¡Descarga electroforesis del ADN y más Ejercicios en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Laboratorio de Bioquímica aplicada Docente: Ricardo Alonso Hernandez Escamilla Semestre: agosto - diciembre 2022 Práctica de laboratorio # “Electroforesis del ADN” Realización: 7 / septiembre/2022 Entrega: 14/septiembre/ Arely Escobedo Quintana 188698 Elisa Gómez de la Cortina Reyes 208650 Laisha Valeria Contreras Apodaca 205153 Jennifer Mayte Lopez Gonzalez 208679 Resumen La electroforesis en gel de agarosa se utiliza para separar moléculas en función de su tamaño, carga y forma, es muy común para las biomoléculas de ADN, ARN y proteínas. Existen varios tipos de agarosa y el que utilizamos fue el del buffer de carga, en esta práctica se pusieron los 10ml de buffer de carga, se homogeneizó la muestra y que se sacaron los 10ml de esta misma, se junto con la muestra de DNA (se resuspendió) y esta fue puesta en la placa de electroforesis y se dejó durante 30 minutos; pasados estos minutos pudimos observar el barrido que se obtuvo durante la electrólisis y hasta después de varios intentos se logró cuantificar. Esto nos lleva a un resultado positivo debido a que sí se logró la electrólisis y la cuantificación del ADN de la levadura.
Introducción La electroforesis es una técnica para poder separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. Cuanto más grandes son las moléculas mayor debe ser la duración de los campos eléctricos alternos para permitir la reorientación y en última instancia la separación de las mismas. Figura 1. Las etapas de la técnica de electroforesis. La electroforesis en gel de agarosa se utiliza para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas. La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosídicos α(13) y β(14). Las cadenas del polímero de agarosa forman fibras helicoidales, que al solidificar forma una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y > nm (Kirkpatrick 1990). Existen diferentes tipos de agarosa que se clasifican en función de la temperatura a la que se disuelven y solidifican. Las agarosas estándar se disuelven en el buffer a una temperatura de 90-95°C y solidifican a 35-45°C. Las agarosas de bajo punto de fusión se disuelven a unos 65°C y solidifican a 30-35°C. Existen además otros tipos, como las agarosas de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad, que permiten respectivamente una mejor separación y un rango inferior del tamaño de las moléculas a separar. La concentración (p/v) de la agarosa es un parámetro de gran importancia pues determina el rango de tamaños en los que obtendremos una buena separación de los fragmentos de ADN. (Fierro Fierro, S.F) Cuales factores del ADN y la electroforesis se toman en cuenta para llevar con éxito dicha electroforesis la fuerza: los ácidos nucleicos se tienen que moverse a través de un gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción: hará que las
que es usada eficientemente para determinar su concentración, cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de la absorción de UV de una molécula de DNA. (Bartlett JM, Stirling D. 2003) Aplicabilidad/utilidad de la electroforesis en el campo nutricional Lectura de electroforesis
- Si te es posible, carga plásmidos no digeridos, linealizados e irradiados con luz UV uno cerca del otro en el gel de agarosa, luego puedes comparar las bandas entre las muestras.
- En general, las formas de monómero súper enrolladas CCC se mueven más rápido que cualquier otra forma, debido a que ellas tienen la estructura de ADN superenrollada y compacta. Además, aparecerán más abajo en el gel.
- Los monómeros circular abierto (CA) y lineal se mueven más lentamente que el monómero superenrollado CCC. Éstos tienen más dificultad para atravesar los poros de la matriz de gel que la forma CCC. Adicionalmente, la forma CA aparecerá más arriba en el gel. El orden de migración es usualmente la forma del monómero CCC (el más rápido), seguido por la forma lineal y luego la forma CA.
- El plásmido de ADN completamente digerido usualmente muestra sólo una única banda, una forma lineal del plásmido en su carril con el tamaño esperado. El plásmido no digerido puede tener dos formas de mostrar su carril: en forma de dímero CCC y en forma de monómero CCC. La forma de dímero, debido a su mayor y doble tamaño comparado a los monómeros, usualmente se mueve más lento que los monómeros. Adicionalmente, éste aparecerá más arriba en el gel que un monómero. La forma del monómero CCC corre más rápido que la forma lineal digerida del plásmido de ADN.
Tips para identificar la banda correcta a cortar de tu gel de agarosa
- El plásmido de ADN sin cortar en el gel de agarosa es fácil de identificar debido a que éste puede tener dos formas de plásmido (las formas CA y CCC).
- El plásmido digerido, el fragmento de ADN digerido, el producto de PCR y el ADN genómico pueden todos ser una sola banda. Para identificar estas bandas, deberás verificar el tamaño guiándote con el marcador de peso molecular de ADN. El plásmido digerido tiene una forma lineal con el tamaño entre las formas CA y CCC del plásmido no cortado. El ADN genómico tiene un tamaño grande. Así, el ADN genómico usualmente se muestra en la parte más arriba del gel (muy cercano al pozo de carga).
- El fragmento de ADN digerido puede tener una única banda en un tamaño casi similar a un producto de PCR. Este es el tamaño seleccionado y la banda en este fragmento de ADN digerido es la que deseas extraer.
- Al final del carril del producto de PCR, podrás ver una banda tenue indicando pequeñas moléculas. Estas pequeñas moléculas son las moléculas del primer o cebador que unes a otra molécula cebador para formar un cebador dímero. El tamaño de estas pequeñas moléculas no es el tamaño que deseas seleccionar, así que no desearás extraer esta banda. (Cole, K,D,. & Tellez, 2002) (2) Aplicabilidad en nutrición Proteínas en sangre La electroforesis de proteínas en suero (SPEP, por sus siglas en inglés) es un análisis que mide las proteínas específicas en la sangre. El análisis separa las proteínas en la sangre según su carga eléctrica. Separacion de proteinas en alimento El empleo de estas herramientas proteómicas, permite a los profesionales, analistas e investigadores en ciencia de los alimentos abordar diferentes retos actuales como: el desarrollo de metodologías sencillas y rápidas para su aplicación
otra punta y una micropipeta de más volumen para resuspender en esta misma la prueba.
- Para después colocarlo en el primer pozo de la placa de electroforesis.
- Esta placa de electroforesis fue llenada con lader (esterilizante) con 5 mcl
- Se tapó esta placa y se puso a 70 voltios.
- Se verificó que hubiera electrólisis a partir de burbujeo dentro de la placa y se dejó 30 minutos en este proceso de electrización.
- Después de media hora se sacó la placa y se pasó a la lectura de la misma por mecanismo de rayos UV.
- En la electroforesis se observó el barrido que se obtuvo durante la electrólisis y la migración del DNA de la levadura.
- Por otra parte en la cuantificación por biofotómetro se utilizó como punto de partida o margen agua destilada el cual se le conoce como blanco que fue introducido en una celdilla.
- Después de que el biofotómetro tuviera el margen del blanco a partir de esta se cuantifica para menos margen de error.
- al retirar el agua destilada de la celdilla se agregó a esta misma 69 mcl de agua y con esta 1 mcl de muestra del microtubo de DNA de levadura.
- Al poner el microtubo en el biofotometro se tapó la celdilla con aluminio.
- Al ver que salía negativa se agregó otro mcl de muestra.
- En el quinto intento se logró cuantificar con un resultado de 32ng/mcl. Resultados Figura 2: Resultado positivó de la cuantificación de levadura.
Figura 2: Separación de ADN de levaduras por medio de electroforesis en el gel agarosa. Conclusión En conclusión la electroforesis logró separar los ácidos nucleicos de manera eficaz por medio de la gel de agarosa, esto sucedió debido a que la alta resistencia del gel permite que estos puedan lograr separar los fragmentos del ADN. Los geles de agarosa son más eficaces en la separación del ADN entre 100 pb y 25 kb. Para separarlos, se tuvo que utilizar un campo pulso electroforesis en gel. Esto involucra la aplicación de corriente alterna a partir de dos direcciones diferentes. siendo así como los fragmentos del ADN se separan por la velocidad a la que se exponen creando los cambios en la dirección de la corriente. El gel de agarosa o en sí mismo la agarosa puede variar para realizar un punto de fusión bajo, esta se utiliza para poder aislar el ADN y poderlo dividir en fragmentos. Existen tintes que son usados durante la electroforesis que nos ayudan a mostrar la densidad de la prueba o muestra, proporcionar color y simplificar el proceso de carga y los tintes que se desplazan a través del gel y ayuda a dar un estándar de hasta donde se ha movido el ADN. Existen distintos factores que podrían afectar en la electroforesis Carga de muestras incorrectas: A veces sucede que las cargas en las muestras de los pocillos pequeños en el gel son excesivas lo que causa que provoque una mancha grande o que aparezcan más pequeñas de lo que son. también, muy poca muestra puede ser imposible de ver. Además existe la posibilidad de crear un exceso de líquido al momento de pipetear dando la posibilidad de que al momento de la cuantificación esta resulte como negativa. Problemas en la corriente eléctrica: Esto sucede cuando las conexiones positivas y negativas se unen a los extremos incorrectos de la bandeja. También existen problemas con el uso de un voltaje incorrecto. Una tensión demasiado alta puede causar que la muestra llegue al otro
- Cole, K. D., & Tellez, C. M. (2002). Separation of large circular DNA by electrophoresis in agarose gels. Biotechnology progress, 18 (1), 82-87.
- Por el Dr. José Ángel Huerta Ocampo, Doctor en Ciencias en Biología Molecular mayo 7, 2020 por el Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A. C. https://thefoodtech.com/nutricion-y -salud/proteomica-su-utilidad-en-la -ciencia-alimentaria/
- Aaij C. y P. Borst. 1972. The gel electrophoresis of DNA. Biochimica and Biophysica Acta 269: 192-
- Bartlett JM, Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 2003; 226: 3-6.
- Di Carlo, María Beatriz, Gomez, Alejandra Gabriela, Madalena, Leticia Bibiana, Facio, María Laura, Pizzolato, Marco Antonio, & Negri, Gustavo Alberto. (2007). Utilidad de la fosfatasa alcalina urinaria como marcador precoz de lesión tubular renal. Acta bioquímica clínica latinoamericana, 41(3), 369-377. Recuperado en 09 de septiembre de 2022, de http://www.scielo.org.ar/scielo.php ?script=sci_arttext&pid=S0325- 572007000300011&lng=es&tlng=e s.
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. 9-22 (1991).
