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No Dra. P. Catalán - Profesora de Biología Vegetal. E. U. Politécnica de Huesca La fotcsíntesis es el procaso metabólico que poseen lcs organismos autótrofos que conduce.a la raducción o fijación del CO? atmosférico en compuestos orgánicos -hidratos de carbono- utilizando como fuente de energía la energía lumínica del sol. Esta sintesis de compuestos carbonados orgánicos constituye uno de los fenómenos cruciales de la vida de los seres vivos en el planeta y la realizan los organismos fotosintetizadores o autótrofos, que comprenden a las bacterias anaeróbicas púrpuras y verdes, las cianobacterias, las algas, y las plantas. Todos ellos se caracterizan por la posesión de unas moléculas especiales, los pigmentos fotosintéticos primarios -bacteriociorofilas y clorofilas- que les permiten captar la energía lumínica y transformarla en energía química. (diapositiva de esquema de fases de la fotosintesis) En el complejo conjunto de etapas individuales que constituye la fotosíntesis se pueden distinguir dos fases. Una primera fase de fotoquímica primaria y secundaria (captación de energía lumínica, transporte electrónico fotosintético y fotofosforilación) abarca desde la absorción de luz hasta su conversión en formas usuales de energía metabólica: poder reductor en forma de coenzima reducido NADPH y energía química almacenada en forma de ATP. Una segunda fase de anabolismo celular (ciclo de Calvin) utiliza tales formas de energía para realizar la síntesis'de los compuestos orgánicos de carbono a partir del CO2. Ambas fases están estrechamente ccordinadas y son simultáneas en los organismos autótrofos. Iniciaremos el estudio de la fotosíntesis analizando los fenómenos relacionados con la primera fase, cuyos procesos se localizan, fisicamente, en distintos sistemas de membranas fotosintéticas. En las bacterias fotosintetizadoras éstos se hallan asociados a sus membranas celulares, las únicas que poseen, (diapositiva de Rhodospirillum) (Ejemplo de Rhodospirillum rubrum, bacteria fotosintetizadora púrpura, que encierra a los sistemas fotosintéticos de transporte electrónico y fotofosforilación en invaginaciones de su membrana plasmática). en las cianobacterias en unas estructuras laminares intracitoplasmáticas denominadas laminillas úilacoidales, (diapositiva de cianobacteria) (En esta imagen de una cianobacteria se pueden observar los distintos agrupamientos de laminillas tilacoidales en su interior) mientras que en las algas y en las plantas verdes se disponen en un sistema de membrana, -los tilacoides-, incluídos en el interior de unos orgánulos especializados, los cloroplastos. (diapositiva de cloroplasto) z (Una representación esquemática de una sección de un cloroplasto muestra la estructuración de sus componentes: dos envueltas membranosas rodean al estroma o compartimento interno, donde tiene lugar la vía anabólica de fijación del CO2 a compuestos de carbono (ciclo de Calvin); incluídos en el estroma se hallan los tilacoides, sacos de membrana con un espacio o lumen interno, el lumen intratilacoidal. Los tilacoides forman, en determinados lugares, apilamientos o grana: Los sistemas responsables del transporte electrónico fotosintético y de la fotofosforilación de hallan repartidos por las membranas tilacoidales y los grana). Vamos a analizar la composición y el funcionamiento de las distintas vías fotoquímicas presentes en las plantas superiores, por su mayor importancia agronómica, haciendo referencia, en algunos casos concretos, a determinadas estructuras procariotas, por su utilidad comparativa con las de las plantas y por el mayor conocimiento de que se dispone en la actualidad de los sistemas transportadores electrónicos bacterianos. Tres complejos enzimáticos transmembrana son los implicados en la transferencia electrónica desde el E20, donador de electrones en plantas (también en algas y en cianobacterias), al NADP (que se reduce a NADPH) y un complejo enzimático transmembrana lo está en la fosforilación: (diapositiva del esquema de la membrana tilacoidal y sus componentes) Los complejos transportadores son el fotosistema II (o PSIT), el citocromo b/f, y el fotosistema 1 (o PST), el complejo fotofosforilador es la ATPasa sintasa. El fotosistema II se dispone en los apilamientos tilacoidales o grana, mientras que el PS] y la ATPasa sintasa lo hacen en las membranas tilacoides estromáticas; el citocromo b/f se localiza tanto en unas como en otras. Todos los complejos enzimáticos son agregados proteínicos transmembrana, que se hallan anclados, a través de sus regiones hidrofóbicas, a la bicapa lipídica. El análisis de la composición y estructura de todos estos complejos polipeptídicos ha sido posible gracias a las técnicas de criofractura y barrido electrónico de las membranas tilacoidales, y a las de extracción e identificación de las proteínas constituyentes y de sus cofactores asociados. Utilizando detergentes adecuados que disgregan la bicapa lipídica pero que no alteran la estabilidad de los polipéptidos transmembrana, los extractos proteinicos pueden separarse y purificarse posteriormente por centrifugación, seguida de cromatografía y elecuroforesis. (diapositiva de gel de electroforesis) (Por ejemplo, la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida permite separar a los componentes principales de los tilacoides (en las calles 2), del fotosistema II (en las calles 1, de * extracto purificado a partir de 2), y del complejo que genera oxígeno (en las calles 3, de extracto purificado a partir de 1), -bandas mas gruesas corresponden a las proteínas más abundantes en cada caso=; a la derecha una purificación y separación por electroforesis, de los dos tipos de proteínas principales del complejo antena intrínseco del PSI, las proteínas CP43 y CP47). Posteriormente la composición y concentración de los pigmentos fotosintéticos -cromatóforos- presentes en las distintas proteínas puede determinarse mediante diversas técnicas espectroscópicas (absorbancias a determinadas longitudes de onda y temperaturas, resonancias magnéticas, y dicroísmos ópticos, fundamentalmente). Proteínas aisladas y purificadas pueden cristalizarse, y su estructura se determina a través de estudios de difracción de rayos X y de secuenciación de sus aminoácidos: (diapositiva de las proteínas del centro de reacción bacteriano) (Los datos cristalográficos y de secuencias aminoacidicas permiten deducir la configuración nativa de las proteinas y su agregación espacial; actualmente programas de diseño asistido por ordenador facilitan la reconstrucción tridimensional de los polipéptidos. El número y la disposición de sus cromatóforos vienen establecidos por las técnicas espectroscópicas señaladas anteriormente. Como ejemplo, la conformación espacial del centro de reacción bacteriano de las bacterias púrpuras, similar al del PSN de las plantas superiores, y formado por tres proteínas -L, M, y H- y un citocromo, y sus pigmentos asociados). antena (aproximadamente 20-22 clorofilas a y 3-S f-caroteno cada una). La estequiometria de estas proteínas de la antena intrínseca con respecto al RC es de uno, dándose una relación aproximada de +40 clorofilas a en la antena intrínseca por centro de reacción. Por fuera del complejo antena intrínseco se halla el complejo extrínseco captador de luz (LECI), (diapositiva del esquema del LECIT extrinseco) El LECII es el mayor colector de E solar, lo forman familias de proteínas homólogas con distintos potenciales de fosforilación, responsables del apilamiento de los tilacoides en forma de grana cuando se hallan asociadas al PSIL Las proteinas son de naturaleza trimera; cada monómero consta de tres hélices « transmembrana (A, B, y C), que engloban 15 clorofilas a y b y a un número variable de carotenoides, y una hélice « hidrofílica luminal. Varios complejos antena extrínsecos LECI[ pueden rodear al PSIL Dichos complejos son los responsabies de la gran eficiencia en la captación de la energía luminosa, a diferentes longitudes de onda del espectro, y de la transmisión de la energía de excitación acumulada por sus . pigmentos a los pigmentos principales del centro de reacción. Otras proteínas asociadas con el fotosistema II son tres péptidos luminales de 33, 23 y 17 KDa, E responsables de la estabilización del PSIL El primero de ellos, el más relevante en cuanto a su We función, contribuye a estabilizar la captación de cuatro átomos de Mn por el centro de reacción, necesarios para producir la hidrólisis del agua. (transparencia de esquema del PSII) La base luminal del dímero D1-D2, ld proteina estabilizadora de 33KDa y el complejo antena intrínseco de captación de luz (CCII) constituyen lo que se denomina "complejo productor de - oxígeno”. Este complejo, al activarse por la luz, produce la rotura de moléculas de agua y la. E liberación de moléculas de oxigeno, protones y electrones al medio, por un procedimiento aún nó resuelto completamente. La fotólisis de dos moléculas agua transcurre en cuarro pasos al final dé los cuales se libera una molécula de 02. Los cuatro electrones son transferidos al pigmento $ principal P680 del centro de reacción a través de dos transportadores desconocidos, Z y D, que posiblemente sean restos de Tyr de las proteínas D1 y D2. Los cuatro protones se liberan de manerá no secuencial al lumen tilacoidal. La estructura del forosistema 1 (PSI) se caracteriza por poseer, al igual que el PSIL, de un centro de reacción (RC). Este centro, a su vez, al ser de mayor tamaño, actúa también, en su periferia, como complejo antena intrínseco (CCI), hallandose rodeado por fuera por el complejo antena extrinseco captador de luz (LHC). (transparencia de esquema del PSI) El centro de reacción es un complejo multiproteico transmembrana formado por varios polipéptidos. El núcleo del complejo lo componen dos proteinas simétricas de 80KDa que constituyen el heterodímero Al y A2. Tales péptidos se hallan plegados en ocho hélices « transmemebrana, las internas contienen en su interior hidrofóbico cromatóforos del par especial P700 (otro tipo especial de clorofila a, que absorbe luz a longitud de onda de 700 nm y Que, al pasar a su estado excitado, es capaz de ceder un electrón), y moléculas de clorofila a (Ao), quinona-vitamina K (A]) y centro sulfoférrico (Fx), intermediarios en la transferencia electrónica; así como 5 moleculas de clorofila a accesorias. Las hélices externas de estas proteinas actúan como complejo captador de luz y pueden llegar a albergar hasta 90 clorofilas a y 12-16 f-carotenos. Otros polipéptidos menores asociados con el heterodímero central se disponen en la superficie estromática o en la superficie luminal. De los primeros el péptido C contiene el centro sulfo- férrico Fa/Fb, último transportador de electrones del RC a la molécula soluble ferredoxina (Fd), da en el extremo su; eel el péptido + contien extremo luminal dei PSi y permite l: igmentos principales del centro de reacción. Por fuera del núcleo del PSI se dispone el complejo antena extrinseco (LHCI), homólogo al del PSI (LECH), cuyas cromoproteínas albergan clorofilas a y b y carotervides, aumentando la relación total de moléculas de clorofila por centro de reacción hasta cerca de 200. El elevado" número de pigmentos antena en el PSI, asi como su naturaleza (mayor tendencia a absorber la luz a longitudes de onda larga, próximas a 700 nm), estárelacionado con la alta tasa fotoquímica que experimenta este fotosistema en las vías acíclica y cíclica de la fotosíntesis (?). Por otra parte, el complejo antena extrínseco del PSII (LHCI) es polivalente, pudiendo movilizarse, por mecanismos de desfosforilación y fosforilación de sus proteínas, y emigrar de un fotosistema a otro a través de la bicapa lipidica. Tal movilización se produce de acuerdo a los requerimientos de energía de excitación de uno u otro fotosistema. En su estado desfosforilado se halla asociado al PSI y, al ensamblarse las proteínas desfosforiladas de distintos centros, contribuyen al apilamiento en forma de grana de la membrana tilacoidal, mientras que al pasar a su estado fosforilado las proteinas de desensamblan, incrementan la superficie estromática de los úlacoides y emigran hacia el PSI. (transparencia del esquema de la membrana tilacoidal) istema citocromo b/f participa en la transferencia electrónica fotosintética y en un bombeo s hacia el lumen intratilacoical; está formado por dos citocromos, -el f (proteína hidrofóbica), y el b6 (proteína translocadora de H+)-, una proteína sulfoférrica -centro de Rieske- y otros péptidos menores. Dispone de dos lugares de unión al plastoquinol, de un lugar de anclaje de la plastocianina y de un lugar de oxidación de la ferredoxina (?). El complejo enzimático ATPasa sintasa está constituido por las fracciones CFQ y CF]. La fracción transmembrana CFg contiene tres subunidades peptídicas [,II, y II; la tercera de ellas es una proteína canal de transporte de protones a favor de gradiente, generadora de una fuerza promorriz utilizada para la actividad fosforiladora de la fracción CF]. Dicha fracción CF], expuesta al estroma cloroplástico, consta de nueve subunidades («u383y5.), y contiene los centros catalíticos que fosforilan el ADP a ATP. La fotosíntesis $e produce como consecuencia de la captación de la energía lumínica por los pigmentos fotosintéticos. Los principales pigmentos fotosintéricos en las piantas (y en algas y cianobacterias) son las clorofilas: clorofila a y clorofila b; mientras que en bacterias fotosintéticas son los análogos bacterianos de estos pigmentos, bacterioclorofila a y bacterioclorofila b. (transparencia de estructuras químicas de pigmentos: clorofilas y carotenoides) La estructurá de las clorofilas se basa en un sistema anular porfirínico, con un átomo de Mg central, que contiene un entramado de dobles enlaces conjugados que absorben la luz. Las clorofilas difieren entre ellas solamente en algunos sustituyentes laterales. Una larga cadena hidrocarbonada denominada "fitol" está esterificada al anillo IV del tetrapirrol. Esta larga cola hidrocarbonada ayuda a la clorofila a anclarse en el medio hidrófobo de las proteínas de membrana con las cuales se asocia. La feofitina es un cromatóforo de naturaleza similar a la de la clorofila a, en el que se ha sustituido el átomo central de Mg por dos protones (2H+). E Los plantas fotosintetizadoras también contienen pigmentos denominados accesorios -los carotenoides-, compuestos terraterpénicos en forma de hidrocarburos puros (carotenos) o sus derivados oxigenados (xantofilas), que disponen de sistemas de dobles enlaces conjugados en sus moléculas optimizadores de la captación de la E lumínica. (transparencia.de estructuras químicas de pigmentos) (diapositiva de cultivos celulares fotosintetizando) Por el contrario, silos saltos entre estados de excitación en la misma molécula o con respecto a los de moléculas vecinas es suficientemente separados, energética y espacialmente, la energía de relajación del electrón al volver a su estado basal se dispersa de manera fútil, siendo emitida por los cr>móforos en forma de fluorescencia. (diapositiva de cultivo celular fluorescente) (En la diapositiva pueden ver una imagen de un cultivo de células fotosintéticas emitiendo fluorescencia en la región del infrarrojo (690-700 nm). La diapositiva se tomó con un filtro adecuado. Las clorofilas de las plantas durante el día fotosintetizan y fluorescen; el exceso de energía acumulada que no es aprovechada fotosintéricamente por saturación de los sistemas transportadores de electrones se disipa en forma de fluorescencia que la visión humana no capta por hallarse fuera del espectro visible). Las clorofilas a de los pares de pigmentos especiales de los centros de reacción (P680 y P700) son capaces, al pasar a un estado excitado estable, de ceder el electrón desapareado del orbital más energético a una molécula aceptora, iniciando las vías fotoquímicas correspondientes. Este _ fenómer:o singular, de interacción de la luz con la materia, desencadenante de todo el proceso fotosintérico, es posible por la existencia de distintos niveles de excitación en los pigmentos P680 y P70O y por las características de disposición de cromóforos en sus respectivos centros de reacción. % En uno de los estados de excitación, adquirido tras el impacto de un fotón de radiación roja, o por la relajación de estados excitados más energéticos provenientes de-la excitación por la radiación azul o de la transferencia energética de los complejos antena, el cromatóforo es lo suficientemente estable y reductor como para ceder el electrón desapareado si las condiciones del entorno son favorables. Es decir, si el pigmento y la molécula aceptora oxidada estan situados lo suficientemente cerca (del orden de nm) y en la orientación adecuada para la cesión del electrón, ya que lá transferencia electrónica primaria ocurre en un tiempo brevisimo (del -orden de ps). En tales :ircunstancias se produce la separación de cargas. El transporte electrónico fotosintético que conduce a la formación de poder reductor en forma de NADPH a partir de los electrones del agua tiene lugar mediante una vía o cadena abierta en la que están implicados el PSII, el citocromo b/f y el PSL (transparencia de esquema de componentes de las membranas tilacoidales) (diapositiva del esquema en Z) Esta cadena abierta responde a un esquema en Z (ampliamente aceptado por la mayoría de los autores) de reacciones fotoquími acopladas a transferencias electrónicas primarias y secundarias por oxidoreducción entre compuestos iniciales de Epotencial más baja (más positiva) a compuestos finales de Epotencial más alta (más negativa). Estos saltos energéticos, que no se producirian espontáneamente, son factibles gracias al nivel energético alcanzado por los pigmentos principales de los fotosistemas ll y l; que desde sus respectivos estados excitados inician distintas transferencias electrónicas espontáneas en cascada. (transparencia de esquema solapado de componentes de la membrana tilacoidal y transferencias electrónicas) El agua tras sufrir la hidrólisis en el "complejo produ libera protones, electrones y oxigeno al medio lumi 
