¡Descarga Ácido Valproico y Malformaciones Congénitas: Relación con las Células de Purkinje y más Ejercicios en PDF de Neurociencia solo en Docsity!
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje
Malformaciones congénitas en ratas expuestas
prenatalmente al ácido valproico y su relación
con el número de células de Purkinje
Congenital malformations in rats prenatally exposed to valproic acid and their relationship with Purkinje cells counts
Contribución Original
M.C. Ángel Alberto Puig- Lagunes^1 M.V.Z. Eliseo Velazco-Cercas^1 Q.F.B. Issac Zamora-Bello Issac^1 Dr. Luis Beltrán-Parrazal^2 Dra. Consuelo Morgado-Valle^2 Dr. Jorge Manzo^2 Dra. María Leonor López- Meraz^2 (^1) Doctorado en Investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana, Xalapa, México. Médico y Odontólogos, Col. Unidad del Bosque C.P. 91010, Xalapa, Veracruz, México. (^2) Centro de Investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana, Xalapa, México. Médicos y Odontólogos s/n, Col. Unidad del Bosque, Cp. 91010, Xalapa, Veracruz, México.
Resumen
Introducción: El ácido valproico (AVP) es un fármaco comúnmente
empleado para el tratamiento de la epilepsia, las manías agudas y el trastorno bipolar. A partir de su uso como antiepiléptico se identificó que su empleo durante el embarazo puede producir malformaciones congénitas, el síndrome fetal del valproato y aumenta el riesgo de padecer autismo. Existe un modelo experimental en ratas para reproducir estos trastornos aplicando el AVP durante la etapa embrionaria, en el que también se producen cambios en la anatomía cerebelar observados en pacientes con autismo.
Objetivo: Describir algunas malformaciones detectadas en
ratas después de la exposición prenatal al AVP y su correlación con alteraciones en el número de células de Purkinje en el vermis cerebelar.
Métodos: El AVP (600mg/kg) se aplicó a las ratas gestantes durante
el día embrionario 12; ratas control se administraron con solución salina. Las ratas con malformaciones y sus respectivos controles se eutanizaron al día 40 posnatal, y el número de células Purkinje se determinó en secciones sagitales del vermis teñidas con la tinción de Nissl.
Resultados: Las ratas tratadas prenatalmente con AVP presentaron
diferente grado de malformación en la cola e incluso polidactilia en las patas traseras. A nivel histológico se identificó una disminución de las células de Purkinje en los lóbulos VI, VII, VIII y X del vermis. Existió una correlación lineal positiva entre el número de células de Purkinje en el lóbulo VIII-B y la severidad de la malformación observada; no se identificó correlación entre los dos parámetros en ningún otro lóbulo cerebelar analizado.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje
Keywords
Valproic acid, congenital malformations, cerebellum, Purkinje cells
Introduction: Valproic acid (VPA) is a commonly
used drug for the treatment of epilepsy, acute manias and bipolar disorder. It is known that the use of AVP during pregnancy an produce congenital malformations, the fetal valproate syndrome and augment the risk for autism. This disorders haven been modeled in the laboratory by injecting VPA during the embryonic period rats, inducing additionally modifications in the cerebellar anatomy similar to those detected in people with autism.
Objective: The goal of this study was to describe
some congenital malformations observed in rats exposed prenatally to VPA and its correlation with the number of Purkinje cells from the cerebellar vermis.
Methods: VPA (600mg/kg) was applied to
pregnant rats during the 12th embrionic day; control rats were injected with saline during the same day. Rats with malformations and control rats were euthanized during the postnatal day 40 and the number of Purkinje cells was determined in sagittal sections from the medial vermis stained with Nissl technique.
Results: The prenatal exposure to AVP
produced different severity of tail malformations and toe polydactyly, as well as a decrease in the number of Purkinje cells in the lobules VI, VII, VIII y X. A lineal positive correlation between the malformation severity and the number of Purkinje cells was observed in the lobule VIII-B; however, no correlation was detected between those parameters in any additional lobe.
Conclusion: There is not correlation between
the severity of the malformations produced by VPA and the decrease in the number of Purkinje cells. These findings are relevant for a better understanding of the VPA experimental model in the rat. Correspondencia: Dra. María Leonor López-Meraz Centro de Investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana. Unidad de Ciencias de la Salud, Médicos y Odontólogos s/n, Col. Unidad del Bosque, Cp. 91010, Xalapa, Veracruz, México. Tel: + 52 (228) 8418900 Ext. 16305 Correo-e: [email protected]
Abstract
Conclusión: no existe correlación entre el grado
de severidad causado por el AVP en ratas y la disminución en el número de células de Purkinje. Estos hallazgos son de relevancia para el mejor entendimiento del modelo experimental del AVP en la rata.
Palabras clave.
Ácido valproico, malformaciones congénitas, cerebelo, células de Purkinje.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje
(E1). Cada hembra preñada se alojó en una caja individual con libre acceso a agua y alimento. El valproato de sodio (Sigma) se disolvió en solución salina fisiológica y se aplicó una dosis de 600 mg/ kg, i.p. a las hembras gestantes durante día de embrionario 12 (E12), siguiendo el protocolo descrito por Ingram y colaboradores^23. Las ratas control recibieron una inyección de solución salina durante el día E12.
Procesamiento del tejido.
El día posnatal 40 se seleccionaron las ratas control (n=3) y las ratas expuestas al AVP que presentaron malformaciones en diferente grado de severidad (n=4) y se anestesiaron con una sobredosis de pentobarbital sódico (50 mg/Kg; i.p.). Posteriormente, se decapitaron y se extrajeron los cerebelos, para después fijarlos por inmersión durante 7 días en paraformaldehído (Sigma) al 4% preparado en solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M. Al cabo de la fijación, el tejido cerebral se crioprotegió en una solución de sacarosa al 30% y se cortó en un criostato (Leica) para obtener rebanadas sagitales de 40 μm de grosor a nivel del vermis medial. Los cortes se colocaron en portaobjetos previamente gelatinizados y se almacenaron a -70ºC hasta su procesamiento.
Tinción de Nissl y conteo celular.
Las secciones cerebelares se tiñeron con la tinción de Nissl. Para este fin, las secciones se hidrataron en aguda destilada y posteriormente se colocaron en una solución de violeta de cresilo (Sigma, 5%, pH 2.8) durante 5 min. Transcurrido este tiempo, los cortes se lavaron con agua, se deshidrataron con concentraciones crecientes de etanol, se aclararon con xileno y se montaron con un medio no acuoso (Permount; Fisher Scientific) para su posterior análisis. Para el conteo celular, se emplearon 3 secciones sagitales por cada animal que incluyeran los 10 lóbulos cerebelares. Con un microscopio óptico (Leica) se tomaron fotografías con un aumento del 40X en la porción apical de los lóbulos VI (sublóbulos VI-A, VI-B, y VI-C), VII (sublóbulo VII-A), VIII (sublóbulos VIII-A y VIII-B) y IX (sublóbulos IX-A, y IX-B). Se contabilizó el número de células de Purkinje presentes en 78505 μm
Animales.
Para realizar las cruzas se emplearon ratas hembras y machos adultas de la cepa Wistar que se obtuvieron de la compañía Rismart México. Las ratas se alojaron en cajas colectivas de acrílico (43 X 53 X 20 cm) en el bioterio del Centro de Investigaciones Cerebrales de la Universidad Veracruzana, en condiciones ambientales de temperatura y humedad con libre acceso a agua y alimento (Rismart®) y con ciclos normales luz- oscuridad de 12 h (08:00-20:00 h). Posterior a las cruzas, las madres gestantes y las madres con sus crías, se mantuvieron en las mismas condiciones de bioterio pero en cajas de alojamiento individuales (27 X 37 X 15 cm). Las crías se destetaron el día posnatal 21 y se alojaron en cajas colectivas con individuos del mismo sexo hasta el día posnatal 40 cuando se eutanizaron. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo a las regulaciones vigentes para el uso y cuidado de animales de investigación de México (NOM-062-ZOO-1999).
Administración de ácido valproico.
Para las cruzas, se emplearon ratas hembras que se encontraban en la fase de estro y proestro, mismas que se colocaron con un macho sexualmente experto durante toda una noche en cajas de acrílico transparente (43 X 53 X 20 cm). Al día siguiente, se realizaron frotis vaginales para identificar la presencia de espermatozoides y entonces considerar que las hembras estaban preñadas. Este día se consideró como el día embrionario 1
Materiales y métodos
objetivo del presente estudio preliminar es describir algunas de las malformaciones que se detectan en ratas debido a la exposición al AVP in utero y relacionarlas con cambios en la anatomía cerebelar y con el número de células de Purkinje en los lóbulos VI, III y IX y sus respectivos sublóbulos del vermis cerebelar. Los hallazgos resultan de interés debido al amplio uso que este modelo experimental tiene hoy en día para el estudio de trastornos del desarrollo y particularmente del autismo.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje
Malformaciones congénitas identificadas
En este estudio se identificó que no todas las ratas expuestas prenatalmente al AVP presentan malformaciones congénitas externas. Aproximadamente el 70% de las ratas presentaron algún grado malformación al nacer, principalmente en la cola. Para este estudio se seleccionaron 4 ratas que mostraron diferente grado de malformación de la cola y una que adicionalmente presentó polidactilia; este grupo estuvo conformado por dos hembras y dos machos Las ratas cuya madre recibió solución salina no presentaron malformaciones externas de ningún tipo y se seleccionaron 3 machos para el estudio. Las ratas expuestas prenatalmente al AVP mostraron malformaciones congénitas externas
Resultados
en distintos grado, mismas que se clasificaron como se describe a continuación: Categoría 1, correspondió al menor grado de malformación, en este caso la rata mostró dos torceduras leves en la cola, una cerca de la base y la otra en cerca de la punta, sin afectarse el tamaño ni la dirección de la misma; categoría 2, la rata presentó dos torceduras prolongadas en la cola, lo cual modificó su dirección y tamaño; categoría 3, la rata mostró un mayor grado de malformación en la cola, presentando múltiples torceduras, ensanchamiento y disminución del tamaño de la cola (65% comparado con el tamaño promedio en las ratas control); categoría 4, la rata presentó un grado de deformidad en la cola similar a la rata de la categoría 1 y además polidactilia (siete dedos) en ambos miembros posteriores (Figura 2). en cada sublóbulo para posteriormente expresar los conteos por mm2 (Figura 1). Se seleccionaron estos lóbulos ya que son los que a priori mostraban una mayor variación en su morfología gruesa y que previamente han mostrado cambios en el conteo celular.
Análisis estadístico.
Para identificar las diferencias entre el número de células de Purkinje en el grupo control y el grupo Figura 1. Fotomicrografías del cerebelo de ratas de 40 días de edad a nivel de los lóbulos VI, VII (panel A), VIII (panel B) y IX (panel C) y sus correspondientes sublóbulos. Los recuadros señalan las áreas contempladas para el conteo de las células de Purkinje. La barra de calibración corresponde a 1 mm (A) y 500 μm (B y C). de ratas expuestas prenatalmente con AVP se realizo una prueba t de Student para cada lóbulo. La correlación entre los diferentes grados de deformidad por la exposición al AVP y el número de células de Purkinje se calculó por el método de correlación de rango de Spearman. En ambos casos se utilizó el programa Graphpad Prism versión 6 para el análisis estadístico y para evaluar la existencia de diferencias estadísticamente significativas se consideró un nivel alfa de p < 0.05.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje 34
Correlación entre grado de malformación
y el número de células de Purkinje
Para determinar si existía alguna relación entre los diferentes grados de malformación que presentaron las ratas expuestas prenatalmente AVP y el número de células de Purkinje se realizó una correlación. Se identificó que el sublóbulo VIII-B presenta una correlación lineal positiva (r=0.98, p=0.01), la cual indica que a mayor grado de malformación mayor es el número de células de Purkinje. En el resto de los lóbulos evaluados no existió correlación entre el grado de malformación y el conteo de las células de Purkinje (Figura 4). 250 VI-A (r=-0.20, p=0.91) VI-B (r=-0.31, p=0.50) VI-C (r=-0.63, p=0.33) 200 150 1 2 3 4 Lóbulo VI Grado de malformación Células de Purkinje /mm (^2) VII-A (r=-0.80, p=0.33) Grado de malformación 250 200 150 1 2 3 4 Lóbulo VII Células de Purkinje /mm (^2) 250 VIII-A (r=0.56, p=0.65) VIII-B (r=0.98, p=0.01) 200 150 1 2 3 4 Lóbulo VIII Grado de malformación Células de Purkinje /mm 2 IX-A (r=0.50, p=0.99) Grado de malformación 250 200 150 1 2 3 4 Lóbulo IX Células de Purkinje /mm 2 IX-B (r=1.0, p=0.331) Figura 4. Correlación entre el grado de malformación de las ratas y el número de células de Purkinje identificadas en los lóbulos VI, VII, VIII y IX del vermis cerebelar. Existió una correlación lineal positiva entre los dos parámetros en el lóbulo VIII-B (*p<0.05), en el resto de los lóbulos analizados no se identificaron diferencias. La correlación se analizó con la prueba de Spearman.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje 35
Anormalidades en la morfología gruesa
de los lóbulos cerebelares.
Al realizar el conteo de las células de Purkinje en las ratas AVP con diferente grado de malformación, se identificó que la morfología de los lóbulos posteriores VI y IX mostraron claras anormalidades en comparación con las ratas control. Todas las ratas AVP presentaron anormalidad en la dirección y en forma la del lóbulo VI. La rata AVP categoría 4, la cual presento polidactilia, se caracterizó por que el sublóbulo IX-A presentó un alargamiento (Figura 5). Figura 5. Fotomicrografías del cerebelo de ratas de 40 días de edad a nivel del vermis medial de una rata tratada con solución salina (SS) y de ratas pretratadas con ácido valproico (AVP) con diferentes grados de malformación. Note que la morfología macroscópica expone la existencia de un alargamiento principalmente de los lóbulos VI y IX cerebelares en las ratas expuestas al AVP. La barra de calibración corresponde a 1 mm.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje 37 La hipoplasia cerebelar es una patología frecuentemente observada en los pacientes con TEA, aunque no todos la presentan 21,38. Se sugiere que las anomalías cerebelosas en los pacientes autistas pueden ser peri o prenatales, ya que han sido encontradas desde la infancia y son persistentes durante el desarrollo posterior 37,. Distintos estudios realizados en ratas muestran que la exposición al AVP durante el periodo embrionario, modifica la estructura del cerebelo y este a su vez puede estar implicado en algunas de las deficiencias conductuales observadas en este modelo 23,31. De hecho, algunos de los comportamientos claramente observados en estos abordajes experimentales incluyen ansiedad, déficit de interacción social y comunicación, aumento de los comportamientos estereotipados y repetitivos, así como actividad exploratoria escasa 6,23-28. Aunque el autismo es un trastorno del neurodesarrollo de etiología diversa^41 , es posible que la hipoplasia cerebelar, aunada con otras anomalías estructurales y funcionales en otras regiones del cerebro como el lóbulo parietal, pueden afectar la capacidad del paciente con TAE para interaccionar socialmente e incluso para aprender, realizar y resolver situaciones básicas de la vida cotidiana de carácter no social 15,42. Así mismo, anomalías en la estructura del cerebelo pueden ocasionar alteraciones de otros circuitos dentro y fuera del mismo, afectando conexiones con otras regiones cerebrales 15-17,37,40,. Un hallazgo adicional que se presenta en este trabajo es que las ratas con una mayor severidad de la malformación externa observada no presentan un menor número de células de Purkinje como podría esperarse. De hecho, únicamente en el sublóbulo VIII-B se observó una correlación lineal positiva entre el grado de malformación y el conteo celular. Esta relación indica que a mayor grado de malformación se presenta un mayor número de células de Purkinje, lo cual resultó inesperado. Este hecho, resulta importante ya que pone de manifiesto que la exposición prenatal al AVP afecta la viabilidad de la células de Purkinje de la rata, ya sea en ausencia o presencia de malformaciones congénitas severas. Además, evidencia el hecho de que aquellos animales con mayor defectos externos no necesariamente presentan una afectación cerebelar mayor y expone la heterogeneidad que se presenta en este modelo. Estudios previos mostraron que no todas las crías expuestas prenatalmente al AVP presentan este tipo de deformidades 27,29,35. Lo anterior, hace preguntarse si las malformaciones externas observadas en estos animales podrían ser un indicador de anormalidades en la anotomía cerebelar y por ende en su comportamiento. Sin embargo, nuestros datos no apoyan esta propuesta pero si la heterogeneidad del modelo experimental. Hasta el momento no se ha evaluado si la cantidad de AVP que cada feto absorbe in utero está implicada directamente con las deformidades externas como internos que presentará al nacer.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje
Conclusión
Declaración de conflictos de interés
Los autores declaran que en este estudio no existen conflictos de interés relevantes.
Fuentes de financiamiento
Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México por la beca de estudios de doctorado otorgada a AAPL (212825) y por el donativo de Investigación Básica otorgado a MLLM (CB-2008-106402). Los resultado indican que la exposición prenatal al AVP disminuye el número de células de Purkinje en los lóbulos VI, VIII y IX del vermis cerebelar, efecto que no se relaciona con la severidad de la anormalidad externa que se presenta. Lo anterior resalta la importancia de continuar la caracterización de este modelo experimental de autismo, que permita entender mejor las diferencias que pueden existir entre las ratas que presentan malformaciones congénitas de aquellas que no las presentan, y si estas pueden ser un indicador fiable de anormalidades en la anatomía y fisiología del cerebelo, así como alteraciones en el comportamiento similares a las observadas en el autismo.
Ácido valproico, malformaciones congénitas y células de Purkinje 40
- Bambini-Junior V, Rodrigues L, Behr GA, Fonseca Moreira JC, Riesgo R, Gottfried C. Animal model of autism induced by prenatal exposure to valproate: Behavioral changes and liver parameters. Brain Res 2011; 1408:8–16.
- Kim KC, Kim P, Go HS, Choi CS, Yang SI, Cheong JH, Shin CY, Ko KH. The critical period of valproate exposure to induce autistic symptoms in Sprague-Dawley rats. Toxicol Lett 2011; 201:137–142.
- Roullet FI, Lai JKY, Foster JA. In utero exposure to valproic acid and autism — A current review of clinical and animal studies. Neurotoxicol and Teratol 2013; 36: 47–56.
- Saft P, Toledo-Cardenas R, Coria-Avila GA, Perez-Pouchoulen M, Brug B, Hernandez ME et al. Characterization of four types of tail abnormalities in rats treated prenatally with valproic acid. Revista eNeurobiología 2014; 5:1-6.
- Ogawa T, Kuwagata M, Hori Y, Shioda S. Valproate-induced developmental neurotoxicity is affected by maternal conditions including shipping stress and environmental change during early pregnancy. Toxicol Lett 2007; 174:18–24.
- Rodier PM, Ingram JL, Tisdale B, Croog VJ. Linking etiologies in humans and animal models: studies of autism. Reprod Toxicol 1997; 11:417-22.
- Chen G, Yuan PX, Jiang YM, Huang LD, Manji HK. Valproate robustly enhances AP-1 mediated gene expression. Brain Res Mol Brain Res 1999; 64:52–58.
- Chen B, Wang JF, Hill BC, Young LT. Lithium and valproate differentially regulate brain regional expression of phosphorylated CREB and c-FOS. Brain Res Mol Brain Res 1999; 70:45–53.
- Fuller LC, Cornelius SK, Murphy CW, Wiens DJ. Neural crest cell motility in valproic acid. Reprod Toxicol 2002; 16:825–39.
- Kim KC, Kim P, Go HS, Choi CS, Park JH, Kim HJ et al. Male-specific alteration in excitatory post- synaptic development and social interaction in prenatal valproic acid exposure model of autism spectrum disorder. J. Neurochem 2013; 124:832-843.
- Lindhout D, Omtzigt JG. Pregnancy and the risk of teratogenicity. Epilepsia 1992;33:41–48.
- Courchesne E. Brainstem, cerebellar and limbic neuroanatomical abnormalities in autism. Curr Opin Neurobiol 1995; 7:269–278.
- Courchesne E, Redcay E, Kennedy DP. The autistic brain: birth through adulthood. Curr Opin Neurol 2004; 17:489-496.
- Skefos J, Cummings C, Enzer K, Holiday J, Weed K. et al. Regional Alterations in Purkinje Cell Density in Patients with Autism. PLoS ONE 2014; 9:1255-1255.
- Courchesne E. Infante autism part 2. A new neuro-developmental model. Pediatr Int 1995; 10:141-
- Rapin I. Autism in search of a home in the brain. Neurology 1999; 52:902-904.
- Courchesne E. New evidence of cerebellar and brainstem hypoplasia in autistic infants, children and adolescents. J Autism Dev Disord 1995; 25:19-22.
