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Asignatura: BIOQUIMIVA, Profesor: , Carrera: C.T. Alimentos, Universidad: UCLM
Tipo: Apuntes
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CINÉTICA ENZIMÁTICA. DETERMINACIÓN DE Vmax y KM
En principio, la acción de los enzimas es semejante a la de los catalizadores químicos, en el sentido de no alterar los estados inicial y final de la reacción (no alteran ∆G) ni la constante de equilibrio de la reacción. Simplemente aceleran la reacción al disminuir la barrera energética del estado de transición: En las reacciones químicas las moléculas son estables, y para reaccionar entre sí y generar unos productos con un nivel energético más bajo necesitan superar el nivel energético más elevado que poseen en un estado intermedio: el estado de transición; este estado de transición se caracteriza porque las moléculas reaccionantes se encuentran próximas, produciéndose repulsiones, o se encuentran deformadas y sometidas a tensiones. Si las moléculas reaccionantes tienen la energía suficiente superarán la barrera energética y la reacción tiene lugar; en caso contrario la reacción no se produce y los sustratos se separan.
La diferencia de energía libre entre el estado inicial de los sustratos y el estado de transición es la energía de activación. Una vez alcanzado este nivel, las moléculas pasan a formar los productos que poseen un nivel energético inferior (son más estables que las moléculas reaccionantes y por eso el proceso es espontáneo termodinámicamente).
Los enzimas disminuyen la energía de activación al unir los sustratos, aproximarlos y orientarlos con la participación de ciertos procesos en la proteína que son energéticamente favorables (la unión del enzima al sustrato es favorable, los cambios conformacionales producidos por interacciones entre la proteína y los sustratos liberan energía, se puede provocar la hidrólisis de moléculas ricas en energía, etc), de manera que se forma un nuevo estado de transición en el que participan ciertos grupos del enzima y que posee un nivel energético inferior al estado de transición en ausencia de enzima. Así, al disminuir el requerimiento energético de las moléculas de sustrato,
sustrato). Esta velocidad inicial se determinará para distintas concentraciones de sustrato en la mezcla de reacción.
Sin embargo no se debe confundir estas velocidades con la velocidad máxima del enzima: la velocidad inicial es la velocidad que muestra el enzima a una concentración de sustrato conocida (cuando empieza a agotarse el sustrato la concentración es desconocida y no se puede hacer una asignación de velocidad a concentración de sustrato). En el caso más sencillo de reacciones catalizadas enzimáticamente, se hace depender a la velocidad de la concentración de un único sustrato (si la reacción depende de más de un sustrato, se utiliza concentraciones en exceso de todos menos uno, de forma que la velocidad dependa sólo de uno de ellos). Para una reacción del tipo A → P
Esta velocidad tiene la forma ᡈ⡨ 㐄㐄 ㎘ 〱䙰。䙱〱ぇ 㐄 〱䙰〗䙱〱ぇ 㐄 ᡣ䙰ᠧ䙱, en una reacción de primer
orden (sólo depende de la concentración de uno de los reactivos o sustratos o, dicho de otra forma, depende de la primera potencia de la concentración). Si la reacción fuera de segundo orden (dependiente de uno o de dos sustratos), tomaría la forma Vo= k[A]^2 (un sustrato) ó Vo= k[A][B] (dos sustratos), y en cualquier caso dependiendo de la segunda potencia de la concentración.
Recordad que se entiende como orden de una reacción la suma de los exponentes de la ecuación de velocidad, y corresponde a la molecularidad de la reacción: el número de moléculas que deben entrar en contacto simultáneamente para que la reacción tenga lugar (son habituales las reacciones que dependen de una o de dos moléculas, son raras las que dependen de tres simultáneamente, y no se conocen de orden superior). El orden de la reacción es independiente de la estequiometría.
En las reacciones de primer orden la constante de velocidad tiene unidades de inverso de tiempo s-1, mientras en las de segundo orden la constante es M-1^ s-^.
Muchas reacciones en los seres vivos que son de segundo orden se comportan como si fueran de primer orden, al encontrarse uno de los sustratos en exceso a lo largo de la reacción. Son las reacciones de pseudoprimer orden: aquéllas en las que participa el agua, como las hidrataciones, deshidrataciones, las reacciones de hidrólisis, etc.
En ciertos casos la reacción puede proceder a velocidad constante, independiente de que introduzcamos pequeños cambios en la concentración de los sustratos: la reacción es de orden cero. Este fenómeno se produce cuando todos los sustratos están en exceso, y los pequeños cambios en concentración de sustratos siguen manteniendo su exceso. En este caso V=k; k tiene unidades de velocidad, Ms-1, y en las reacciones catalizadas enzimáticamente significa que el enzima tiene sus centros activos saturados con sustrato y actúa a la máxima velocidad posible.
La actividad de los enzimas se expresa muy habitualmente como los micromoles de sustrato transformado por minuto. Por ello se ha definido la unidad de actividad enzimática (U) como aquélla que transforma 1μmol/min. La unidad recomendada por los organismos internacionales para la actividad enzimática es el “katal”: 1 katal es la actividad enzimática que transforma 1 mol de sustrato en un segundo.
El valor de esta actividad dependerá de la cantidad de enzima presente en la reacción, por lo que se corrige el valor de la actividad por los miligramos de enzima presentes, obteniéndose la actividad específica: es la actividad dividida por la cantidad de proteína, expresada en mg, y tendrá unidades μmol min-1^ mg-1^ de proteína (ó U/mg)
Otro parámetro manejado en el estudio de los enzimas es el número de moléculas de sustrato que es capaz de transformar por unidad de tiempo un único centro activo: es el número de recambio. El interés de este parámetro radica en que algunos enzimas poseen varios centros activos, generalmente porque poseen varias subunidades asociadas. En estos casos, para estimar las características reales de un centro activo es necesario hacer la corrección por el nº de centros activos de una proteína. El número de recambio se expresa en moles de sustrato transformados por unidad de tiempo y por mol de centro activo.
son variables (es la etapa de mezcla de las distintas moléculas). Posteriormente, y dado que la concentración de sustrato es mucho más elevada que la de enzima, las concentraciones de E y ES apenas muestran variaciones, a pesar de que continuamente se esté formando producto. Esta fase es la de estado estacionario, y dura hasta que se empieza a agotar el sustrato. En el estado estacionario la velocidad de formación del complejo ES es igual a la velocidad de su desaparición: d[ES] = 0
Además, la concentración de enzima libre y la del complejo ES son prácticamente imposibles de determinar. Sin embargo la concentración de enzima total generalmente se conoce porque es añadida por el experimentador. [E]T = [E] + [ES]
Curvas de progreso para los componentes de una reacción sencilla de Michaelis–Menten.
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Voet^
Biochemistry
3e
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Asumiendo el estado estacionario tenemos que La velocidad de desaparición del complejo ES es igual a la velocidad de formación k 1 ([E]t-[ES])[S] = (k-1 + k 2 )[ES]
Reordenando, [ES](k- 1 + k 2 + k 1 [S]) = k 1 [E]t [S]
Y dividiendo por k 1 , [ES]((k- 1 + k 2 )/k 1 + [S]) = [E]t [S]
Al cociente (k- 1 + k 2 )/k 1 se le conoce como constante de Michaelis, KM por lo que tenemos [ES] = [E]t [S]/(KM + [S])
La velocidad vimos que era proporcional a [ES], de forma Vo = k 2 [ES]
Si, en la expresión obtenida anteriormente para [ES] multiplicamos por k2 obtenemos
k 2 [ES] = k 2 [E]t [S]/(KM + [S])
k 2 [ES] hemos visto que es Vo, y cuando todo el enzima se encuentre en forma de complejo ES se alcanza la velocidad máxima (Vmax), por lo que si [ES] = [E]t, k 2 [E]t = Vmax
Entonces Vo = Vmax[S]/(KM + [S])
Esta ecuación es manejable de manera práctica y se conoce como Ecuación de Michaelis-Menten. Haciendo representaciones de Vo como función de [S] se obtiene curvas hiperbólicas rectangulares: los enzimas son saturables. De estas curvas, dos parámetros son interesantes: la asíntota paralela al eje de abscisas, que indica el valor máximo de la Vo (es decir, Vmax), y el valor de [S] que permite alcanzar Vmax/2. Este valor de [S] nos indicará la eficiencia del enzima para transformar el sustrato y se corresponde con KM (se puede obtener sustituyendo en la ecuación de Michaelis-Menten): cuanto mayor sea el valor de KM, menor será la eficiencia del enzima para el sustrato estudiado, ya que se requiere mayores concentraciones de sustrato para alcanzar Vmax (tened en cuenta que estos ensayos se hacen a concentración de enzima total constante). Cuando K 2 < Transformación de dobles inversos, o de Lineweaver-Burk
Pendiente
El modelo de Michaelis-Menten asume que la reacción de formación de complejo ES a partir de E + P es prácticamente inapreciable en las condiciones de medida (lo que es cierto, porque se busca estas condiciones), pero muchas reacciones que transcurren en las células son reversibles (pequeñas variaciones de energía libre), con lo que también es necesario tener en cuenta el paso de productos para formar reactivos. En este caso, los parámetros cinéticos son dependientes del equilibrio global.
Es muy frecuente que las enzimas dependan de más de un sustrato, aunque estas situaciones quedan fuera del objetivo de esta asignatura. Para su estudio cinético sencillo se puede trabajar en condiciones tales que tengamos como variable únicamente un sustrato, y todos los demás se encuentren en exceso (la enzima está saturada con estos sustratos), por lo que se ajustan a las cinéticas hiperbólicas y la ecuación de Michaelis-Menten.
Enzimas (I) Actividad previa
El enzima succinato deshidrogenasa es capaz de transferir dos átomos de hidrógeno del ácido succínico al FAD. El ácido malónico interfiere esta reacción, de acuerdo con los siguientes datos:
Velocidad de reacción (nmoles de FADH 2 formados/min) Succinato En ausencia de malonato
En presencia de malonato 10-4^ M 0.1 3.6 1. 0.4 11.4 4. 1 20 9. 4 32 21. 10 36.4 29.
Hacer la representación de Lineweaver-Burk con y sin inhibidor. Calcular los valores de KM y de Vmax en ambos casos, así como el de Ki. ¿Qué tipo de inhibición se produce?
Si tenemos en cuenta que la ordenada en el origen de esta ecuación es la inversa de Vmax, podemos obtener fácilmente su valor.
Por otra parte, si tenemos en cuenta que la pendiente tiene el valor de (^) V^ Kmmax^ , y conociendo ya el valor de Vmax, podemos calcular el valor de Km
