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UT Nº6 REALIZACIÓN DE TÉCNICAS DE VALORACIÓN DE LA
HEMOSTASIA Y LA COAGULACIÓN.
6.1 FISIOLOGÍA PLAQUETAR
FORMACIÓN PLAQUETAR
La formación de las plaquetas tiene lugar en la médula ósea y se conoce como trombopoyesis. Las plaquetas provienen de la célula comprometida mieloide (UFC- GEMM). La primera célula de morfología reconocible es el megacarioblasto, que dará lugar al madurar al megacariocito. A partir del megacariocito se forman las plaquetas. El origen de las plaquetas son fragmentos del citoplasma del megacariocito. Al final del proceso el núcleo es fagocitado. Un megacariocito da lugar a miles de plaquetas. La trombopoyetina es una hormona sintetizada en el hígado, riñón y músculo esquelético, que estimula la proliferación de megacariocitos y la salida de plaquetas de la médula ósea a sangre periférica. MORFOLOGÍA PLAQUETARIA Tienen formas variables, tamaño muy pequeño (1-4μm de diámetro) siendo la célula más pequeña de la sangre. Carece de núcleo pero tiene el resto de orgánulos celulares. Es frecuente la formación de prolongaciones del citoplasma (pseudópodos), que facilitan la adhesión de plaquetas formando agregados plaquetarios. E STRUCTURA INTERNA DE LAS PLAQUETAS La morfología de las plaquetas responde a su función, presenta un sistema fibrilar en su citoplasma que soporta la forma discoidea y le proporciona un mecanismo contráctil. Además, presenta gránulos en los que se almacenan sustancias específicas que se liberan en la activación plaquetar. En su membrana contiene una serie de glucoproteínas importantes para la hemostasia.
6.2 HEMOSTASIA
La hemostasia (Hemo=sangre,stasia=parada) es el conjunto de mecanismos fisiológicos mediante los cuales se consiguen detener y cohibir los procesos hemorrágicos y restablecen la circulación de la sangre en el vaso lesionado. La hemostasia es un proceso fisiológico por el que la sangre, que es líquida, se convierte en viscosa y finalmente se solidifica formando un coágulo que impide la hemorragia por la lesión del vaso sanguíneo. El coágulo se mantiene hasta que se repara la lesión vascular y finalmente se disuelve o desintegra para que se restablezca la circulación sanguínea en el vaso. El fallo de la hemostasia puede llevar alteraciones importantes como: Hemorragias: al no repararse las lesiones de los vasos (arterias, venas, capilares). Coagulación Intravascular: al no producirse la disolución de los coágulos pequeños, llegando incluso a la trombosis (coágulo grande que obstruye totalmente un vaso).
6.3 ETAPAS DE LA HEMOSTASIA. PRIMERA ETAPA.
La hemostasia puede dividirse para su estudio en tres etapas que están relacionadas entre sí, que se desencadenan casi simultáneamente, pero tiene un desarrollo secuencial: 6.3.1 PRIMERA ETAPA DE LA HEMOSTASIA. TROMBO BLANCO Conjunto de fenómenos que tienen como finalidad la formación del trombo plaquetario o tapón plaquetario en el lugar de la lesión del vaso y, a consecuencia de ello el cese de la hemorragia. Se desarrolla en 2-3 segundos. Tiene dos componentes una respuesta vascular y una respuesta plaquetaria: 1.- RESPUESTA VASCULAR En la que se sucede las siguientes etapas: A) Vasoconstricción Al producirse la rotura de un vaso sanguíneo se produce una vasoconstricción, es decir, se contrae el vaso de forma refleja en el lugar de la lesión por la estimulación directa de los nervios simpáticos existentes en las paredes de los vasos. Con la vasoconstricción se estrecha la luz del vaso y se reduce la hemorragia debido a dos motivos:
- Se reduce el flujo sanguíneo en el vaso lesionado y se aproximan los bordes de la lesión del vaso.
- Las plaquetas se aproximan entre sí y entran en contacto con las paredes del vaso dañados y se activan. B) Activación de la respuesta plaquetar Si realizamos un corte transversal a un vaso sanguíneo, podemos observar las siguientes capas: íntima, media y adventicia. En la capa íntima podemos ver a su vez dos subcapas: a) Capa íntima dividida en dos:
- Capa endotelial con células endoteliales que tapizan la luz interna de los vasos. Estas células endoteliales tienen la propiedad de no activar ni las plaquetas ni los factores plasmáticos de la
Cuando la lesión es producida en un vaso pequeño, el agregado plaquetario forma el trombo plaquetario que es suficiente para impedir la hemorragia. Cuando la lesión vascular es grande es necesario que ocurra la coagulación de la sangre. 1º Lesión del vaso sanguíneo. 2º Espasmo vascular 3º Formación de tapón de plaquetas. 6.3.2 2ª ETAPA DE LA HEMOSTASIA. TROMBO ROJO FORMACIÓN DEL TROMBO ROJO. En esta etapa de la coagulación se forma el coágulo rojo o trombo rojo que es un TROMBO DE FIBRINA muy resistente que se va formando alrededor del trombo plaquetario para reforzarlo. El trombo de fibrina engloba y atrapa a otras células sanguíneas, como son los eritrocitos por lo que también recibe el nombre de trombo rojo. (también se pueden capturar leucocitos). La coagulación sanguínea implica en último término la gelificación de la sangre gracias a la conversión de una proteína plasmática soluble, el fibrinógeno, en otra insoluble, la fibrina, la cual constituye la base del coágulo sanguíneo. En la formación del trombo rojo intervienen una serie de elementos como los factores de coagulación FACTORES DE LA COAGULACIÓN: Para que tenga lugar la formación del coágulo, además de las plaquetas, intervienen los factores de la coagulación, que se designan con números romanos y pueden ser de varias clases: factores plasmáticos (presentes siempre en .el plasma) factores coagulantes no plasmáticos, se liberan al plasma sólo en caso de coagulación: calcio tisular, factor hístico (tromboplastina tisular) y factor 3 plaquetario (F 3 P). Pasamos a analizarlos:
Factores coagulantes plasmáticos : son enzimas proteolíticas de naturaleza proteica, sintetizados por el hígado (excepto el factor VIII) y que circulan disueltos en el plasma sanguíneo: Factores numerados: ◦ Factor I: Fibrinógeno ◦ Factor II: Protrombina.Vit. K dependiente ◦ Factor V: Proacelerina- factor lábil, cofactor ◦ * Factor VII: Proconvertina- Vit. K dependiente ◦ Factor VIII: Factor antihemofílico A (producido por las células endoteliales). ◦ Factor IX: Factor antihemofílico B o Factor Christmas o PTC (Componente plasmático de tromboplastina). Vit. K dependiente ◦ Factor X: Factor de Stuart-Prower.Vit. K dependiente ◦ Factor XI: Factor antihemofílico C o antecedente plasmático de tromboplastina (PTA). ◦ Factor XII: Factor de contacto o Factor de Hageman. ◦ Factor XIII: Factor estabilizador de la fibrina. Factores no numerados: ◦ Factor Fletcher (Prekalicreína) ◦ Factor Fitzgerald (Kininógeno de alto peso molecular) Todos los factores plasmáticos son proteínas producidas en el hígado excepto el factor VIII que se produce en las células endoteliales. Y además los factores II-VII-IX y X son vitamina K dependientes. Factores coagulantes no plasmáticos: *Factor IV: Calcio* , necesario en casi todas las etapas de la coagulación. Los anticoagulantes (citrato sódico, oxalato sódico y EDTA) neutralizan el calcio. _Factor III: Tromboplastina_ , este factor tisular de naturaleza lipoproteica se encuentra en las células endoteliales de los vasos sanguíneos y es liberado al plasma cuando se produce una lesión vascular con rotura de las células endoteliales. _Factor 3 plaquetario (F3P)_* , liberado por las plaquetas activadas. MECANISMO DE LA COAGULACIÓN La coagulación consiste en una serie de reacciones enzimáticas en cascada que finaliza con la transformación del fibrinógeno (que es una proteína soluble) en fibrina (que es una proteína insoluble) que constituye el esqueleto del coágulo o trombo de fibrina. Todo el proceso de la coagulación puede dividirse en 3 vías:
**- Vía intrínseca
- Vía extrínseca
- Vía común** Tanto la vía extrínseca como intrínseca comprenden una serie de reacciones con sus factores de coagulación que finalizan con la activación del factor X que inicia la vía común. VÍA INTRÍNSECA DE LA COAGULACIÓN: En el plasma circula el FACTOR XII inactivo, pero se activará al ponerse en contacto con las fibras de colágeno; activándose sucesivamente en cascada los factores XI, IX, VIII que finalmente activará al factor X.
III están muy predispuestos a padecer fenómenos trombóticos. También inhiben al factor IX, X, XI, XII >>COFACTOR II DE LA HEPARINA : Inhibe II, IX, X, XI y XII. Deficiencia cofactor II supone predisposición tromboembólica. >>PROTEÍNA C : Es una proenzima anticoagulante dependiente de la vitamina K, sintetizada en el hígado y que circula en el plasma. Es activada por la trombina, y se convierte en una enzima activa, la proteína C activada (PCA) que actúa inactivando a los Factores Va y VIIIa, impidiendo la formación de fibrina. La PCA también puede estimular la fibrinolisis y acelerar la lisis del coágulo. La deficiencia congénita heterocigótica de proteína C puede predisponer a eventos trombóticos. >>LA PROTEÍNA S: Es una glicoproteína dependiente de vitamina K, sintetizada predominantemente dentro del hígado. También es sintetizada en las células endoteliales y está presente en las plaquetas. Actúa como un cofactor necesario para la proteína C activada (PCA) en la inactivación de los factores Va y VIIIa. 6.3.3 3ª ETAPA DE LA HEMOSTASIA: FIBRINOLISIS Una vez que el coágulo ha cumplido su misión de impedir la hemorragia y se ha reparado la lesión de la pared vascular su presencia en la sangre es peligrosa y debe ser destruido. Las células endoteliales de los vasos contienen factores antiagregantes y activadores de la fibrinólisis que salen cuando la hemorragia ha cesado. En el plasma existe una proteína inactiva que es el PLASMINÓGENO o PROFIBRINOLISINA, que por acción de unos activadores (activadores procedentes de las células endoteliales) pasa a PLASMINA o FIBRINOLISINA, que tiene acción fibrinolítica, es decir, tiene capacidad para destruir los hilos de fibrina que forman el coágulo, que empezará a desintegrarse, liberándose los productos de degradación de la fibrina P.D.F. (fragmentos X, Y, D y E). El plasminógeno se incorpora a la estructura del coagulo, se activa por acción del t-PA (activador tisular del plasminógeno producido en el endotelio y otros tejidos, y se elimina por el hígado) y la urokinasa (enzima renal). En la imagen se observa como las dos vías activan el plaminógeno. Los compuestos PAI-1 y antiplasmina regulan el proceso, al realizar un efecto inhibidor en las vías que intervienen.
6.4 TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA:
A) Técnicas de estudio de la actividad plaquetaria: Recuento de plaquetas Tiempo de hemorragia o sangría Retracción del coágulo B) Técnicas que determinan la resistencia capilar: Rumpel-Leede C) Técnicas para el estudio de la coagulación intrínseca: Tiempo de coagulación de sangre total Tiempo de recalcificación del plasma (tiempo de Howell) Tiempo parcial de tromboplastina (tiempo de cefalina) Tiempo parcial de tromboplastina activada (tiempo de cefalina activada) D) Técnicas que estudian la coagulación extrínseca: Tiempo de protrombina E) Técnicas de estudio de la formación de fibrina: Tiempo de trombina Tiempo de reptilase Determinación de fibrinógeno F) Estudio de anticoagulantes circulantes: Prueba de mezclas G) Técnicas para el estudio de la fibrinólisis:
- Tiempo de lisis del coágulo total
- Prueba de lisis del coágulo de euglobulinas -Productos de degradación del fibrinógeno H) Cuantificación de factores de coagulación I) Tromboelastrografía J) Pruebas inmunológicas de coagulación 6.4.1 NORMAS GENERALES PARA LAS PRUEBAS DE LA COAGULACIÓN Estas normas deben respetarse para que los resultados obtenidos sean más precisos: A) Material: En general el material debe ser de plástico desechable o vidrio siliconado (el vidrio activa la coagulación). Además el material debe estar bien limpio ya que la limpieza del material es fundamental dado que puede influir en la coagulación, y no estar rayado. En caso de tener que usar tubos de vidrio común (no recomendable) antes de su uso se deben sumergirse en una mezcla sulfocrómica y aclarar bien con agua destilada para eliminar restos químicos:
Centrífuga.
Pipetas Pasteur, de plástico.
Pipetas (manual y automáticas 0'1/0'2 ml)
(pueden aguantar 2 semanas a -40ºC y seis meses a -80ºC). Si se quieren congelar las muestras, una vez separado el plasma debe realizarse una congelación rápida en alícuotas para prevenir la formación de cristales. La congelación o descongelación lentas pueden producir la crioprecipitación de algunos factores de coagulación. Se descongela directamente a 37ºC al baño Mª no más de 5 minutos. La relación anticoagulante/sangre, es crítica. La desviación de esta relación limita la disponibilidad del calcio en el sistema y puede ser una causa de error. Para obtener plasma rico en plaquetas, centrifugar 1500-1800 r.p.m. durante 5- minutos. El sobrenadante no debe estar más de dos horas a Tº ambiente, siempre en contenedor cerrado. Siempre que se pueda, analizar la sangre en las primeras 4 horas después de su extracción. C) REACTIVOS: (SUPUESTAMENTE NO) Los reactivos deben controlarse periódicamente con plasma control y también se controlará cada lote nuevo recibido. Se debe comprobar la fecha de caducidad y conservarlos en la nevera a 4ºC. Los reactivos se deben disolver con agua destilada procurando no agitar con el fin de evitar la formación de burbujas y espuma.<
TROMBOPLASTINA (de cerebro de conejo, pulmón, placenta) TROMBINA (de origen bovino) CEFALINA (para sustituir el F3P) sola o asociada con Caolín u otro activador del factor de contacto. CLORURO CÁLCICO 0,025M que se añade al plasma para aportar el calcio necesario para la coagulación, ya que el Ca+2^ está bloqueado por los anticoagulantes. PLASMA PATRÓN: puede comprarse plasma liofilizado, o se puede hacer, con el plasma de 20 personas sanas, que no tomen medicación que altere a la coagulación, entre 20-50 años, (mejor 50% hombre y 50% mujeres), entre las 9-11 de la mañana, con recogida de sangre en jeringas desechables de plástico y agujas de mariposa de 21 calibre. En tubos con citrato 1:9. Se guardan las muestras en hielo mientras se hace el pool de plasma. Se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 15 minutos a 4ºC. Se mezclan todos los plasmas. Luego hacemos fracciones con pipetas de plástico en viales de 1,5 ml. Congelamos a -80ºC hasta 6 meses. TAMPONES: Tampón Imidazol, el de Owren, Tampón de glioxalina REPTILASE (actúa sobre el fibrinógeno sin verse influenciado por la heparina) D) EL ANTICOAGULANTE El anticoagulante utilizado es el citrato trisódico dihidratado al 3'8%, o citrato sódico 5,5 hidratado, o citrato sódico 2 hidrato 3,2% que neutraliza o “secuestra” el ion calcio, importante para la coagulación. A veces también puede utilizarse el oxalato sódico. No debe utilizarse la HEPARINA porque inhibe la trombina. La sangre se recoge sobre la cantidad adecuada de anticoagulante en un tubo y se homogeniza bien para evitar la aparición de coágulos (1 ml de anticoagulante y 9 ml de sangre) 6.4.2 TÉCNICAS: Las pruebas de coagulación se deben realizar por duplicado o triplicado y hacer la
media de los tiempos, siempre que la diferencia no sea muy elevada, pues si no deberemos repetir la determinación. Los reactivos se deben mezclar rápidamente con el plasma problema o control y en ese momento se pondrá en marcha el cronómetro que se detendrá cuando se forme la fibrina. 1) Hemograma y recuento plaquetario: La cantidad normal de plaquetas en la sangre es de 150,000 a 400,000 por microlitro (). Recuentos mayores de 50.000 no suelen plantear problemas hemorrágicos. Para el estudio de la morfología de plaquetas se solicita un frotis de sangre periférica. Sirve para descartar microagregados en las pseudotrombopenias, volumen aumentado en Bernard-Soulier (deficiencia de la GPIb), o síndromes mielodisplásicos. ÍNDICES PLAQUETARIOS
- Plaquetocrito.PTC o PCT. Valores normales entre el 0,12 y el 0,36%. Hace referencia al porcentaje que ocupan las plaquetas en un volumen de sangre. - Volumen plaquetar medio. (VPM o MPV). Valor normal entre 7,2 y 11fl. Volumen menores indican microtrombocitos, valores mayores indican macrotrombocitos.
- Anchura de distribución plaquetaria (PDW). Valores normales entre el 35-65%. Valores más elevados indican anisocitosis. 2) Tiempo de hemorragia: Es el tiempo que transcurre desde que se puncionan los capilares hasta la formación del agregado plaquetar, mide la capacidad de los capilares para responder a una lesión. Un tiempo de hemorragia prolongado se produce, generalmente, cuando la cifra de plaquetas es inferior a 100000/mm³. Existen dos métodos: Método de Duke y Método de Ivy. Método de Duke: Se efectúa una punción por encima de la porción grasa del lóbulo de la oreja y se mide exactamente el tiempo durante el cual fluye sangre de esta pequeña herida. Material:
- Lanceta estéril
- Papel de filtro
- Alcohol
- Algodón
- Cronómetro Técnica:
- Se limpia el lóbulo de la oreja con algodón empapado en alcohol y se deja secar.
- Se efectúa una punción en el lóbulo de la oreja e inmediatamente se pone en marcha el cronómetro.
- Se elimina la gota de sangre cada treinta segundos mediante un papel de filtro, sin que toque la zona puncionada para que no se rompa el tapón plaquetario. A medida que las plaquetas se van agregando disminuye la hemorragia y la gota de sangre se va haciendo cada vez más pequeña.
- Cuando la sangre cesa de fluir se para el cronómetro y se anota el tiempo transcurrido
Material: Baño María Tubos graduados Muestra de sangre Alambre Técnica: -Colocar 2ml en un tubo de centrifuga si puede ser graduado e introducir un alambre en el fondo del tubo (el alambre debe tener 1mm de grosor y unas 10 espirales en su parte inferior) -Colocar el tubo en el baño termostatado a 37º C y mantenerlo durante 1h -Al cabo de este tiempo sacar cuidadosamente el alambre (éste arrastra el coágulo) y medir el volumen de suero que queda en el tubo, este volumen se anota como porcentaje del volumen inicial de sangre completa en el tubo. Cálculo: ℅ volumen inicial ═ volumen de suero expulsado X 100 Volumen de sangre total Los valores normales oscilan entre 45 y 65% si la retracción es normal. Los pacientes con trombopenia o trombopatías presentan una cantidad escasa de suero y un coágulo grande, poco consistente y mal delimitado. 4) Tiempo de coagulación de sangre total. Esta prueba se utiliza sobre todo para controlar a los pacientes en tratamiento con anticoagulantes. Fundamento: La sangre se coagula cuando se extrae de un vaso sanguíneo y se somete a una superficie extraña. El tiempo de coagulación de sangre total es el tiempo necesario para que una determinada cantidad de sangre coagule, sometida a ciertas condiciones específicas. Material: Baño María Tubos Cronómetro Sangre problema Técnica:
- Se rotulan cuatro tubos perfectamente limpios, se colocan en una gradilla y se colocan en el baño María a 37º C
- Se extrae la muestra de sangre y se pone en marcha el cronómetro pues en este momento comienza la coagulación sanguínea.
- Se pone 1ml de sangre en cada tubo.
- Exactamente a los tres min se inclinan los tubos hasta un ángulo de 45º, uno por uno y cada 30sg hasta que se pueda invertir el tubo sin que se derrame su contenido
- Se anota separadamente el tiempo de cada tubo, la cifra definitiva es el promedio de los cuatro tubos Valores normales: Oscilan entre 4 y 10 min
5) Tiempo de recalcificación del plasma. Esta prueba permite valorar de una forma global el proceso intrínseco de la coagulación. Consiste en medir el tiempo de coagulación del plasma de sangre anticoagulada con citrato y añadiéndole luego nuevamente calcio (recalcificándola). Fundamento: Se mezcla el plasma pobre en plaquetas con una cantidad suficiente de cloruro cálcico, se incuba a 37º C y se mide el tiempo de coagulación. Material:
- Baño María
- Tubos
- Pipetas
- Cronómetro
• Cloruro cálcico 0,025M: 1,38gr de cloruro cácico y agua destilada en 500ml.
- Cloruro sódico 0,85% p/v
- Muestra de sangre anticoagulada (una parte de citrato y nueve partes de sangre) Técnica:
- Centrifugar la muestra a 2500rpm durante 20min para obtener un plasma pobre en plaquetas.
- Incubar a 37º C dos o tres minutos, tenemos que tener preparados los reactivos para la prueba, es decir en plasma, ClNa y Cl2Ca.
- Pipetear en un tubo colocado en el baño termostatado 0,1ml de cloruro sódico y 0,1ml de plasma agitar para mezclar bien.
- Agregar 0,1ml de cloruro cálcico y simultáneamente poner en marcha el cronómetro.
- Mantener el tubo en el baño María 90 seg, agitando cada treinta segundos.
- Sacar luego el tubo del baño María, esperar a que se forme el coágulo y anotar el tiempo. Valores normales: Esta entre 90seg y 250seg Técnica en coagulómetro - Obtención de sangre venosa que ponemos en citrato sódico con una proporción de 1+ (1 de anticoagulante, 9 de sangre).
- Centrifugar la sangre citratada a 1. 500-1.800 rpm. Durante 5 minutos para obtener un plasma citratado rico en plaquetas (abundante f3p).
- Ponemos en marcha el coagulómetro (ON) y esperamos a que el piloto rojo se apague, esto nos indica que el termostato alcanzó los 37ºC.
- Atemperamos plasma y reactivo en las celdillas del termostato durante unos 5 minutos (300 seg.) Por separado, cuando estén atemperados es cduando se mezcla -Usamos 0,2 de plasma patrón, que debemos sacar 30 minutos antes de la nevera
- Colocamos cubilete con varilla con 0'2 ml plasma en la celdilla de reacción y ponemos el capuchón. Pulsamos RESET para poner el cronómetro a cero.
- Añadimos con una pipeta en posición vertical 0'2 ml de cloruro cálcico al cubilete con 0'2 ml de plasma que ya están en la celdilla de reacción.
- El cronómetro empieza a funcionar hasta que comienza a formarse el coágulo de
- Después de 30seg se inclina suavemente el tubo una vez cada 2 seg. hasta que se
observe la formación de un coágulo de fibrina semejante a un gel. En este momento se detiene el cronómetro y se anota el tiempo transcurrido.
- Tanto la prueba en plasma testigo (normal) como sobre plasma del paciente se
deben hacer por duplicado y calcular la media de los tiempos. Valores normales: están entre 60 y 100 seg 7) Tiempo de Protrombina, TP (no evalúa al factor III). Tiempo de protrombina o tiempo de Quick Fundamento: El tiempo de protrombina o tiempo de Quick mide el tiempo de coagulación de un plasma citratado (descalcificado) y pobre en plaquetas, al que se le añade calcio y tromboplastina tisular (FIII). Es una prueba que permite valorar la vía extrínseca de la coagulación. El reactivo utilizado es la tromboplastina cálcica liofilizada reconstituida con agua bidestilada. Material:
- Baño María
- Tubos
- Pipetas
- Cronómetro
- Plasma testigo normal
- Tromboplastina con cloruro sódico (viene preparado para reconstituir)
- Sangre problema Técnica:
- Colocar en un tubo al baño María tromboplastina cálcica a 37º C
- Poner 0,1ml de sangre problema en otro tubo, incubar a 37º C dos o tres min
- Añadir 0,2ml de tromboplastina cálcica y poner el cronómetro en marcha
- En cuanto se aprecie el coágulo de fibrina parar el cronómetro Valores normales: Varía entre 11 y 15 seg Técnica con coagulómetro:
- Centrifugamos sangre citratada (1:9) a 3.000 r.p.m. durante 10' para conseguir un plasma citratado pobre en plaquetas.
- Ponemos en marcha el coagulómetro (ON), esperamos que el piloto rojo se apague, esto nos indica que el termostato alcanzó los 37ºC.
- Atemperamos el plasma y el reactivo a 37ºC durante 3 a 5' en las celdillas de incubación: Tromboplastina cálcica = 0'2 ml (200 μl) en tres cubiletes con varital) en tres cubiletes con varita agitadora, que hemos introducido con pinzas Plasma en un cubilete sin varita agitadora.
- Para contar los 5 minutos pulsamos la tecla RESET para poner el cronómetro a cero y luego START para que se inicie el cronómetro hasta los 300 seg. (5 minutos).
- Colocamos en la celdilla de reacción un cubilete con 0'2 ml de tromboplastina cálcica, introduciéndolo bien hasta el fondo y colocamos el capuchón. Pulsamos el mando RESET para que el cronómetro se ponga a cero. En este momento el sistema óptico hace pasar un rayo de luz a través del reactivo y hace un cero de absorbancia.
- Cogemos 0'1 ml (100 μl) en tres cubiletes con varital) de plasma con la pipeta automática, introducimos toda la punta en el agujero del capuchón y expulsamos enérgicamente el plasma.
- Al entrar en contacto el plasma y la tromboplastina cálcica se produce una variación en la absorbancia del sistema óptico, esto hace que automáticamente se ponga en marcha el cronómetro y el agitador magnético, al dar vueltas el imán, hará lo mismo la varita metálica y se mezcla el plasma y la tromboplastina cálcica.
- Al iniciarse la formación del coágulo de fibrina hay una variación de absorbancia y el sistema óptico para automáticamente el cronómetro y el agitador magnético. En la pantalla queda reflejado el TIEMPO DE PT en segundos y décimas de segundos.
- Finalizada la prueba apagaremos el aparato (OFF). Resultados e interpretación: La prueba se hace por triplicado y se hace la media de los tiempos obtenidos, tanto con el plasma control (patrón normal) como con el plasma problema (plasma del paciente). La prueba con el plasma control o patrón normal se realiza cada vez que iniciamos un lote de tromboplastina cálcica, aunque sea del mismo laboratorio y anotamos el tiempo de PT, posteriormente sólo realizaremos la prueba con los plasmas problema o de los pacientes, comparando los tiempos obtenidos con los tiempos obtenidos con el plasma control. Hacemos todo esto porque la Tromboplastina Cálcica tiene distintas procedencias y por lo tanto distinta sensibilidad, dando tiempos de PT algo diferentes. Se suelen utilizar plasmas control (patrones) que con las distintas tromboplastinas cálcicas nos den un tiempo de PT entre 10-12 segundos. El resultado de la prueba del TIEMPO DE PROTROMBINA o TIEMPO DE QUICK puede expresarse de varias formas:
En segundos : se da el tiempo de PT del paciente y del control
P.e: paciente = 13 seg. Control = 11'4 seg. Siendo valores normales entre 11 y 15 segundos, con un patrón entre 10 y 12 segundos.
Índice de protrombina o índice de Quick : resultado de dividir el tiempo de
TP del control por el del paciente, expresado en %. P.e.: Índice de Quick =11'4/13 x 100 = 87'6 % TP Control ───────── x 100 TP Paciente TIEMPO DE TROMBINA (TT): En coagulómetro Fundamento: Con esta prueba se mide el tiempo de coagulación de un plasma citratado pobre en plaquetas al que se le añade Trombina.
-Representar en un papel gráfico logarítmico, la media del tiempo de coagulación frente a la concentración de fibrinógeno. Considerar la dilución a 1/10 como el valor estándar. -Diluir el plasma de prueba (paciente) a 1/10, determinar el tiempo de coagulación en el coagulómetro y leer el valor de fibrinógeno correspondiente en el gráfico.
- Resultados e interpretación: Normalmente es de 1,5-3,5 g/l. 6.4.3 TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA FIBRINÓLISIS La fibrinólisis es la disolución del coágulo de fibrina que engloba células sanguíneas. La fibrinólisis no está muy estudiada y muchas de sus pruebas son escasamente utilizadas. 10) PRUEBA DE LISIS DEL COÁGULO Fundamento: Consiste en medir el tiempo que tarda en disolverse el coágulo formado a partir de sangre entera. Técnica: Se puede utilizar el tubo de sangre entera utilizado en la PRUEBA DE RETRACCIÓN DEL COÁGULO , después de medir la columna de suero volvemos a meter el coágulo en el tubo lo tapamos y lo colocamos al baño maría a 37ºC, poniendo en marcha el cronómetro. Observaremos a las 8, 24, 48, 72 horas para verificar la destrucción del coágulo. Resultados: En situaciones de normalidad, la lisis del coágulo no se produce antes de las 72 horas. Si la lisis aparece antes es que hay un exceso de actividad fibrinolítica. 11) TIEMPO DE LISIS DEL COÁGULO DE EUGLOBULINAS Técnica:
- El plasma citratado y pobre en plaquetas es diluido con agua destilada y acidificado con ácido acético para que precipiten las euglobulinas (fibrinógeno, plasminógeno y activadores del plasminógeno); sin embargo los inhibidores de la fibrinólisis no son euglobulinas, por lo que no precipitan. Las euglobulinas son proteínas que precipitan cuando el plasma es diluido en agua acidificada.
- Las proteínas euglobulinas del plasma que han precipitado son separadas por centrifugación, quitamos el sobrenadante del plasma y nos quedamos con el sedimento constituido por fibrinógeno, plasminógeno y activadores del plasminógeno. Disolvemos este precipitado con un tampón salino y se le añade trombina y calcio para forzar la formación del coágulo.
- Observamos la coagulación sacando el tubo del baño maría e inclinándolo; al formarse el coágulo ponemos en marcha el cronómetro y verificamos la lisis del coágulo cada 10 minutos hasta su completa disolución (no hay inhibidores de la fibrinólisis). Resultados: El tiempo de lisis del coágulo de euglobinas normal es igual o mayor de 2 horas. Si la lisis aparece antes es que hay un exceso de actividad fibrinolítica (exceso de activadores del plasminógeno).
12) DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN DEL
FIBRINÓGENO/FIBRINA. DETERMINACIÓN DEL DÍMERO D.
La plasmina actúa degradando tanto el fibrinógeno como la fibrina. Debido a su acción enzimática se forman una serie de fragmentos identificables inmunológicamente. La técnica se realiza en suero y requiere una extracción especial en tubo de vidrio con trombina (para asegurar una coagulación rápida) e inhibidores de la fibrinólisis. Se hace reaccionar el suero con partículas de látex recubiertas de anticuerpos anti-PDF. Como los PDF no son específicos, un resultado positivo (se produce aglutinación) no nos permite diferenciar entre fibrinólisis primaria (activación del plasminógeno, que actúa sobre el fibrinógeno, pero con ausencia de coagulación) y secundaria (coagulación intravascular diseminada y formación de coágulos en el interior de los vasos, por lo que la mayoría de los PDF procederían de la fibrina, no del fibrinógeno). La determinación del dímero D es específica de la formación de fibrina (indicaría que ha habido coagulación previa a la fibrinólisis). La identificación del dímero D se puede realizar mediante la técnica del ELISA o mediante Ac monoclonales recubiertos de látex para producir aglutinación. 6.5 ENFERMEDADES DE LA HEMOSTASIA, CONGÉNITAS Y ADQUIRIDAS. Nos centraremos en las siguientes enfermedades: hemorragias, trombosis y alteraciones de las plaquetas. 6.5.1 HEMORRAGIAS Es la salida de sangre de los vasos sanguíneos, por traumatismos o espontáneamente por alteración del sistema hemostático: A) Hemorragias superficiales: En los trastornos vasculares y plaquetarios se producen hemorragias superficiales bajo la piel, que podemos observar como manchas rojo-púrpura ocurren por problemas de la hemostasia 1ª. Como ejemplos tenemos: Petequias: son hemorragias capilares pequeñas como cabezas de alfiler. Púrpuras: cuando las petequias se agrupan; por ejemplo: púrpura senil, púrpura por infecciones y medicamentos que producen lesiones endoteliales. Equimosis: son áreas de sangre (“cardenal o hematoma”), manchas rojo-púrpura, que luego cambian a amarillo-verdosas. (Igual que hematoma, algo más pequeño) B) Hemorragias profundas: En los trastornos de la coagulación se producen hemorragias que tienden a ser profundas, ocurren por Problemas de la hemostasia 2ª. Hematomas: es una gran equimosis que infiltra el tejido subcutáneo e incluso los músculos, produciendo manchas moradas y deformaciones muy dolorosas. Hemartrosis: (Hema = sangre, artros = articulación), es la aparición de hemorragias en
