto)
Las células pueden verse por las diferencias de contraste con el medio que las rodea.
El contraste es debido a que las células absorben o dispersan la luz.
La distancia mínima entre dos puntos muy pequeños que pueden distinguirse o separarse uno de otro se conoce
como RESOLUCIÓN y determina la máxima amplificación útil de microscopio óptico. A menor distancia minima
entre los dos puntos viéndolos como dos entidades, mayor resolución.
Microscopía de campo claro
MC de campo claro: con fuente de luz en su base, condensador de luz en la platina (donde se coloca la muestra).
El máximo aumento posible es x1500. La mayor resolución es de 0,2micrometros (PODER DE RESOLUCION:
distancia minima para ver dos entidades, muy juntas, separadas). (Se ve en blanco y negro).
Objetivos: 10x, 20x, 40x y 100x
Ocular: 10x y 15 x
Resolución máxima: 0,2μm
Máxima amplitud: 1500x
Tinción simple y tinción diferencial
Simple
Diferencial: un ejemplo es la tinción Gram (diferencia a las bacterias entre Gram + y Gram -)
Procedimiento:
1. Se tiñen tolas las bacterias de azul
2. Se añade etanol
3. Unas quedan teñidas y otras pierden la tinción
4. Se tiñe de nuevo con colorante de contraste
5. Obtenemos bacterias azules (Gram +) y bacterias rosas (Gram -)
Colorantes
Hay dos tipos de colorantes:
•Colorantes catiónicos o básicos
•Colorantes aniónicos o ácidos
Microscopía de campo oscuro
El fondo aparece oscuro y el microorganismo brillante. La única luz que pasa el objetivo es la que parte de la
muestra. MC de campo oscuro, es un MC óptico en donde la luz que llega a la muestra llega lateralmente, y
atraviesa directamente a la muestra, con lo que se obtiene un buen contraste sin la necesidad de teñir.
Microscopía de contraste de fase
El fondo es la luz no difractada (claro) y el microorganismo en oscuro. Lo que hace es aumentar el contraste entre
el medio y la muestra. El fondo queda más claro y la muestra más oscura. Esto se basa en los cambios de
refracción de los distintos medios. Convierte pequeñas diferencias en los índices de refracción y densidad celular
en variaciones en intensidad luminosa. Este método es excelente para ver CELULAS VIVAS.
Microscopía de fluorescencia
Ciertos compuestos químicos absorben energía en longitud de onda corta y emiten energía en longitud de onda
larga, dentro del campo de lo visible, y es lo que conocemos como fluorescencia.
Las muestras se tiñen con fluorocromos en caso de que la muestra no sea fluorescente.
El fondo es la luz no difractada (claro) y el microorganismo en oscuro.
