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IDENTIFICACIÓN GRAM +,: IDENTIFICACIÓN GRAM +,: IDENTIFICACIÓN GRAM +,: IDENTIFICACIÓN GRAM +,: IDENTIFICACIÓN GRAM +
Tipo: Resúmenes
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6.1.1 Pruebas bioquímicas.................................................................................................................. 4 6.1.2 Prueba de la catalasa................................................................................................................. 5 6.1.3 Prueba de la coagulasa.............................................................................................................. 5 6.1.4 Prueba de la termonucleasa...................................................................................................... 5 6.1.5 Prueba de resistencia de la bacitracina..................................................................................... 6 6.1.6 Prueba de resistencia de la novobiocina................................................................................... 7 6.2.1 Staphylococcus.......................................................................................................................... 7 6.2.2 Streptococcus........................................................................................................................... 8 6.2.3 Enterococcus............................................................................................................................. 8 6.3.1 Agar sangre........................................................................................................................ 8 6.3.2 Agar chocolate................................................................................................................. 10 6.3.3 Agar sal y manitol............................................................................................................ 11 6.3.4 Agar antibiótico............................................................................................................... 13 6.3.5 Agar DNA......................................................................................................................... 13
En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "Gram positivas". Esta característica Química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de pos bacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas. La envoltura celular delas bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante
El primer paso para la identificación de una especie bacteriana es el estudio de su morfología microscópica y macroscópica. Luego se deben estudiar sus requerimientos atmosféricos y nutricionales. Por último se procede a la realización de pruebas bioquímicas que permitirán llegar a la identificación de género y especie bacteriana, el género Staphylococcus es no exigente en cuanto a sus requerimientos nutricionales, por lo tanto crece en medios de cultivos pobres, y para seguir adquiriendo conocimiento se realizaran diversas pruebas bioquímicas para una buena identificación de Gram positivos.
Aprender las diferentes pruebas bioquímicas que existen para la identificación de Gram positivos y su aislamiento.
Estudiar las características macroscópicas, microscópicas y cambios producidos por el microorganismo en los diferentes medios utilizados. Conocer las pruebas bioquímicas de laboratorio utilizadas para la identificación de especies de cocos Gram-positivos. Identificar género y especie de una cepa bacteriana que es totalmente desconocida antes de aplicar las pruebas.
6.1.1 Pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas en microbiología son un conjunto de ensayos químicos que se realizan a los microorganismos presentes en una muestra con la finalidad de identificarlos; estos microorganismos suelen ser bacterias. Hay un gran número de pruebas bioquímicas a disposición de un microbiólogo.
Sin embargo, la elección de estas pruebas se basa en hallazgos preliminares, como el patrón de tinción de Gram y los caracteres de crecimiento, que permiten
asignar la bacteria a una categoría particular. Las pruebas bioquímicas se basan principalmente en las propiedades metabólicas de cada tipo de bacteria.
No todas las bacterias poseen las mismas propiedades, por lo cual se investiga si estas poseen alguna enzima en particular mediante la adición del sustrato y esperando a que ocurra la reacción. Comúnmente esta determinación viene dada por un cambio de color o de pH en el medio de cultivo. Con frecuencia se requieren menos de 15 pruebas bioquímicas para la identificación confiable de una bacteria hasta el nivel de especie. Realizar más pruebas bioquímicas puede aumentar la confianza en la identificación.
6.1.2 Prueba de la catalasa La prueba de catalasa es una prueba para demostrar la presencia de enzima catalasa mediante la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Se agrega una pequeña cantidad de bacterias a una gota de peróxido de hidrógeno (3 %) en el portaobjetos.
La prueba de catalasa es una prueba simple utilizada por los microbiólogos para ayudar a identificar especies de bacterias y para determinar la capacidad de algunos microbios para descomponer el peróxido de hidrógeno mediante la producción de la enzima catalasa.
Si se observan burbujas de oxígeno significa que la bacteria posee la enzima catalasa, porque esta cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Se dice entonces que el organismo es catalasa positivo (por ejemplo: Staphylococcus aureus ).
6.1.3 Prueba de la coagulasa La coagulasa es una enzima que ayuda a coagular el plasma sanguíneo. Esta prueba se realiza en especies bacterias Gram positivas y catalasa positivas para identificar a Staphylococcus aureus (coagulasa positiva). De hecho, la coagulasa es un factor de virulencia de esta especie bacteriana.
La formación de coágulos alrededor de una infección causada por esta bacteria probablemente la protege de la fagocitosis. Esta prueba es muy útil cuando se desea diferenciar a Staphylococcus aureus de otras especies de Staphylococcus que son coagulasa negativas.
6.1.4 Prueba de la termonucleasa Se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa), es una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus, así como de la posible formación
Sensible: presencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco. Informar estreptococos beta hemolítico presuntivamente del grupo A por la prueba de bacitracina.
Resistente: ausencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco. Informar: estreptococos beta hemolíticos que presuntivamente no pertenecen al grupo A por la prueba de bacitracina.
6.1.6 Prueba de resistencia de la novobiocina. Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y resistentes a la novobiocina. Entre las especies resistentes S. saprophyticus es el único que suele aislarse en muestras humanas como causante de infecciones urinarias. Por lo tanto, la evaluación de los estafilococos coagulasa negativos a través de esta prueba proporciona una identificación presuntiva de esta especie. Procedimiento:
1.-Prepare una suspensión en solución salina del microorganismo por identificar, la suspensión debe tener una turbidez equivalente a 0.5 McFarland.
2.-Con un hisopo estéril, distribuya parte de la suspensión sobre el agar Mueller Hinton.
3.-Deje secar y coloque un disco de novobiocina sobre la zona sembrada. 4.-Incube aeróbicamente durante 18 a 24 horas a 35ºC.
6.2.1 Staphylococcus Los estafilococos son células esféricas Gram positivas dispuestas en grupos semejantes a racimos de uvas en medios sólidos o en pares, cadenas o tétradas, en medios líquidos. Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos: blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemólisis. Son catalasa positiva, inmóviles, no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o anaerobios facultativos.
6.2.2 Streptococcus Los estreptococos son células esféricas u ovaladas Gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas o largas. Son más exigentes que los estafilococos, no crecen en medios simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Producen diferentes tipos de hemólisis, característica que permite clasificarlos en beta hemolíticos, alfa hemolíticos o no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa, inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos.
6.2.3 Enterococcus Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son células esféricas Gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los estreptococos, requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son capaces de desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%). Pueden producir hemólisis de tipo alfa, beta o ser no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa, inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos.
6.3.1 Agar sangre Medio de cultivo enriquecido que permite el desarrollo de todo tipo de bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, diferencial (por el tipo de hemolísis), no selectivo.
La Placa Agar Sangre está preparada con medio de cultivo en polvo de nombre Agar Base Sangre, tiene como ingredientes agar-agar, infusión músculo de corazón, peptona, cloruro de sodio; el color del medio es ámbar claro una vez se halla agregado sangre un 5% o 10 % del volumen total , su color cambia a rojo cereza.
Tener presente que debe plaquearse de inmediato después de agregar la sangre ya que la temperatura baja y el agar se solidifica bajo los 40ª C. La totalidad del plaqueado en lo posible va a control de esterilización a 37º C por 24 hr. Una muestra, en placa de agar sangre, se siembra directamente sobre la superficie sólida del medio de cultivo. Siembra en superficie por inoculo diluido en estrías zig-zag, o por hisopado para depositar inoculo y posterior dilución en siembra en abanico. Se incuba por 24 hrs. a 37ºC. El objetivo de la siembra es el cultivo de muestras diversas para obtener crecimiento bacteriano en colonias aisladas ( cultivo y aislamiento), además del estudio de reacciones hemolíticas en una amplia variedad de microorganismos.
6.3.2 Agar chocolate El agar chocolate es un medio de cultivo sólido, enriquecido, no selectivo y no diferencial. Es utilizado principalmente para el aislamiento de microorganismos exigentes desde el punto de vista nutricional, aunque en él pueden crecer cualquier tipo de bacterias.
Es por ello que su utilidad aumenta especialmente en el sembrado de muestras que normalmente son estériles, como LCR y líquido articular. Aunque también se incluye dentro de los medios escogidos para siembras de muestras polimicrobianas, pero en estos casos es necesario la adición de antibióticos que inhiban la flora concomitante.
Este medio posee un color marrón característico muy parecido al chocolate, de allí su nombre. La preparación es muy similar a la del agar sangre, solo que en este caso la sangre debe ser calentada con la finalidad de que los glóbulos rojos se rompan.
Su preparación, al igual que el agar sangre, es muy delicada, pues es fácilmente contaminable. Por ello muchos laboratorios prefieren adquirir este medio ya preparado por casas comerciales que garantizan su calidad.
Imagen 2. Agar Chocolate con crecimiento bacteriano
Este medio está compuesto por una base de agar rico en nutrientes y sangre calentada. La hemólisis de los glóbulos rojos proporcionan al medio factor X (hemina) y factor V (NAD), necesarios para el crecimiento de algunos microorganismos, como el género Haemophilus. También es muy útil para el aislamiento de Neisserias sp.
Al igual que el agar sangre, se puede usar como agar base diferentes medios dependiendo de la necesidad. Entre los medios utilizados se encuentran infusión cerebro corazón y agar soja tripticasa, aunque los más recomendados son agar Columbia, Müeller Hinton, agar GC y agar Thayer Martin.
Algunas variantes de agar chocolate incluyen un suplemento enriquecido disponible comercialmente llamado Isovitalex o Polivitex.
Estos suplementos contienen vitamina B12, L-glutamina, adenina, clorhidrato de guanina, ácido p-aminobenzoico, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), pirofosfato de tiamina, nitrato férrico, clorhidrato de tiamina, hidrocloruro de cisteína, L-cistina y glucosa.
Es importante resaltar que el agar chocolate es más enriquecido que el agar sangre, pero no permite la observación de los patrones de hemólisis.
6.3.3 Agar sal y manitol El agar sal y manitol o manitol salado es un medio de cultivo sólido, selectivo y diferencial. Fue creado por Chapman para el aislamiento de cocos Gram positivos patógenos, especialmente Staphylococcus aureus.
Sin embargo, también es útil para aislar Staphylococus epidermidis, que en ocasiones puede estar presente como patógeno oportunista, y Staphylococcus
Algunos Enterococcus son capaces de crecer en este medio, así como también ciertos bacilos Gram positivos formadores de esporas. Este medio es de gran utilidad en el análisis de muestras clínicas, pero también se usa en el estudio microbiológico de alimentos y en el control de calidad de productos industriales, como cosméticos, medicinas, entre otros. El agar manitol salado está compuesto por extractos y peptonas de carne bovina, tripteína, manitol, cloruro de sodio, rojo de fenol y agar.
En este sentido, uno de sus usos más frecuentes es en el análisis microbiológico de muestras de exudados faríngeos y secreción nasal, especialmente para detectar portadores asintomáticos de S. aureus.
Algunos países han implementado este análisis como requisito obligatorio para personas que desean trabajar como expendedores de alimentos.
Este control previene que se contraten personas portadoras de S. aureus, evitándose así que haya intoxicaciones alimentarias masivas, debido al consumo de alimentos contaminados con la enterotoxina estafilocócica.
6.3.4 Agar antibiótico
6.3.5 Agar DNA COMPOSICIÓN
Triptosa 20,0 g
Acido desoxirribonucleico 2,0 g Cloruro sódico 5,0 g
Agar agar 15,0 g
(Fórmula por litro)
pH final: 7,3 ± 0,
CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO
Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…)
DESHIDRATADO: Polvo fino, Beige
PREPARADO: Estéril, Ambar (azul si se añade azul de toluidina)
Imagen 4. Frasco del agar antibiotico
Imagen 5. Ejemplo de agar DNA
CONTROL DE CRECIMIENTO 18-48 h a 37°C aproximadamente, y tras añadir HCl 1N:
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN
Fundir el frasco o el tubo con azul de toluidina, para elaborar placas, agitando para eliminar las dos fases (oxidada y reducida) si las hay, o bien partir del medio en polvo tras esterilizarlo. Sembrar en superficie de la placa o del tubo inclinado, en estría, una dilución de la colonia sospechosa. Incubar 4 18 horas a 37 ºC aprox. Añadir después Ácido Clorhídrico 1 N sobre las colonias (en el medio sin azul de toluidina). Los estafilococos con actividad DNA ásica aparecen como colonias rodeadas de un halo claro (lísis del ADN).
En el medio con azul de toluidina, las colonias positivas aparecerán rodeadas de un halo rosado, al menos 30 minutos después (ver foto arriba).
El usuario es el responsable de la eliminación de los microorganismos según la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar a la basura.
Cajas Petri Guantes Tubos de ensaye
destilada.
homogeneizar y vaciar en caja Petri estéril.
Se deben ver las indicaciones de preparación del agar base que se va a utilizar. Las mismas se encuentran al reverso del envase del medio deshidratado. Generalmente describen cuánto se debe pesar para preparar un litro de medio de cultivo. En el laboratorio se puede preparar la cantidad exacta necesaria, puede ser más o menos de un litro. Cálculos Se realiza una regla de tres para calcular cuánto se debe pesar para preparar el volumen que se desea. Pesar y disolver Se procede a pesar la cantidad necesaria y se coloca en una fiola con el agua. Se calienta a fuego moderado y se va mezclando suavemente con movimientos rotatorios hasta disolver completamente el medio deshidratado, dejando hervir por 1 minuto. Esterilizar Se introduce la fiola en el autoclave para esterilizar el medio a 121°C por 20 minutos. Agregado de la sangre Al salir del autoclave se deja reposar hasta que la temperatura del medio esté aproximadamente entre 56 a 70°C para colocar la sangre y mezclar hasta que el medio se torne color marrón. Si se va a agregar suplementos, este es el momento de hacerlo. Posteriormente mezclar y servir 20 ml a cada placa de Petri estéril. Todo el procedimiento se debe realizar en una campana de flujo laminar o alrededor del mechero de Bunsen. Dejar reposar hasta que se solidifiquen y guardar de forma invertida en nevera.
Para preparar un litro de agar manitol salado se pesan 111 gr del medio deshidratado de la casa comercial de preferencia y se disuelven en 1000 ml de agua destilada, utilizando una fiola. Se aplica calor removiendo frecuentemente el medio para mejorar el proceso de disolución. Se deja hervir durante un minuto. Se coloca la fiola en el autoclave a 121°C por 15 minutos. Terminado el tiempo, se saca la fiola del autoclave, se deja reposar y se sirve entre 15 a 20 ml sobre placas de Petri estériles cuando la temperatura sea aproximadamente de 50 a 55°C. Se deja solidificar, ordenando de forma invertida en plaqueros y guardando en nevera hasta su uso. Antes de sembrar una muestra, se debe esperar a que la placa tome la temperatura del ambiente. Se siembran las placas por estriamiento o por sembrado en superficie con espátula de drigalski. El pH final del medio preparado debe quedar en 7,4 ± 0, El color del medio deshidratado es beige claro y el color del medio preparado es rojo naranja.
Calentar agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50ºC y verter en placas de Petri. Las placas preparadas deben almacenarse entre 8-15 ºC. El color del medio preparado es ámbar ligeramente opalescente. El medio deshidratado debe ser homogéneo, libre de floculos y de color beige claro. Si hay algún cambio físico no utilizar el medio
Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3%
https://es.scribd.com/document/252439746/MicroBiologia-Medio-de-Cultivo- Agar-Sangre http://www.medioscultivo.com/dna-ase-test-agar/ María Concepción Casado González. (2012). Medios de cultivo en un laboratorio de microbiología. Sitio web: https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en- un-laboratorio-de-microbiologc3ada.pdf https://prezi.com/0d55et6icr8s/agar-sangre-agar-chocolate/ Laboratorios Britania. Manitol salado agar. 2015. Disponible en: britanialab.com https://prezi.com/hsm4uy6g4vyg/pruebas-bioquimicas-coagulasa-y- citocromooxidasa/ https://quimicoclinico.wordpress.com/2008/03/09/prueba-bioquimica- oxidasa-coagulasa/
