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Informe de espectrofotómetria, balance sobre cantidad de luz.
Tipo: Monografías, Ensayos
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Sánchez Heras, Melania Ghisel MEDICINA HUMANA 100% Ticona Cárdenas, Leny Víctor MEDICINA HUMANA 100% Valdivia Juño, Ximena Jazmín ENFERMERIA 100% Gomez Gonzalez, Jose Alonso MEDICINA HUMANA 100%
La espectrometría es una técnica analítica, que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. En los métodos espectrofotométricos se mide la intensidad de luz (energía radiante o radiación electromagnética) para determinar la concentración del analito presente en una muestra. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración, para llevar a cabo este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Podemos dividir los métodos espectrofotométricos en dos grandes grupos según qué es lo que medimos para cuantificar el analito: 1.2 Espectrofotometría de absorción: En estos casos se mide la Absorbancia (A)del analito, esto es la luz absorbida por el analito, y esta magnitud se relaciona conla concentración (C). A ∞ c (la absorbancia es directamente proporcional a la concentración) 1.3 Espectrofotometría de emisión: En este caso se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, la señal emitida se relaciona con la concentración dela especie que emite luz cuando vuelve desde un estado excitado (estado de mayor energía al que llegó absorbiendo energía) a su estado basal (estado de menor energía posible tal como se encuentra naturalmente). Señal emisión ∞ C (la emisión es directamente proporcional a la concentración) Figura 1 - Representación gráfica de una onda electromagnética en tres dimensiones. La flecha negra representa la dirección de propagación (dirección de avance de la onda). La absorción A de una solución se define mediante la ecuación: A = log 1/T = - log T = - log I/ Io
El factor de calibración se refiere a la relación que existe entre la concentración del estándar y su respectiva absorbancia. Este factor se puede obtener con la siguiente fórmula: Para encontrar la concentración de una sustancia problema se multiplica el factor de calibración por la absorbancia del problema. Esto depende del experimento que se haga. Por otro lado, lo que se quiere llevar a cabo en esta práctica es construir la curva de calibración que es una representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito, para ello la calibración debe incluir un modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de dicha curva y, en consecuencia, la capacidad del método analítico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a las concentraciones. Es por ello que se utilizaron concentraciones conocidas de una cierta sustancia llamadas disolución estándar, estas son esenciales ya que nos permitirá construir la recta de calibrado el cual deberá ser preparado de forma independiente. Sin embargo, es importante tener en cuenta que se requerirán más de dos puntos para así de esta manera tener una curva más confiable.
2. OBJETIVOS: Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro. Aplicar la Ley de Lambert y Beer en el empleo del espectrofotómetro Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de metileno.
● 01 solución de azul de metileno 1 mg/dL frasco 100mL ● 01 espectrofotómetro ● 01 micropipeta 100 - 1000 μL y/o de 5 - 50μL ● 12 cubetas para espectrofotometría
● 02 pipeta graduada 10mL
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL N° 01 Adicionar 4 mL de agua Adicionar 1 mL de solución de azul de metileno 1 mg/dL Mezclar Realizar lecturas (realizar tablas para colocar datos obtenidos a las diferentes longitudes de ondas. Realizar una gráfica en el papel milimetrado, en donde en el eje de las ordenadas se colocan las Abs (eje Y) y en el eje de las abscisas las longitudes de ondas (eje X). Determinar el pico con máxima absorción en función de las longitudes de ondas 4.1 EXPERIMENTO N° 02: CURVA DE CALIBRACIÓN 1. Colocamos los 5 tubos en la gradilla. 2. Agregamos agua destilada con la ayuda de la micropipeta para añadirlos a los tubos de ensayo, considerando las cantidades indicadas en la Figura N° 01. 3. Colocamos las cantidades de azul de metileno tal como se muestra en la Figura N° 01. Figura N° 01: Proporciones del azul de metileno y agua destilada
Para el tubo 4: C1xV1=C2xV 1mg/dL x 3mL = C2 x 5mL C2= 0.6mg/dL Para el tubo 5: C1xV1=C2xV 1mg/dL x 4mL = C2 x 5mL C2= 0.8mg/dL Curva de Calibración de Azul de Metileno y ecuación de la recta Cálculo de los valores de otros tipos de concentración (F.C. - E.R.)
Para el tubo 1: F.C. = Concentración estándar (mg/dL) / Absorbancia F.C. = 0.1mg/dL/ 0. F.C. = 0. Para el tubo 2: F.C. = Concentración estándar (mg/dL) / Absorbancia F.C. = 0.2mg/dL/ 0. F.C. = 0. Para el tubo 3: F.C. = Concentración estándar (mg/dL) / Absorbancia F.C. = 0.4mg/dL/ 1. F.C. = 0. Para el tubo 4: F.C. = Concentración estándar (mg/dL) / Absorbancia F.C. = 0.6mg/dL/ 1. F.C. = 0. Para el tubo 5: F.C. = Concentración estándar (mg/dL) / Absorbancia F.C. = 0.8mg/dL/ 1. F.C. = 0. 5.5 CÁLCULO DEL PROMEDIO DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN (PROMEDIO F.C.) Promedio F.C. = (F.C.1 + F.C.2 + F.C.3 + F.C.4 + F.C.5) Promedio F.C. = 0.
Se recomienda realizar una adecuada medida de la sustancia que se requiere medir, en este caso fue el azul de metileno, ya que en nuestra práctica de laboratorio obtuvimos resultados que no concuerdan con la teoría, sin embargo; en esta práctica se usó los datos que obtuvimos al realizar la práctica en el laboratorio. Se debe calibrar el espectrofotómetro con la finalidad de evitar errores en la lectura de la absorbancia de cada muestra, para ello se debe colocar en la primera cavidad una cubeta con agua destilada y en el resto las cubetas con las diferentes muestras. Antes de introducir las cubetas en las cavidades del espectrofotómetro se requiere limpiar estas con un papel limpio mientras se sujetan desde la parte más superior cuidadosamente. El conocimiento sobre el desarrollo de curvas de pendientes en el programa Excel es necesario para poder realizar gráficos en base a los resultados de ambos experimentos, dado que este programa facilita dicho trabajo.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abril Díaz N, Antonio Bárcena Ruiz J, Fernández E, Cejudo AG, Novo JJ, Peinado JP, et al. 8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas [Internet]. Uco.es. [citado el 8 de abril de 202 3 ]. Disponible en: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol- mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf Salazar, J., Salazar, Y. y Sotelo, J. (2023). Manual de prácticas de Bioquímica. Universidad Científica del Sur Baeza, A. (2017). Precisión en espectrofotometría. Argentina: Facultad de Química UNAM. Recuperado de https://es.scribd.com/document/267704279/Documento-de-Apoyo-Prec Muñoz, A., Adame, R., Limón, P., & Sandova, I. (2016). Vista de Determinación del valor de sorción de azul de metileno para fillers mediante espectrofotometría visible. Ufro.cl. https://revistas.ufro.cl/ojs/index.php/rioc/article/view/1993/ Métodos espectrofotométricos-Teoría y Práctica [Internet]. Edu.ar. [citado el 8 de abril de 202 3 ]. Disponible en: https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginfile.php/43546/mod_resource/content/ 3/Espectrofotometr%C3%ADa%202019%20versi%C3%B3n%20final.pdf Harris, D. (2007) Análisis Químico Cuantitativo. 3a ed. Capítulo 18. Ed. Reverté. Recuperado de https://www.academia.edu/41946066/Analisis_quimico_cuantitativo_3a_ed_no _Daniel_Harris
