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ÍNDICE
I. MEDIDA DEL POTENCIAL DE AGUA EN TEJIDOS VEGETALES ............................... 2
II. INFLUENCIA DEL CONTENIDO EN AGUA DEL MEDIO EN
LA GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS ...................................................................... 7
III. EFECTO DEL ACIDO GIBERÉLICO EN LA MOVILIZACIÓN
DE RESERVAS EN GRANOS DE CEBADA ................................................................ 10
IV. AUXINAS Y ELONGACIÓN ...................................................................................... 13
V. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS CLOROPLÁSTICOS POR
REPARTO DE DISOLUCIÓN ....................................................................................
VI. RECONOCIMIENTO DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
POR CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Y ESPECTROS
DE ABSORCIÓN ....................................................................................................... 20
VII. REACCIÓN DE HILL .................................................................................................. 26
VIII. HORMONAS Y SENESCENCIA ................................................................................. 30
02E
Práctica I
MEDIDA DEL POTENCIAL DE AGUA EN TEJIDOS VEGETALES
INTRODUCCIÓN
El potencial químico de una substancia j (μ j ) es la cantidad de energía libre por mol de la misma, siendo la energía libre (energía libre de Gibbs, G ) la máxima energía disponible para transformarse en trabajo, a presión y temperatura constantes:
G = E + PV - TS = H - TS
donde E es la energía interna, P , la presión, V , el volumen, T , la temperatura absoluta y S , la entropía, mientras que H = E + PV representa la entalpía del sistema. En este sentido, se define el potencial químico del agua como la diferencia entre el potencial químico del agua en el sistema (la célula o el tejido) y el del agua libre a la presión de un bar. Dado que no es posible medir el potencial químico del agua pura (μ oa ) en términos absolutos y que se trata de un valor máximo de comparación, se ha convenido en establecerlo, a la misma temperatura, como igual a cero.
El potencial químico del agua en una disolución no iónica depende de la energía media por mol y de la concentración de moléculas (su fracción molar) que poseen esta energía libre media:
μ a - μ oa = RT ln N (^) a
donde R es la constante de los gases (1,987 cal mol -1^ ºK-1^ ) y N (^) a , la fracción molar del agua.
El uso de potenciales químicos no es fácil en Fisiología Vegetal. Para las células, es más apropiado el concepto de potencial hídrico, o más correctamente, el decremento de potencial hídrico, que se puede definir como,
siendo V a el volumen parcial molar del agua (18 cm 3 mol -1^ )
Es decir, el ∆Ψ es el potencial químico del agua en un sistema, expresado en unidades de presión, comparado con el potencial químico del agua pura a la presión atmosférica y a las mismas temperatura y altura, y con el potencia químico del agua de referencia fijado en cero.
El potencial hídrico (Ψ) constituye la resultante de fuerzas de orígenes diversos (osmótica, capilar, de imbibición, de turgencia, etc.) que liga el agua al suelo o a los diferentes tejidos del vegetal. El potencial hídrico corresponde, desde el punto de vista energético, al trabajo que habría que realizar para llevar una unidad de masa de agua "ligada" al suelo o a los tejidos de una planta desde este estado de unión a un estado de referencia correspondiente al del agua pura a la misma temperatura y a la presión atmosférica. Como se adopta el valor cero para este potencial de referencia, todos los valores de potencial del agua que caracterizan al agua ligada son negativos.
La expresión más general del potencial hídrico es:
Ψ = Ψ o + Ψ m + Ψ p
μ a - μ^0 a Ψ a = Va
MATERIAL
- Tubérculos de patata
- Disoluciones de sacarosa de las siguientes concentraciones: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 y 0,8 molal.
- Agua destilada (concentración "cero" de sacarosa).
- Bisturí.
MÉTODO
- Hacer cilindros del tubérculo de patata.
- Cortar 10 discos de aproximadamente 3 mm de grosor con el bisturí ( manejar con precaución ).
- Escurrir suavemente con papel satinado para eliminar el exceso de humedad.
- Pesar 10 lotes de 10 discos cada uno y anotar su peso (peso inicial).
- Situar cada lote de 10 discos en una placa petri diferente.
- Adicionar a cada placa petri 20 ml de cada disolución de sacarosa o de agua destilada y cerrar las placas.
- Dejar transcurrir una hora en obscuridad.
- Sacar cada lote de 10 discos y secar suavemente con papel de filtro.
- Pesar cada lote de 10 discos y anotar el peso (peso final).
RESULTADOS
- Calcular el porcentaje de cambio en peso (%CP) como:
(peso final - peso inicial) %CP = x 100 peso inicial
- Calcular el potencial osmótico de cada disolución de sacarosa o agua utilizando la relación de van't Hoff.
- Anotar los resultados en el cuadro siguiente:
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Para la realización de esta práctica es imprescindible el uso de: − Bata de laboratorio − Guantes de látex
Eliminación de residuos sólidos y líquidos: deberán atenderse las normas indicadas en el laboratorio.
Finalizada la práctica, lavarse las manos con agua y jabón
Sacarosa (molal)
π (bares) Ψo externo (bares)
Peso inicial (g)
Peso final (g)
%CP
- Representar gráficamente el %CP (en ordenadas) respecto al potencial exterior (en abscisas).
- Ajustar a una recta.
- Calcular el punto de equilibrio donde
Ψ ext^ = Ψ int^ ⇒ ∆Ψ = 0
(valor del potencial osmótico externo (Ψ ext ) en el punto de corte con el eje de abscisas, donde %CP es cero o prácticamente igual a cero).
COMENTARIOS
Práctica II
INFLUENCIA DEL CONTENIDO EN AGUA DEL MEDIO EN LA
GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS
INTRODUCCIÓN
El primer proceso que ocurre en la germinación es el denominado "periodo de imbibición", consistente en la absorción de agua por las semillas, con la consiguiente hidratación de células y coloides, necesaria para que pueda comenzar la actividad metabólica.
La adaptación ambiental que permite a cada especie germinar en hábitats ricos en agua o secos (Ψ del medio alto o bajo) depende de que el Ψ de sus semillas en relación con el del suelo, sea suficientemente bajo para permitir que se alcance el grado de hidratación necesario por absorción de agua del suelo, proceso en el cual la cantidad y cualidad de las reservas nutritivas van a ser determinantes.
Durante su maduración, las semillas se deshidratan hasta niveles inferiores al 20% de contenido en agua, oscilando entre el 5% en xerófitas y el 30% en plantas tropicales, en
general. Esto conlleva valores muy bajos de su Ψ.
La elevada concentración de macromoléculas coloidales hidratables (sustancias de reserva) confieren a la semilla bajos valores de (m (componente matricial del potencial hídrico), que dependen, tanto de la concentración como de la naturaleza de los coloides.
Inicialmente el (o (componente osmótico del potencial hídrico) de las semillas es cuantitativamente poco importante. Cuando empiezan a germinar y, como resultado de la actividad enzimática, las grandes macromoléculas se van degradando a compuestos de bajo peso molecular (solutos osmóticos), el valor de ( aumenta, y por tanto (o disminuye de forma importante.
Durante la imbibición el flujo de agua que penetra en las semillas no es uniforme, distinguiéndose tres fases de duración muy variable:
Fase 1: Proceso rápido y puramente físico (se presenta tanto en semillas viables como inviables), que depende únicamente de la diferencia de ( entre el medio de imbibición y la semilla. El valor de ( de la semilla en este estadio se debe fundamentalmente al componente matricial ((m), y el ( del medio, de la concentración de solutos que contenga. Por tanto, se puede regular el flujo de agua variando el ( del medio en el que germinen las semillas. Esta etapa finaliza cuando la semilla ha adquirido un 60% de hidratación.
Fase 2: Es una fase de meseta, donde tienen lugar los principales acontecimientos metabólicos que conducen a la emergencia de la radícula. El potencial osmótico ((o ) es el componente determinante en el potencial hídrico (() de la semilla.
Fase 3: Esta fase se corresponde con la elongación de la radícula y sólo se produce en aquellas semillas aptas para germinar. Se caracteriza por un nuevo incremento de toma de agua, acompañando a la elongación de la radícula.
Una forma rápida para evaluar las exigencias hídricas de una semilla consiste en someterla a imbibición en medios de distintos (, preparados con diferentes concentraciones de un soluto determinado. La cantidad de agua que tome la semilla será determinante para que la actividad metabólica se desarrolle aceptablemente y comience la germinación. Como los sistemas respiratorios son esenciales y los que menos agua de hidratación requieren para ser activos, el detectar su funcionamiento es un parámetro indicativo de que la semilla
es viable.
El test que se va a utilizar para detectar la actividad respiratoria de las semillas está basado en la reducción de un compuesto, cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolium, soluble e incoloro, que captando los electrones de los procesos respiratorios se transforma en trifenil formazan, insoluble y de color rojo.
MATERIAL
- Semillas de judía ( Phaseolus vulgaris ).
- Solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolium al 0,1%.
- Soluciones de NaCl : 0 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 y 0,7 molar.
- Bisturí.
MÉTODO
Se ponen a embeber 6 lotes de 10 semillas de judía durante 24 horas en las diferentes soluciones de NaCl. Transcurrido ese tiempo, se toman las semillas de judía de cada uno de los medios de imbibición y se lavan bien con agua, a continuación se las despoja de la cubierta seminal. Se separan los cotiledones y se realiza una incisión longitudinal con el bisturí (manejar con precaución) en el eje embrionario que habrá quedado adherido a uno de los cotiledones. De esta forma se facilitará el acceso del cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolium al interior del mismo. Estos 10 cotiledones con su correspondiente eje embrionario se colocan en sendas placas Petri conteniendo 15 ml. del reactivo (los embriones deben quedar sumergidos en el reactivo). Las placas así preparadas se mantienen en obscuridad, para evitar el efecto acelerador de la luz sobre la reducción espontánea del cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolium, durante 30 minutos, al cabo de los cuales se procede a contar el número de embriones coloreados en cada uno de los medios de imbibición.
RESULTADOS
Una vez conocido el número de embriones coloreados en cada medio, se procede al cálculo del porcentaje de poder germinativo (%PG) de las semillas en cada uno de ellos.
Se representa gráficamente el %PG frente a la concentración salina del medio de imbibición, utilizando los valores medios obtenidos por el grupo.
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Para la realización de esta práctica es imprescindible el uso de: − Bata de laboratorio − Guantes de látex
Eliminación de residuos sólidos y líquidos: deberán atenderse las normas indicadas en el laboratorio.
Finalizada la práctica, lavarse las manos con agua y jabón
Práctica III
EFECTO DEL ACIDO GIBERELICO EN LA MOVILIZACION DE RESERVAS
EN GRANOS DE CEBADA
INTRODUCCIÓN
Las semillas de los cereales se pueden dividir en dos partes: el embrión y el endospermo (Fig. 1).
El primero es un tejido diploide que contiene un órgano especializado en la absorción denominado escutelo (escutellum). El endospermo, básicamente un tejido de reserva triploide, está compuesto a su vez por dos tipos de tejidos claramente diferenciados: el endospermo amiláceo (cuyas células almacenan el almidón) y la capa de aleurona.
Durante la germinación de la semilla las reservas almacenadas (proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucléicos y complejos minerales) presentes en la capa de aleurona y el endospermo amilaceo, son degradados y movilizados vía el escutelo hacia la plántula en desarrollo. Los enzimas necesarios para la hidrólisis y solubilización de las reservas almacenadas se producen principalmente en la capa de aleurona y la mayoría de estas enzimas están controlados por giberelinas. En las primeras etapas de la germinación se sintetizan giberelinas en el embrión y posteriormente son transportadas a la capa de aleurona, la cual en respuesta a dichas hormonas produce y libera hacia el endospermo distintos tipos de enzimas como amilasas, α-glucosidasas, proteasas, ribonucleasas, fosfatasas etc., si bien las amilasas, enzimas que degradan el almidón, constituyen el 60-70 % de las proteínas sintetizadas. Se ha demostrado que el incremento de la actividad α-amilasa en endospermos de cebada en respuesta a un aporte exógeno de giberelinas es debido a la síntesis “de novo” del enzima en células de la capa de aleurona. De hecho, parece que el efecto más importante de las giberelinas en la síntesis de α-amilasa es la activación de la transcripción de los genes que codifican para dicha proteína.
La medida del efecto del ácido giberélico en la movilización de reservas amilaceas se realizará mediante la cuantificación de los productos resultantes de la hidrólisis del almidón. La hidrólisis del almidón por amilasa conduce a la formación de glucanos lineales solubles a partir de la amilosa y a partir de amilopectina, dextrinas ramificadas. Estos productos pueden ser degradados posteriormente por la acción de la amilasa o por otras enzimas.
Figura 1 Representación esquemática de la movilización de reservas que tienen lugar en las semillas de cebada. Las Gas producidas en el embrión y escutelo estimulan la síntesis de enzimas hidrolíticas, principalmente α-amilasas, en la capa de aleurona. Las amilasas degradan el almidón y los productos de la digestión son absorbidos por la plántula en crecimiento
amilasa amilosa glucosa + glucanos lineales solubles (maltosa, maltotriosa.. )
amilasa amilopectina glucosa + glucanos lineales solubles + dextrinas límite
MATERIAL
- Granos de cebada ( Hordeum vulgare )
- Solución de ácido giberélico (GA 3 ) 1μM en agua
- Reactivo de dinitrosalicílico (1 g de dinitrosalicílico en 20 ml de NaOH 2N. Añadir 30 g de tartráto sódico potásico y llevar a 100 ml con agua destilada. Guardar bien cerrado en botella ámbar). PRECAUCIÓN: reactivo tóxico y cáustico.
- Bisturí.
MÉTODO
1.- Preparación de las Muestras
- Tomar 60 granos de cebada y cortarlos transversalmente con el bisturí (manejar con precaución) en dos mitades aproximadamente iguales.
- Eliminar la mitad que contiene el embrión, quedándose solamente con los medios endospermos.
- Colocar 30 de estos medios endospermos en una placa petri con 20 ml de agua destilada y los otros 30 en una placa con 20 ml de la solución de ácido giberélico.
- Incubar durante 24 horas en una cámara en oscuridad a 26 o^ C
2.- Valoración de azúcares reductores
Preparación del extracto
- Triturar en un mortero los 30 medios endospermos de cada placa.
- Añadir 10 ml de su correspondiente medio de incubación (agua o GA 3 ) hasta conseguir una mezcla homogénea.
- Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos
- Tomar el sobrenadante de la centrifugación para analizar cuantitativamente los azúcares reductores.
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Para la realización de esta práctica es imprescindible el uso de: − Bata de laboratorio − Guantes de látex. − Gafas protectoras.
Eliminación de residuos sólidos y líquidos: deberán atenderse las normas indicadas en el laboratorio.
Finalizada la práctica, lavarse las manos con agua y jabón
Práctica IV
AUXINAS Y ELONGACION
INTRODUCCIÓN
Los tejidos vegetales contienen unas sustancias hormonales reguladoras del crecimiento denominadas AUXINAS, siendo la más importante el ácido indol-3-acético (AIA).
Los principales procesos regulados por auxinas son:
- El crecimiento celular.
- En algunos tejidos, como el cambium, también controlan la división celular.
- Los procesos de rizogénesis
- Dominancia apical.
- Procesos de abscisión.
Las auxinas se encuentran ampliamente distribuidas en el reino vegetal. Dentro de una misma planta no todos los órganos tienen la misma cantidad. En plántulas, en el ápice del coleoptilo (hoja modificada consistente en una envuelta que encierra las hojas embriónarias y el ápice del tallo), existe una alto contenido de auxinas, que va disminuyendo a medida que se desciende a lo largo del coleoptilo, alcanzándose el mínimo en la base, y un incremento a medida que nos acercamos al ápice de la raíz, aunque el contenido en AIA que se alcanza en este punto es mucho menor que el que existe en el ápice del coleoptilo.
Debido a la baja concentración en que se encuentran las auxinas en los tejidos vegetales, durante mucho tiempo los ensayos biológicos han sido el único medio satisfactorio de realizar un análisis cuantitativo, ya que la sensibilidad de estos métodos es grande, aunque tienen el inconveniente de ser inespecíficos dentro del grupo, y poco exactos. Los bioensayos más utilizados son los basados en medir el crecimiento en longitud de un tejido. En estos ensayos, la respuesta del incremento de longitud es proporcional al logaritmo de la concentración de auxina, aunque si se eligen las concentraciones adecuadas puede tenerse una respuesta lineal.
En todos los experimentos de elongación, el incremento del crecimiento aumenta con la concentración de auxina, hasta un valor máximo. En este punto hay una inflexión, y al aumentar más la concentración, la elongación disminuye. La curva de crecimiento resultante de estos experimentos es interesante, porque la concentración óptima de auxinas varía según los órganos.
Se pretende medir la elongación de segmentos de coleoptilo de maíz, producida por diferentes concentraciones de auxina (AIA).
MATERIAL
− Semillas de maíz ( Zea mays ). − Soluciones de AIA a concentraciones de: 0, 10 -7^ , 10 -6^ , 10 -5^ , 10 -4^ y 10 -3^ M. − Bisturí.
MÉTODO
Granos de maíz se ponen en imbibición de 3 a 4 horas. Pasado este tiempo se siembran en vermiculita, cubriendo ligeramente su superficie y regando con agua abundante, para evitar su desecación durante el período de germinación, que se llevará a cabo en atmósfera saturada de humedad, en oscuridad, durante 4 días a una temperatura de 26º C.
Transcurrido este tiempo, se toman las plántulas cuyo coleoptilo tenga una talla mínima de 2 cm aproximadamente, evitando tocarlo con los dedos. Hay que reunir 6 lotes de fragmentos de 1cm de coleoptilo que sean lo más homogéneos posible; es decir, extraídos de plántulas que tengan un tamaño lo más parecido posible y que procedan de la misma zona del coleoptilo. Para ello, utilizando el bisturí (manejar con precaución) se elimina el ápice (2 mm) y se corta el segmento siguiente de 1 cm, desechándose el resto. Se colocan de 10 a 12 trozos en sendas placas petri con 20 ml de cada una de las siguientes soluciones: agua destilada y AIA, a las concentraciones indicadas en el apartado de materiales.
Las placas así preparadas se incuban en oscuridad durante 24 horas a 26ºC. Transcurrido este tiempo se medirán los trozos de coleoptilo correspondientes a cada tratamiento, calculando la media de longitud de cada lote, y por tanto la elongación producida por cada tratamiento.
RESULTADOS
AIA Molar. 0(H 2 O) 10 -7^10 -6^10 -5^10 -4^10 -
∆L (mm)
Individual
Colectivo
COMENTARIOS
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Para la realización de esta práctica es imprescindible el uso de: − Bata de laboratorio − Guantes de látex
Eliminación de residuos sólidos y líquidos: deberán atenderse las normas indicadas en el laboratorio.
Finalizada la práctica, lavarse las manos con agua y jabón
Tomar hojas frescas de espinaca en suficiente número y coloración para obtener un extracto concentrado de pigmentos. Desposeerlas de la nervadura media y macerarlas en un mortero hasta conseguir una pasta homogénea. Añadir entonces 30 ml de acetona y agitar durante dos minutos con la mano del mortero para facilitar la extracción. Aunque la acetona es un disolvente de polaridad media, es capaz de extraer una cantidad de pigmentos apolares suficiente para realizar el protocolo de separación.
Filtrar ahora el homogeneizado a través de un papel del filtro, utilizando un embudo normal, de tal forma que el filtrado se recoja en el embudo de decantación. La disolución resultante contiene clorofilas a y b , carotenos y xantofilas, muy apolares, así como una cierta cantidad de fenoles, relativamente polares, en los que es muy rica la hoja de espinaca. Si las clorofilas están muy concentradas, puede observarse fluorescencia roja en el menisco. De este filtrado se recogerán 2 ml en un tubo de ensayo recubierto de papel de aluminio, que serán empleados en la siguiente práctica.
En este punto, hay que separar pigmentos apolares de fenoles polares, ya que si están demasiado tiempo en contacto, los fenoles pueden extraer el magnesio de las clorofilas. Para lograr la separación, se añaden sobre la disolución acetónica 20 ml de éter de petróleo y se agita el embudo de decantación para lograr que las diferentes substancias se repartan entre los dos disolventes (Precaución: después de cada agitación, destapar el embudo para eliminar los gases producidos). Al cabo de unos minutos, se deja reposar la mezcla hasta que se separen dos fases, una superior que contiene los pigmentos fotosintéticos disueltos en éter, fuertemente verde, y una inferior, amarillenta, que contiene los fenoles disueltos en acetona. La densidad de la acetona es de 0,79 mientras que la del éter de petróleo es 0,65.
Advertencia : Pueden no separarse bien ambas fases. El éter de petróleo y la acetona son miscibles. Para separarse la mezcla en dos fases, ambos disolventes deben hacerse inmiscibles y esto se logra al mezclarse con la acetona el agua del tejido foliar. La acetona acuosa, mucho más polar que la acetona pura, es ahora inmiscible con el éter. Si las fases no se separaran, habrá que añadir una pequeña cantidad de agua destilada en el embudo de decantación, agitar de nuevo, y dejar que ambas fases se separen.
La fase inferior, acetónica, se elimina y sobre la disolución de pigmentos en éter de petroleo, estrictamente apolar, se añaden 20 ml de metanol al 92%, polar. El embudo contiene ahora dos fases inmiscibles entre las que se repartirán, después de agitación, los diferentes pigmentos en función de su polaridad (Precaución: después de cada agitación, destapar el embudo para eliminar los gases producidos). La clorofila a , más apolar que la clorofila b , quedará en el éter de petroleo, mientras que esta última, algo menos apolar, pasará al metanol. Los carotenos, más apolares que las xantofilas, quedarán en el éter de petroleo mientras que estas últimas, algo más polares, pasarán al metanol. Después de un periodo de reposo, se separarán dos fases, una superior etérea que contiene clorofila a y carotenos, y otras inferior, metanólica (densidad 0,79), que contendrá clorofila b y xantofilas. La fase inferior se recoge en un vaso de precipitado y se guarda en obscuridad para seguir trabajando con la fase superior, que queda en el embudo de decantación.
Clorofila a y carotenos tienen una polaridad muy semejante, por lo que resulta muy difícil su separación por simple reparto. Para lograr ésta, se procederá a la modificación química de la clorofila en orden a aumentar su polaridad. Para ello, se añaden 10 ml de potasa al 30% en metanol sobre la disolución contenida en el embudo y se agita la mezcla (Precaución: después de cada agitación, destapar el embudo para eliminar los gases producidos). La clorofila a , al igual que la clorofila b , posee un resto propiónico en el pirrol D, esterificado con fitol. El enlace éster será roto por hidrólisis alcalina, liberándose fitol por una parte y una molécula de clorofila con el resto propiónico libre (Fig. 3). Este derivado de la clorofila recibe el nombre de clorofilida y es menos apolar que su correspondiente clorofila al tener un carboxilo libre en el pirrol D. Durante la agitación, la potasa irá hidrolizando el enlace éster y la clorofilida se repartirá en el metanol según se vaya formando. Así, tras unos minutos de reposo, se volverán a separar dos fases, una superior, etérea y apolar, que contendrá carotenos, y otra inferior, metanólica, alcalina y polar, que contendrá la clorofilida a. Cada una de las fases se recogerá en el correspondiente tubo de ensayo.
Para la separación de la clorofila b y las xantofilas se procederá de idéntica forma, pero el punto de partida es diferente, porque ambos tipos de pigmentos se encuentran en una fase polar (metanol al
92%). Por ello, no se puede proceder sin más a la hidrólisis alcalina del enlace éster de la clorofila b. Es necesario antes tener ambos tipos de pigmentos en un medio apolar, inmiscible con metanol. Para ello, se lava bien el embudo de decantación al objeto de suprimir los restos de potasa de la separación anterior. Una vez hecho esto, se carga en el embudo la disolución metanólica que contiene ambos pigmentos y se añaden 20 ml de éter dietílico, mucho más apolar que el metanol e inmiscible con él, y se agita la mezcla (Precaución: después de cada agitación, destapar el embudo para eliminar los gases producidos).
Advertencia : metanol y éter dietílico puros son realmente inmiscibles. Sin embargo, el éter dietílico puede absorber una cierta cantidad de vapor de agua. Por ello, podría suceder que, tras agitar la mezcla y después de dejarla reposar unos minutos, no haya separación de fases. En este caso, se añadirá agua destilada para aumentar la polaridad del metanol hasta que ambas fases, inferior metanólica y superior etérea, se separen. En este caso, clorofila b y xantofilas, menos apolares que sus homólogos ya separados, pero apolares al fin, se habrán repartido a la fase superior etérea (densidad 0,71).
El metanol se elimina y sobre la disolución de pigmentos en éter dietílico se añaden 10 ml de potasa al 30% en metanol y se agita la mezcla (Precaución: después de cada agitación, destapar el embudo para eliminar los gases producidos). La potasa separará el fitol del propionato en el pirrol D de la clorofila b , produciéndose la correspondiente clorofilida. Al ser ésta más polar que las xantofilas, se repartirá al metanol, quedando las xantofilas disueltas en el éter. Después de unos minutos de reposo, ambas fases se separarán y se recogerán en sendos tubos de ensayo. Figura 1 : Estructura de la clorofila a y clorofila b. Detalle estructura del fitol
Clorofila a Clorofila b
Comentario [Comment1]: PAGINA RESERVADA PARA FIGURAS DE LA PRACTICA IV
Figura 4 : Separación de pigmentos cloroplásticos
M
M
Xantofilas Clorofila b
EE M
EE MP
Metanol Potasa
+10 ml Eter Etílico (+H 2 O)
+20 ml
EP
EP MP
Metanol Potasa Carotenos Clorofila a
+10 ml
A
+30 ml Acetona
1 Hoja de espinaca
2 ml
Tapar y Guardar
A
EP
A
Eter de petróleo
(+H 2 O)
+20 ml Metanol 92%
+20 ml EP M
A M
Grupo 1 de la mesa
Grupo 2 de la mesa
Práctica VI
RECONOCIMIENTO DE PIGMENTOS FOTOSINTETICOS POR CROMATOGRAFIA
SOBRE PAPEL Y ESPECTROS DE ABSORCION
1.- CROMATOGRAFÍA DE REPARTO SOBRE PAPEL
INTRODUCCIÓN
Esta separación se basa en las distintas afinidades de los pigmentos hacia una fase estacionaria - el papel de cromatografía-, y su solubilidad diferencial en una fase móvil. Esta asciende por capilaridad sobre el papel, y arrastra a los solutos a una velocidad que, para cada uno de ellos, depende directamente de su afinidad por la fase móvil, e inversamente de su afinidad por la fase estacionaria. Al final de la cromatografía, cada soluto habrá recorrido una distancia diferente, consiguiéndose su separación.
MATERIAL
− Soluciones de pigmentos obtenidos en la práctica anterior − Papel de cromatografía Whatman nº − Capilares de vidrio − Éter de petróleo (PRECAUCIÓN: producto tóxico e inflamable) − Acetona (PRECAUCIÓN: producto tóxico e inflamable) − Cloroformo (PRECAUCIÓN: producto tóxico)
MÉTODO
Haremos la cromatografía en un tanque cilíndrico en atmósfera saturada de vapores de la fase móvil. Así se evita su evaporación a partir del papel, lo cual limitaría el avance del frente y produciría distorsiones en el mismo. En primer lugar, asegurarse de la perfecta hermeticidad de cierre de la tapa del tanque, aplicando silicona en caso de utilizar un tanque con tapa de borde esmerilado. Introducir la fase móvil en el tanque: 4 ml de acetona, 4 ml de cloroformo y 32 ml de éter de petróleo. Tapar
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Para la realización de esta práctica es imprescindible el uso de: − Bata de laboratorio − Guantes de látex. − Gafas de protección
Advertencia : debido a que los disolventes utilizados son volátiles es necesario mantener los envases cerrados y el recinto ventilado.
Eliminación de residuos sólidos y líquidos: deberán atenderse las normas indicadas en el laboratorio.
Finalizada la práctica, lavarse las manos con agua y jabón
