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Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez Cuestionario mutaciones
1. Concepto de mutación Una mutación es un cambio en la secuencia del ADN. Las mutaciones pueden ser el resultado de errores en la copia del ADN durante la división celular, la exposición a radiaciones ionizantes o a sustancias químicas denominadas mutágenos, o infección por virus., estas pueden traducirse en cambios positivos o negativos en el desempeño vital de los organismos, y en ese sentido pueden impulsar la adaptación y evolución (incluso creando a la larga nuevas especies), o bien pueden convertirse en enfermedades genéticas o defectos hereditarios. 2. ¿Qué son y cuál es la frecuencia de las mutaciones espontáneas? Es una fuente espontánea de alteraciones aleatorias de la información contenida en el material genético. Las tasas de mutación espontáneas son muy bajas, del orden de 10-5-10-6^ por gen y generación 3. Describe qué son las mutaciones puntuales (silenciosa, con sentido erróneo, sin sentido, mutación por cambio de marco de lectura). Da un ejemplo de cada una de ellas. Mutaciones silenciosas: cambio en una de las bases del DNA de forma que el triplete de nucleótidos se modifica, pero sigue codificando para el mismo aminoácido. Esto es así porque el código genético tiene cierto margen de seguridad y para cada aminoácido hay varias combinaciones de tripletes que lo determinan. Por ejemplo, los tripletes CCA y CCC determinan que en esta posición de la proteína se sitúe una prolina. Así, si se produce por error este cambio, será un cambio silente, porque el aminoácido codificado por ambos tripletes es el mismo, la prolina. Mutaciones con sentido erróneo: hay un cambio en una de las bases del DNA de forma que el triplete codifica para un aminoácido diferente del que debería, es decir, en esa posición de la proteína habrá un aminoácido incorrecto, lo que puede alterar más o menos la función de la proteína dependiendo de su localización e importancia. Por ejemplo, en la variante más común de anemia de células falciformes, se produce el reemplazo de un único nucleótido ubicado en la posición número 20 del gen de la cadena beta de la hemoglobina. El cambio reemplaza una adenina por una timina Mutaciones sin sentido: Cambian el codón para un aminoácido en un aminoácido de parada que hace que una proteína acorte anormalmente su traducción, por lo general dando lugar a una proteína no funcional. Puede causar una enfermedad genética al dañar el gen responsable de la producción de una proteína determinada, por ejemplo la distrofina en la distrofia muscular Mutaciones por cambios de marco de lectura: Este tipo de mutación se da cuando por inserción o pérdida de pares de bases se cambia el marco de lectura. Para la
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez decodificación, las bases se leen de tres en tres, esto es, cada tres bases determinan un aminoácido. Si se cambia el marco de lectura, cambia la forma de agrupar esas tres bases y se colocaran aminoácidos erróneos habiendo la posibilidad de un triplete STOP prematuro. Las inserciones, duplicaciones y deleciones pueden dar lugar a este tipo de mutaciones. La enfermedad de Crohn se encuentra asociada al gen NOD2. Una mutación con desplazamiento dentro de la región codificante del gen podría ser un factor en la aparición de esta enfermedad. La mutación es una inserción de una citosina en la posición 3020. Esto conduce a la aparición de un codón de terminación prematuro, acortando la proteína que debería ser traducida.
4. Explica a detalle el siguiente esquema: En el esquema se muestra una secuencia de ADN cuya secuencia original es T A C, y su complementaria A T G. En la replicación normal se da el caso de Timina- Adenina-Citosina, con base complementaria de Adenina-Timina-Guanina, siendo su transcripción un codón codificante que es para tirosina; lo que da paso a la traducción de una proteína normal tipo silvestre.
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez TIPOS DE AGENTES MUTAGÉNICOS Como antes hemos dicho, el mutágeno se resume a todo aquello que produce cambios en la información genética (ADN) de un ser vivo.
- Químicos: Se tratan de diferentes compuestos químicos con la habilidad de alterar las estructuras del ADN de forma brusca, como puede ser el ácido nitroso (agente desaminizante), brominas y algunos de sus compuestos.
- Físicos: Son radiaciones que pueden alterar la secuencia y la composición del ADN. Son ejemplos ciertos tipos de radiación, sobre todo las más dañinas como la ultravioleta, la cual origina dímeros de pirimidina (generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que (que son ionizantes). También se consideran agentes físicos los llamados ultrasonidos, con 400.000 vibraciones/segundo, que han inducido mutaciones en regiones como Drosophila y en algunas plantas superiores, y centrifugación, que también producen variaciones cromosómicas de carácter estructural.
- Biológicos: Son aquellos organismos “vivos” que son capaces de alterar las secuencias del material genético de su hospedador; como, por ejemplo; virus, bacterias y hongos. Serían ejemplo los transposones (fragmentos autónomos de ADN). 6. Detalla el mecanismo de acción sobre el DNA de cada uno de los agentes mutagénicos. ● Mutágenos físicos La radiación ultravioleta, componente de la luz solar, provoca la reacción entre dos residuos de timina adyacentes en la misma hebra, formando a partir de sus dobles enlaces anulares un sistema tricíclico con un anillo de ciclobutano, que se conoce como dímero de timina. Esta asociación covalente de dos timinas impide que pueda emparejarse con sus adeninas complementarias y origina una estructura tridimensional localmente incompatible con el giro de la doble hélice, que fuerza una flexión en la molécula del ADN. Además, se paraliza la replicación, pues la ADN polimerasa no puede reconocer los dímero y se detiene. La irradiación UV también origina otra reacción entre timinas adyacentes, con formación de dímeros diferentes llamados foto productos, en los que el enlace aparece entre el C-6 de una timina y C-4 del adyacente.
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez ● Mutágenos químicos Análogos de bases: Los análogos de bases son tan semejantes que la célula los incorpora en el ADN durante la replicación, opuestamente, a causa de ciertas diferencias estructurales entre análogos y bases normales, éstos se aparean de manera imprecisa, lo que conduce a errores frecuentes. Uno de los mutágenos más comunes es el 5-bromuro de uracilo (figura 1), que se incorpora en lugar de la timina durante la replicación. Agentes químicos alquilantes: Un agente alquilante, adhiere grupos alquilos a las bases del ADN. Esta alteración resulta en que el ADN sea fragmentado por las enzimas de reparo cuando éstas tratan de reemplazar las bases alquiladas. Un segundo mecanismo por el cual los agentes alquilantes
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez Durante la replicación, esta conformación anormal puede conducir a micro inserciones o microdeleciones en el ADN, originando mutaciones por corrimiento de lectura. Para el caso de inserciones, es posible que por deslizamiento entre bases de la cadena plantilla, estos mutágenos hacen que la ADN polimerasa inserte un nucleótido adicional frente a la molécula intercalada, duplicando la distancia típica entre dos pares de bases. En cambio en las deleciones, la distorsión de la plantilla causada por la presencia de una molécula intercalada haría que la polimerasa se saltara un nucleótido. Ejemplos de mutágenos químicos.
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez ● Mutágenos biológicos Respecto a los mutágenos biológicos, son de especial importancia los cambios en el ADN que producen los virus, y aunque se conoce muy poco de esta relación, se han reportado desde simples rompimientos cromosómicos hasta pulverización total del complemento cromosómico. Los virus se insertan en el ADN hospedero debido a que poseen enzimas de restricción (éstas tienen la capacidad de romper el ADN en una secuencia de bases específica). Las inserciones y deleciones pueden activar protooncogenes cuando éstos quedan cerca de una región o de otro gen que tiene una replicación o expresión continua o amplificada, los protooncogenes pueden ser activados por mutaciones puntuales, translocaciones, inserciones retrovirales o amplificación. Los transposones son secuencias de ADN capaces de insertarse en una nueva localización en el genoma, algunos de ellos eucarióticos están relacionados con retrovirus. También pueden moverse de un organismo a otro, generando mutaciones por su inserción. Los retrotransposones, así como secuencias genómicas (ADN dúplex), pueden transponerse (cambiar
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez células / ml. Las celdas (1 ml) se irradiaron con luz ultravioleta a diferentes intervalos de tiempo (5,10,15,20 y 30 min.) En placas de Petri. Las células expuestas luego se transfirieron a nutrientes medio caldo (10 ml) que se incubó durante 24 ha 30 ° C con agitación a 200 rpm. Después de 24 h de incubación estos cultivos fueron sometidos a antibióticos. prueba de resistencia. · Mutación química: Se realizó la mutagénesis de etilmetanosulfonato (EMS) de A. odorans por el método de Watson y Holloway (1976). Se agregaron 0, ml de EMS a 5 ml de un cultivo de fase exponencial desarrollado en caldo nutritivo, agitado vigorosamente, y se incubó a 37 ° C durante 1 h sin agitar. Las celdas fueron recogidas por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min. y luego lavado con solución salina para eliminar el mutágeno. Se inoculó 1 ml del cultivo tratado en 50 ml de caldo nutritivo y se incubó a 30 ° C durante la noche con agitación para expresión de mutantes. Después del período de incubación, estos cultivos se sometieron a la prueba de resistencia a los antibióticos para identificar los mutantes. · Prueba de resistencia a antibióticos: La suspensión celular (0,1 ml) de cultivos diluidos en serie de los tratamientos anteriores (luz UV y EMS) se transfirieron a placas de Petri estériles, que contiene agar nutritivo fundido impregnado con el antibiótico respectivo y bien mezclado. Los antibióticos estudiados fueron cloranfenicol, estreptomicina y ampicilina. Después de la solidificación del agar, las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 h. También se mantuvieron las placas de control que contenían células de la cepa parental. Basándose en la resistencia a los antibióticos, las colonias se seleccionaron y se esparcieron en inclinaciones de agar nutritivo. Las colonias de estas inclinaciones se probaron para determinar la actividad de proteasa. en placas de agar con leche desnatada. · Cribado y selección de mutantes en placas de agar de leche desnatada: La suspensión celular (mutantes) preparada a partir de los cultivos inclinados anteriores. se diluyeron adecuadamente y se colocaron en placas de agar de selección que contenían 2% la leche desnatada en polvo. Colonias que muestran una zona clara de hidrólisis de caseína. alrededor de sus colonias (indicación de actividad de proteasa) se recogieron y rayado en inclinaciones de agar nutritivo.
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez Suspensión celular preparada a partir de estas inclinaciones se comprobaron además la producción de proteasas en medio de cultivo. · Condiciones de cultivo líquido: La suspensión celular preparada a partir de las inclinaciones anteriores se cultivó en medio de producción de proteasa. El medio de producción contiene (g / l): K2HP04. 0,2; MgS04. 7H20, 0,5; NaCl, 0,5; CaCl2. 2H20, 0,5; peptona, 5,0; y harina de soja, 5,0. El pH inicial del medio se ajustó a pH 8,0. Los matraces se esterilizaron a 121 ° C durante 15 min a una presión de 15 psi. Los frascos se inocularon con inóculo al 1 % (v / v) que contenía aproximadamente 1x10 'células y se incubó en un agitador arbital a 30 ° C durante 48 ha 200 rpm. Después del periodo de incubación, el caldo de cultivo se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 mino. en una centrífuga refrigerada a 4 ° C y el sobrenadante libre de células se utilizó como fuente de enzima para el ensayo de la actividad proteasa. · Ensayo de proteasa: La actividad de la proteasa se ensayó mediante el método modificado de Anson. · Caracterización bioquímica de la cepa mutante: El cultivo que muestra una mayor actividad de proteasa que la cepa parental. RESULTADOS. · Estudios de mutaciones: Dos tipos diferentes de mutación a saber. irradiación con luz ultravioleta y se emplearon tratamientos con EMS para obtener cepas mutantes de A. odorans. · Irradiación con luz ultravioleta: Las colonias expuestas a la luz ultravioleta y que muestran resistencia a cloranfenicol fueron seleccionados como las cepas mutadas ya que la cepa parental fue sensible al cloranfenicol y resistente a ampicilina y estreptomicina. En la base de la resistencia al antibiótico cloranfenicol la cepa seleccionada fue probada para actividad de proteasa en placa de agar de leche desnatada. Se compararon las colonias que mostraban una zona clara alrededor de sus colonias. con la cepa parental preparada por separado. El diámetro de la zona fue medido como el índice de
Rosas Gomez Aida Josefina, Sandoval Trejo Ana Itzel. Módulo: Obtención de metabolitos de Interés Industrial para la salud. Fecha de entrega: 11 de mayo de 2021. Profesora: Angélica Gutiérrez ● El diámetro de la zona medido con el índice de actividad enzimática, las seis colonias exhibieron un área màs grande de zona clona fue aislado y probado para la producción de proteasa en condiciones de cultivo líquido.
