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DUPLICACIÓN DEL ADN
CARACTERÍSTICAS DE LA DUPLICACIÓN DEL ADN
Aunque los principios generales de la duplicación o replicación del ADN son sencillos y pueden considerarse como consecuencia directa de su estructura, el proceso requiere una maquinaria compleja que contiene una gran cantidad de enzimas y proteínas que actúan en conjunto.
Fig. 12.9 - La duplicación del ADN se produce previo desenrollamiento de las dos cadenas de la doble hélice, usando cada una como molde para sintetizar las nuevas cadenas.
1. MÚLTIPLES PUNTOS DE ORIGEN
Los cromosomas eucariontes tienen una gran cantidad de ADN, el cual se halla contenido en dos moléculas lineales, una para cada cromátide. Si estas moléculas se replicasen a partir de un sitio único de origen, la etapa “S” de la Interfase sería extremadamente larga. Las células eucariontes resuelven este problema disponiendo de múltiples sitios de origen de la replicación en cada cromosoma. En ellos, el ADN presenta secuencias especiales de nucleótidos. Además todos los orígenes tienen en común secuencias conservadas de aproximadamente doce pares de nucleótidos, llamados ARS (autonomus replication secuence).
Fig. 12.10 - La replicación siempre comienza en los sitios de origen en cada cromosoma. En ellos el ADN presenta secuencias especiales de nucleótidos
- DESENROLLAMIENTO DE LAS CADENAS DE ADN
En cada cromosoma, las dos cadenas del ADN se encuentran arrolladas una a la otra como los hilos de una soga. Si tratamos de separarlas, la soga debe apretarse más en las vueltas restantes o girar. Algo similar ocurre en el ADN, cuando las cadenas complementarias se separan para iniciar la
duplicación. En ese momento aumenta la tensión torsional en el sector no duplicado de la doble hélice.
Fig. 12. 11 - Separación progresiva de las dos cadenas de ADN a nivel de la horquilla de replicación y su posible consecuencia biológica. El desenrollamiento es realizado por las enzimas ADN-helicasas , las cuales recorren la hélice desenrollando las hebras del ADN a medida que avanzan. Una vez separadas, las cadenas se combinan con las proteínas SSB , llamadas también proteínas desestabilizadoras, que evitan el autoapareamiento entre las bases complementarias libremente expuestas.
Fig. 12.12 - Cadenas adelantada y retrasada del ADN durante la replicación. La helicasa separa a las dos cadenas del ADN y las proteínas SSB evitan autoapareamientos entre las bases complementarias libremente expuestas en la cadena atrasada. A medida que la enzima helicasa abre la doble hélice, dos enzimas complementarias: la topoisomerasa I y la topoisomerasa II o girasa, van disminuyendo la tensión torsional acumulada por el superenrollamiento en el sector no replicado de la doble hélice.
La topoisomerasa I primero corta una de las cadenas del ADN, luego la cadena cortada gira una vuelta en torno a su propio eje y finalmente vuelve a unir los extremos cortados.
La topoisomerasa II corta las dos cadenas, las cuales luego de girar una vuelta alrededor del eje de la doble hélice, restablecen sus uniones.
Fig. 12. 14 - Esquema que muestra dos replicones contiguos y los puntos donde se origina la replicación (flechas). Puede observarse el carácter bidireccional de la replicación y los sectores donde el ADN se sintetiza en forma continua y discontinua.
4. LA SÍNTESIS DE ADN ES DISCONTINUA
Una de las características de las ADN-polimerasas es que sólo pueden actuar en dirección 5’ 3’, por agregado de nucleótidos en el extremo 3’ de las cadenas nuevas. Como vimos, a medida que se separan las cadenas progenitoras en la horquilla de replicación, una presenta sus nucleótidos en dirección 5’ 3’ y la otra en dirección 3’ 5’. De manera que la primera al ser copiada debería formar una cadena hija en sentido 3’ 5’, algo que las polimerasas no pueden hacer.
Las células solucionan esta situación utilizando estrategias distintas en la construcción de cada una de las nuevas cadenas. La cadena hija que se formó en dirección 5' 3’ se construye en forma continua mediante el agregado de nucleótidos en el extremo 3’ a medida que avanza la horquilla de replicación. En cambio la otra cadena hija es sintetizada de manera discontinua, en pequeños tramos, llamados fragmentos de Okazaki, los cuales se unen entre sí a medida que se sintetizan, por acción de la enzima ADN-ligasa.
Por lo expuesto, podemos decir que la síntesis del ADN es un proceso bidireccional, no sólo porque se produce en dos direcciones divergentes a partir de una misma burbuja de replicación, sino también porque las cadenas de la doble hélice son sintetizadas en direcciones opuestas.
Fig. 12. 15 - Replicación semiconservativa del ADN.
5. MODELO SEMICONSERVATIVO
Como las nuevas hélices de ADN están formadas por una cadena original (preexistente) que sirvió de molde y una cadena nueva (recién sintetizada) decimos que el mecanismo de replicación es semiconservativo.
INICIO DE LA SÍNTESIS DE ADN
Para iniciar la síntesis de las cadenas complementarias se requiere además del ADN molde un cebador o primer, que consiste en una pequeña cadena de ARN de unos diez nucleótidos de largo. La síntesis del cebador es catalizada por una enzima llamada ARN-primasa y el cebador queda unido al ADN temporariamente. Una vezsintetizado el cebador la síntesis continúa si la ADN-polimerasa tiene disponibles suficientes desoxirribonucleótidos trifosfatados (dATP, dGTP, dCCP y dTTP). Éstos se agregan en la cadena nueva de acuerdo a la secuencia de nucleótidos de la cadena que sirve de molde.
Gran parte de la energía requerida durante la replicación la aportan los desoxirribonucleótidos trifosfatados, que hidrolizan los últimos dos grupos fosfato (liberando energía) cuando se unen entre sí.
Iniciada la síntesis de ADN a partir del cebador, la ADN-polimerasa a (alfa) es reemplazado por la ADN-polimerasa e (epsilon), enzima de alta procesividad (más rápida), que elonga la hebra continua, mientras que la ADN-polimerasa d (delta) se encarga de elongar los fragmentos de Okazaki de la hebra discontínua. Las ADN-polimerasa e (epsilon) y d (delta) catalizan la síntesis de las cadenas nuevas agregando nucleótidos en el extremo 3’ de las hebras en formación. Mientras tanto los cebadores de la cadena rezagada son removidos por la actividad nucleasa reparadora de la ADN- polimerasa d (delta) y su lugar es reemplazado por un fragmento de ADN equivalente. Como vimos la cadena continua requiere un solo cebador que
Fig. 12.17 - La energía para el proceso de replicación la proveen los mismos desoxirribonucleótidos trifosfatados, con la hidrólisis de los últimos dos grupos fosfato-
Fig. 12. 18 - Unión del aro de PCNA a la ADN polimerasa
Los fragmentos de Okazaki alcanzan una longitud de 200 nucleótidos. Una vez completa la síntesis de un fragmento ambas enzimas se liberan y vuelven juntas hacia el ángulo de la horquilla de replicación, dejando atrás los 200 nucleótidos del segmento que acaban de sintetizar y otros tantos del ADN molde que se usará para copiar el próximo fragmento de Okazaki.
Como ocurre con la polimerasa d en movimiento, la ADN-polimerasa a no se desprende del ADN debido a que se le asocia un aro de PCNA. Luego el cebador es hidrolizado por una nucleasa, la que se encarga también de reparar errores (segundo sistema de reparación) y los huecos son rellenados con desoxirribonucleótidos por la ADN- polimerasa b (beta). Finalmente los fragmentos de Okazaki son unidos por la ADN-ligasa.
La discontinuidad de la síntesis hace que la hebra mal orientada crezca más lentamente que la otra, que lo hace en forma continua, por esta razón se les asignó el nombre de cadena rezagada y cadena adelantada respectivamente.
Replicación de la heterocromatina
La heterocromatina por estar muy compactada se replica tardíamente durante la fase “S” del ciclo celular.
Síntesis de histonas
Hemos señalado que el ADN se replica en forma semiconservativa, es decir que las cadenas de la doble hélice progenitora, al separarse para su replicación, se comparten por igual en ambos cromosomas hijos. En cambio no se sabe como se segregan las histonas. Es posible que al cabo de la replicación sean heredadas totalmente por uno de los cromosomas hijos, en este caso el otro cromosoma hijo debe procurarse de la totalidad de histonas nuevas.
En su mayor parte las histonas se sintetizan durante la fase “S” de la interfase y se incorporan al cromosoma apenas es duplicado el ADN
Replicación en Procariontes
Muchas de las características esenciales de la duplicación del ADN son universales, aunque existen algunas diferencias entre procariontes y eucariontes debido a que su material genético está organizado de manera distinta.
En las bacterias casi todo el ADN se encuentra formando una cadena circular, en cambio en los eucariontes cada cromosoma no duplicado contiene una cadena lineal asociada a una gran cantidad de proteínas y algo de ARN.
En procariontes al existir un único punto de origen se forma sólo un ojal de replicación. Aquí actúan tres ADN-polimerasas:
Fig. 12.20 - Mecanismo de replicación en procariotas
Cuadro 12.1 - MÚLTIPLES FUNCIONES DE LAS ADN-POLIMERASA EN E. COLI Poli. I y Poli. III · Síntesis de ADN en sentido 5’ 3’ · Exonucleasa en sentido 3’ 5’ · Corrección de errores, removiendo nucleótidos en sentido 5’ 3’ Poli. I · Exonucleasa en sentido 5’ 3’
Cuadro 12.2 - PRINCIPALES ENZIMAS QUE ACTUAN EN LA REPLICACIÓN Enzimas Reacciones que catalizan ADN-polimerasa I (procariontes) Elimina el cebador, reemplazando los ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos. Rellena los huecos del ADN. ADN-polimerasa II (procariontes) Nucleasa, corrige errores.
ADN-polimerasa III (procariontes) Principal enzima de la replicación. Sintetiza la cadena nueva a partir del cebador. Realiza corrección de pruebas. Complejo ADN-polimerasa a- primasa (eucariontes)
La primasa del complejo sintetiza un "primer" de ARN y a partir de dicho primer, la polimerasa a del complejo inicia la síntesis de ADN. ADN-polimerasa e (eucariontes) Polimerización de desoxirribonucleótidos de la cadena adelantada.
ADN-polimerasa d (eucariontes) Polimerización de desoxirribonucleótidos de la cadena rezagada. ADN-polimerasa b , q , l Reparación del ADN.
ADN-polimerasa g (eucariontes) Duplicación y reparación del ADN
mitocondrial. Helicasas Rompen los puentes de hidrógeno, separando las cadenas del ADN. Primasas Sintetizan el primer o cebador. Proteínas SSB Se extienden sobre las hebras del ADN evitando autoapareamientos entre las bases libremente expuestas Topoisomerasas I y II Corrigen el superenrollamiento
