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Practica de laboratorio informe semanal de extracción del ADN. Resumen detallado
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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Integrantes Apellido y Nombres Porcentaje de participación 1 Alfaro Huayta Rodrigo 95% 2 Chauca Barrientos Daniel 95% 3 Villegas Ramírez Yuliana Salet 100% Docentes: Francesca Falconi Agapito Dennis Samillan 2023
esperma, durante las primeras etapas de desarrollo del feto u otros factores como la edad de la madre o el medio ambiente se clasifican en estructurales y numéricas. (El niño discapacitado, 2019). Las numéricas tienen un cromosoma más o un cromosoma menos de lo que sería el par normal (Biología, 2015) por ejemplo en primer lugar se encuentra el síndrome de Down que es la anomalía más conocida en todo el mundo que afecta a todas las razas que se da en 1 de cada 700 recién nacidos, esta consiste en la triplicación del par 21 de cromosomas que produce retraso mental y Alzheimer a una edad temprana (Pueschel. S, 20). En segundo lugar, está el síndrome de Turner donde la mujer tiene un cromosoma x y el otro lo tiene incompleto lo cual hace que sean de baja talla, infértiles y con problemas en el sistema linfático, pero con inteligencia normal a diferencia del síndrome de Down (Problemática Biomédica, 2018). Las anomalías estructurales suceden cuando una parte de un cromosoma en particular falta, está demás, se ha pasado a otro o está invertida (Biología,
1.1. Extracción del ADN de la sangre Se adicionó 20 μL de la muestra de sangre a un microtubo junto con 20 μL de proteinasa K, la cual es una enzima utilizada para digerir la mayoría de proteínas (Thaler. D, 2010) y 20 μL ARNasa, esta es una enzima que se usó para eliminar el ARN de la muestra (Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia, 2017), luego se llevó el micro tubo al vortex durante 15 segundos para mezclar el contenido, después de haberlo mesclado se le agregó 100 μL de buffer lisis que se usó para romper la membrana plasmática (Ribonucleasas, 2018) y nuevamente se le llevó al vortex durante 15 segundos posteriormente se encubo la muestra a 55º C durante 10 minutos, y se procedió a deshidratar a la molécula de ADN agregándole 100 μL de alcohol y de igual manera se le llevó al vortex para mezclar durante 15 segundos, inmediatamente después se dejó reposar la muestra durante 5 minutos. 1.2. Purificación Se procedió a agregar la muestra, más 200 μL de buffer de lavado I sobre la columna de filtro y se llevó a centrifugar a 8500 rpm durante 1 minuto; después de a ver centrifugado la muestra se cambió el tubo de lavado que llevaba el desecho que se disolvió en el buffer por uno nuevo; después se agregó 200 μL de buffer de lavado II, para más seguridad de que la muestra se encuentre totalmente limpia, y nuevamente se llevó a centrifugar a 8500 rpm durante 1 minuto luego volvió a cambiar el tubo de lavado por otro posteriormente se agregó 100 μL de buffer de elución el cual permite que el filtro cambie de carga para que todo el ADN caiga junto con este al tubo de lavado (Gutierrez. A, 2022) y se llevó a centrifugar a 10000 rpm durante 1 minuto y por último se dejó encubar a 20º C.
2. REACCION EN CADENA DE POLIMERASA 2.1. Amplificación del ADN En clase se realizó la amplificación de ADN con tiras de papel, primero el profesor dio a cada grupo una enfermedad con su respectivo primer para amplificar luego los grupos iniciaron a cortar 4 tiras de papel dividiéndolas cada una en 100 partes posteriormente colocaron los nucleótidos del primer
Luego, se retiró el gel de agarosa y se colocó a la cámara electroforética previamente llenada con el buffer TAE 1X el cual es una sustancia que brinda sales y mantiene al gel en condiciones constantes y adecuadas (Fieero. F, 2018) hasta que pase ligeramente la lámina del gel de agarosa. Después a la muestra de ADN se le colocó buffer de carga el cual le da peso para que se vaya al fondo del pocillo (Fierro. F, 2018), también se agregó el colorante Lader el cual da color a la muestra para ver su migración (Normalizacion de la electroforesis de células individuales,2019). Posteriormente, se procedió a colocar las muestras de ADN en los pocillos con micro pipetas enseguida se conectó los cables para encender la fuente de poder y así iniciar el proceso de electroforesis. Finalmente, pasado el tiempo de corrida de la electroforesis se desconectó el equipo de la fuente de poder y se removió el sistema que contiene el gel de agarosa. Luego, se puso el gel en un transiluminador para el revelado, en donde aparecieron las bandas que fueron registrarla en el resultado final. Para realizar el análisis final de la muestra se usó un marcador específico para ADN mitocondrial el cual tiene 16 569 pares de bases (Armadillum Vulgare, 2022) RESULTADOS
1. EXTRACCIÓN DE ADN 1.1. Cuantificación del ADN Se obtuvieron diferentes resultados de concentración de las muestras según el espectrofotómetro, tal como se indica en la tabla 3, seis eran de sexo femenino y cinco muestras eran de sexo masculino, las edades estuvieron en el intervalo de 17 a 20 años, el promedio total de muestras de mujeres fue de 24.21 μg/μl y el promedio de varones fue de 21.32 μg/μl. También se puede observar que el promedio de concentración de ADN total fue de 22.90 μg/μl. Finalmente cabe indicar que las concentraciones no superaban los 30 μg/μl.
Tabla 3. Valores de concentración de ADN según espectrofotómetro en 11 muestras de sangre humana
2. Reacción en cadena de polimerasa Después de realizar cada proceso de la amplificación del ADN de manera simulada, manualmente y con materiales que se tenían en clase, tal como se indica en la figura 2, se obtuvieron copias idénticas del segmento de ADN de interés, el cual significaba que la persona era portadora de la enfermedad aterosclerosis, obteniéndose 4 copias, las cuales contenían la secuencia exacta de nucleótidos del segmento molde de ADN (segmento de interés). Figura 2. Elaboración manual de una amplificación de una secuencia específica de ADN 3. Electroforesis de ADN mitocondrial en gel de agarosa
1 Femenino 17 23.16 μg/μl 2 Masculino 17 18.56 μg/μl 3 Masculino 19 21.88 μg/μl 4 Femenino 19 19.46 μg/μl 5 Femenino 18 25.96 μg/μl 6 Femenino 18 29.35 μg/μl 7 Masculino 18 18.26 μg/μl 8 Femenino 17 23.90 μg/μl 9 Masculino 17 22.78 μg/μl 10 Masculino 20 25.11 μg/μl 11 Femenino 18 23.44 μg/μl Promedio Femenino de 24.21 μg/μl Promedio Masculino 21.32 μg/μl
Un adecuado proceso de extracción y purificación de ADN facilita una gran cuantificación de ADN de sangre humana, pero en estas también influyen factores internos de cada organismo y factores externos. El valor promedio de la concentración de las mujeres es 24.21 ug/mL el cual es mayor a comparación de los varones 21.32 ug/mL, ello debido que influyen factores externos como la realización de dieta, ejercicio, el consumo de tabaco entre otros los cuales son dependientes en cada organismo (2). En primer lugar, las diferencias entre la cuantificación de ADN de los diferentes individuos se hallan en la porción y en el orden del mismo (Revista Española de cardiología, 2017). Del grupo de los varones fue el dato mínimo de concentración, ello debido a que los procesos de extracción y cuantificación probablemente no se realizaron óptimamente, ya que el ADN queda contaminado con otras sustancias como las proteinasas o ARNasas, los cuales perjudican la extracción pura del ADN genómico (Cervantes. D, 2017). En cambio, el mayor valor fue el de las mujeres, esto indica que el método de extracción se llevó a cabo mejor, pues las adiciones de buffers como el de lisis desnaturalizan a las proteínas y mantiene estable al ADN (Cervantes. J, 2020). Asimismo, las mujeres son más propensas a mantener una dieta saludable que los varones, por tanto, la concentración de ADN es mayor en personas saludables (Rubio. T, 2016). Por otro lado, la extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención de datos genéticos (Dhaliwal. A, 2022). Sin embargo, las alteraciones en las repeticiones de cuantificación de ADN se deben a errores en la manipulación del método de extracción también influye la procedencia de la muestra, es decir de la persona de quien se obtuvo, ya que cada organismo es diferente (Universidad Nacional de Huancavelica, 2019). Entonces, existen diferentes métodos de extracción de ADN como el método fenol-cloroformo, de calentamiento, del acetato de potasio, entre otros; la elección de uno de ellos depende de la naturaleza de la experiencia y de la muestra a recolectar el ADN (Med Trop, 2019). No obstante, la extracción de ADN a partir de sangre demanda más recursos en la calidad y cantidad de ADN, estas cuando no son apropiadas y con la mala utilización de las muestras fácilmente existe la probabilidad de contaminación del ADN (Osorio.J, 2021).
2. Amplificación del ADN genómico por PCR
La amplificación del ADN por la reacción de la cadena polimerasa fue positivo, ya que hubo una buena lectura del ADN mitocondrial en la electroforesis. Es decir, al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa (Tecnología en Salus, 2021). Asimismo, el uso de primers es indispensable para el PCR, por ejemplo, el primer para ADN mitocondrial permite la observación de esta misma (Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Esta técnica es una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico (Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático, 2017). Por un lado, existe primers específicos para diagnosticar ciertas enfermedades como, por ejemplo, los oligonucleótidos (primers) diseñados para la detección de Leishmania por PCR fueron LEISH1, LEISH2 y LEISH 3 (Rev. Peruana Salud Publica, 2018). Otro caso fue de oligonucleótidos universales AD3 y AD4, los cuales lograron amplificar una región de 419 pb del gen de la glicoproteína NS1 del virus dengue (Caracterización molelular de células autóctona, 2020). Además, el empleo de diferentes primers también sirve para la detección de virus en vegetales, tal es el caso de los primers PC-F1 y PC-RD1, los cuales reconocen al Cucumber Mosaic virus (CMV) en banano (Eztanderizacion de detención molecular del cucumber Mosaic virus, 2017). Por otro lado, las temperaturas empleadas en la simulación de los procesos de desnaturalización usan 94°C (Perez. A, 2022); sin embargo, otras investigaciones mencionan que puede llegar hasta 95°C para evitar la degradación de las cadenas del ADN (Gonzalo. G, 2019). Mientras que, para la hibridación, 54°C es la temperatura ideal, hay casos donde se recomiendan entre 40-60°C, ya que a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN (Espinoza. L, 2017). También se emplea temperaturas entre 35 y 60ºC, pues permiten que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Mientras que, en la elongación, se emplea 72°C pues la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN (Diaz, 2019). Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a 72ºC para asegurarse que todos los productos de
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cometa). Rev Cubana Invest Bioméd. [Redalyc]. 18(1): 34-36. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864- 03001999000100013&lng=es.
