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manual practica de laboratorio
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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ReacciÛn del Acido GlioxÌlico para TriptÛfano: Grupo indÛlico del triptÛfano reacciona con ·cido glioxÌlico en presencia del ·cido sulf˙rico concentrado dando un color p˙rpura.
ReacciÛn de Sakaguchi: El ˙nico amino·cido que contiene grupos guanidinos es la Arginina; esta reacciona con · naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo o hipoclorito en un medio alcalino, dando un color rojo.
MATERIALES Y REACTIVOS 10 Tubos de ensayo 1 Gradilla 1 Pinza para tubos de ensayo. 3 Pipetas de 1, 5 y 10 mL
1 Gotero. 1 Estufa 1 Beaker de 500mls Papel indicador
Soluciones al 0.5% de amino·cidos: Glicina, Tirosina, TriptÛfano, Fenilalanina, Arginina.
Ninhidrina: DisoluciÛn al 0.2% en alcohol o acetona.
HNO3 al 10% NaOH al 20% o amoniaco. Fenol, disoluciÛn al 0.1% Reactivo de MillÛn. Agua de bromo
·- Naftol: 0.2% Nitrito de sodio. Acido glioxÌlico Acido sulf˙rico.
coloraciÛn de amarillo en soluciÛn ·cida a naranja brillante en soluciÛn ·lcali constituye un resultado positivo.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1- Escriba la reacciÛn para cada prueba realizada. 2- De acuerdo con las pruebas realizadas en esta pr·ctica proponga una clasificaciÛn para los amino·cidos. 3- Identifique los grupos quÌmicos que caracterizan a los amino·cidos. 4- Explique como se encuentran estructuralmente los amino·cidos en el plasma sanguÌneo o lÌquido intracelular cuyo pH es de 7.4 y 7.1 respectivamente. 5- Cuales son las explicaciones pr·cticas de las pruebas realizadas.
BIBLIOGRAFÕA
PLUMER, D.T. IntroducciÛn a la bioquÌmica pr·ctica. MÈxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. BioquÌmica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. GuÌas de laboratorio de BioquÌmica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.
Reactivo de Biuret ¡cido PÌcrico saturado ¡cido AcÈtico 10% Buffer pH 4. Soluciones: Alb˙mina, caseÌna y gelatina
Acido t·nico al 10% Sulfato c˙prico al 2% Ferrocianuro de potasio acuoso. Acetato de plomo al 2 % Cloruro de mercurio al 2%
PROCEDIMIENTO:
1. PreparaciÛn de soluciones de proteÌnas. SoluciÛn de alb˙mina:
Se prepara mezclando lentamente una clara de huevo con aproximadamente 100ml de agua, la mezcla se filtra sobre gasa para eliminar la mayor parte de la espuma. CaseÌna : se toma 1 g de caseÌna y se le agrega lentamente 100 ml de NaOH 0.5 M. Con agitaciÛn continua, reposar la mezcla durante 5 min y de haber espuma se filtra sobre gasa. Gelatina : se disuelve 1 g de gelatina en 100ml de soluciÛn salina al 1 %.
2. DeterminaciÛn del punto de coagulaciÛn de una proteÌna y demostraciÛn de la desnaturalizaciÛn: Rotule 2 tubos de ensayo grandes con las letras A y B, agregue a cada uno 4.5 ml de soluciÛn de alb˙mina de huevo. Agregue 0.5 ml de Buffer pH 4.7 al tubo A. Coloque los tubos en un baÒo de MarÌa y aumente la temperatura en forma gradual anotando cualquier cambio en los tubos y la temperatura a que ocurre. Contin˙e calentando hasta la ebulliciÛn del agua y prolongue el calentamiento por 5 minutos mas, separe el tubo A, dÈjelo enfriar y agregue 4 ml de buffer pH 4.7, llÈvelos al baÒo de agua caliente hasta ebulliciÛn. Determine si el precipitado que se ha formado, redisuelve despuÈs de enfriar o diluir con agua. El punto isoelÈctrico de la alb˙mina de huevo esta alrededor de pH 4.7; aquÌ la coagulaciÛn por calentamiento ocurre mas r·pidamente a pH diferente; la desnaturalizaciÛn ocurre primero despuÈs de calentar; entonces se presenta floculaciÛn, cuando el punto isoelectrico se restablece, el calentamiento da origen a que la floculaciÛn se transforme en coagulaciÛn. 3. PrecipitaciÛn de ProteÌnas a) PrecipitaciÛn con sales met·licas: En una serie de tres tubos se adiciona en cada uno 1 ml de soluciÛn ALBUMINA de huevo; adicione a uno 4 gotas de soluciÛn de cloruro merc˙rico al 2%, al segundo 4 gotas de una soluciÛn de acetato de plomo al 2%, mas 3 gotas de acido acÈtico y al tercero 4 gotas de sulfato c˙prico al 2%. , obsÈrvese cuidadosamente la formaciÛn o no de precipitados. Explique. Repetir el procedimiento con soluciÛn de caseÌna y luego por soluciÛn de gelatina. b) PrecipitaciÛn con reactivos acÌdicos: En tres tubos de ensayo coloque en cada uno 1.5 ml de soluciÛn de caseÌna. AÒ·dale al primero 3 gotas de una soluciÛn acuosa saturada de ·cido pÌcrico, al segundo igual cantidad de una soluciÛn de ·cido t·nico al
10% y al tercero 3 gotas de una soluciÛn acuosa de ferrocianuro de potasio y 1 gota de ·cido acÈtico al 10%. Observe lo que ocurre. Repetir el procedimiento remplazando la soluciÛn de caseÌna por soluciÛn de alb˙mina.
4. Reacciones colorida: Las proteÌnas pueden formar compuestos coloreados al reaccionar con determinados reactivos, entre los que se encuentra el reactivo de Biuret. ReacciÛn de Biuret: Es caracterÌstica del enlace peptÌdico. A 1.5 ml de la soluciÛn proteica, aÒada 1 ml de reactivo de Biuret. Deje reposar la mezcla y observe lo que ocurre.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
BIBLIOGRAFÕA:
PLUMER, D.T. IntroducciÛn a la bioquÌmica pr·ctica. MÈxico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. BioquÌmica F.
L”PEZ, E y ANZOLA, C. GuÌas de laboratorio de BioquÌmica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogot·.
Esp·tula Mortero con mano
Gradilla
PerÛxido de HidrÛgeno (H 2 O 2 ) al 3% BiÛxido de Manganeso (MnO 2 ) Cianuro de Sodio (NaCN) Papas como fuente de catalasa (traer)
Sangre como fuente de catalasa (extraerse) Hielo (traer de la casa) Gasa (traer) Cuchilla (traer de la casa)
1. Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las siguientes sustancias: Tubo N∫1 1ml de sangre al 10% Tubo N∫2: 1 ml de extracto de papa. Tubo N™3: Una pequeÒa porciÛn de MnO 2 2. Agregar a cada uno de los tubos 2ml de H 2 O 2 al 3%. Observar la intensidad de la reacciÛn por el burbujeo del oxÌgeno y la liberaciÛn de calor. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalÌtica con base en este par·metro. 3. Prepare 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y ColÛquelos en un baÒo con agua a ebulliciÛn durante diez minutos, retirarlos y dejar en reposo dentro de un baÒo de agua a temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2ml de H 2 O 2 al 3%. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalÌtica con base a este par·metro. 4. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y colÛquelos en un baÒo de hielo durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2 ml de H 2 O 2 al 3%. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalÌtica con base en este par·metro. 5. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1, adicione a cada tubo uno 6 gotas de NaCN y dejar en reposo durante 5 min, luego adicione 2ml de H 2 O 2 al 3% a cada tubo. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalÌtica con base en este par·metro.
BIBLIOGRAFÕA: PLUMER, D.T. IntroducciÛn a la bioquÌmica pr·ctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. BioquÌmica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. GuÌas de laboratorio de BioquÌmica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.
PRUEBA PARA SACAROSA. La sacarosa es el ˙nico disac·rido com˙n no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre. Esta es hidrolizada en soluciÛn ·cida y luego se ensayan la glucosa y la fructosa resultante. PRUEBA PARA POLISAC¡RIDOS. Los polisac·ridos contienen sÛlo un grupo reductor por varios cientos o m·s residuos, asÌ que en la pr·ctica, no son reductores. La hidrÛlisis ·cida libera los monosac·ridos constituyentes que luego son ensayados.
MATERIALES Y REACTIVOS
Estufa o calentador
Pipetas de 5 y de 10ml
Beakers de 100 y 400ml
10 tubos de ensayo
Pinza para tubos de ensayo Gradilla Gotero Papel tornasol
Soluciones de: glucosa, galactosa, ribosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, fructosa, almidÛn, leche (traer de la casa)
SoluciÛn de yodo.
Reactivo de Molish
Acido sulf˙rico concentrado
Reactivo de Benedict
Reactivo de Barfoed
Reactivo de Bial Reactivo de Selliwanoff Alcohol Amilico Acido clorhÌdrico concentrado HidrÛxido de sodio 1M
Prueba de Molish: Agregue 5 gotas del reactivo de Molish a 1 ml de una muestra que contenga carbohidratos (Leche). AÒada cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de ·cido sulf˙rico concentrado, hasta que se formen dos capas. Observe cualquier cambio de color en la interfase de los dos lÌquidos. Prueba de Benedict: Tome 3 tubos de ensayo; agregue al primero 0.5 ml de soluciÛn de lactosa, al segundo 0.5 ml de soluciÛn de glucosa y al tercero 0.5 ml de soluciÛn de sacarosa. Adicione 0.5 ml del reactivo de Benedict a cada tubo y colÛquelos en un baÒo de agua hirviendo por 3 min. La formaciÛn de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de az˙car reductor.
Prueba de Barfoed: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5 ml de soluciÛn de galactosa, al segundo 0.5 ml de soluciÛn de ribosa y al tercero 0.5 ml soluciÛn de almidÛn. Adicione 1 ml del reactivo de Barfoed a cada tubo, hierva por 2 min y deje reposar. La formaciÛn de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de monosac·ridos. Prueba Bial : Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de soluciÛn de ribosa, al segundo 0.5ml de soluciÛn de arabinosa y al tercero 0.5ml de soluciÛn de almidÛn. Adicione 0.5 ml del reactivo de Bial a cada tubo y caliente hasta que empiece a hervir, dejar enfriar y luego agregue 1 ml de alcohol amilico y agite, la apariciÛn de una coloraciÛn azul verdosa es prueba positiva es prueba positiva para pentosas. Prueba de Salliwanoff: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de soluciÛn de fructosa, al segundo 0.5ml de soluciÛn de arabinosa y al tercero 0.5ml de soluciÛn de glucosa. Adicione 1ml del reactivo de Selliwanoff a cada tubo. Caliente durante 1 min en un baÒo de agua hirviendo, la apariciÛn de un color rojo o rosado es prueba positiva para cetosas. Prueba para sacarosa: A 2.5 ml de una soluciÛn de sacarosa agregue 3 gotas de ·cido clorhÌdrico concentrado, caliente durante 5 minutos en un baÒo de agua hirviendo, enfriÈ y agregue HidrÛxido de Sodio 1M hasta que la soluciÛn sea neutra o ligeramente alcalina (prueba con papel tornasol), divida la soluciÛn hidrolizada en dos porciones y realice por separado las pruebas de Benedict y Selliwanoff.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
Determinar la solubilidad de los lÌpidos en solventes org·nicos. Realizar la reacciÛn de saponificaciÛn y determinar algunas propiedades de los jabones. Comparar el grado de instauraciÛn de algunos lÌpidos.
TEORÕA RELACIONADA
Los lÌpidos, cuyo nombre deriva del griego lipos: (grasa). Son molÈculas de estructura variada cuya propiedad fundamental que ha permitido su aislamiento y caracterizaciÛn es la de ser insolubles en agua y solubles en disolventes org·nicos tales como el benceno, cloroformo, Èter, etc. Constituyen una excepciÛn a esta regla las esfingomielinas que no son solubles en Èter y los fosfolÌpidos que no son solubles en acetona. Todos los mÈtodos de obtenciÛn de lÌpidos utilizan en gran medida estos criterios de solubilidad. Los lÌpidos m·s comunes y abundantes en los alimentos de origen vegetal y animal son los aceites y las grasas, los cuales consumidos en la dieta y conjuntamente con los sintetizados endÛgenamente tienen m˙ltiples funciones en el organismo: FunciÛn energÈtica o de reserva: Las grasas neutras (Triacilgliceroles) se almacenan en los adipositos y suministran calorÌas f·cilmente utilizables en perÌodos de escasez. El panÌculo adiposo subcut·neo es asÌ mismo un eficaz protector contra el frÌo externo. Funciones Estructurales: Todas las membranas biolÛgicas est·n formadas por fosfolÌpidos, glicolÌpidos y algunas veces esteroides estructurados en bicapas. Funciones catalÌticas: Algunos lÌpidos act˙an en pequeÒas cantidades como activadores o reguladores del metabolismo; por ejemplo, las vitaminas liposolubles, las hormonas esteroideas o las prostaglandinas.
MATERIALES Y REACTIVOS 10 tubos de ensayo 2 gradillas Pipetas de 5 y 10 ml Calentador
Capsula de porcelana 1 vaso de 250 ml Pinza para tubo de ensayo Pinza para crisol
Esp·tula Gotero
Escamas de jabÛn (traer de la casa) Aceite vegetal (traer de la casa) Etanol al 95% …ter etÌlico Cloroformo Acetona Benceno Cloruro de calcio (50g/L)
Cloruro de magnesio (50g/L) Acetato de Plomo (50 g/L) Cloruro de sodio SoluciÛn de yodo Acido sulf˙rico concentrado HidrÛxido de sodio al 10% Acido oleico Acido este·rico.
PROCEDIMIENTO
1. Solubilidad Numere 7 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, luego agregue a cada tubo de manera diferente, 1 ml de cada una de las siguientes sustancias: Agua destilada, etanol, etanol caliente, benceno, cloroformo, Èter etÌlico y acetona. Agite cada tubo. Deje en la gradilla por 2 min y observe los resultados. a. øCuales son los mejores disolventes para las grasas? b. øCuales no disuelven las grasas? c. øComo explican ustedes los resultados? 2. EmulsificaciÛn En dos tubos de ensayo coloque 2 ml de aceite vegetal. AÒada a cada uno 2 ml de agua destilada. A una de los tubos agregue algunas escamas de jabÛn. Agite bien ambos tubos. Observe lo que ocurre. a. CÛmo se denomina la mezcla formada? b. CÛmo esta constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo en la gradilla y obsÈrvelos varias veces durante quince minutos. c. CÛmo es la estabilidad de las mezclas en los dos tubos? d. Explique los resultados?
BIBLIOGRAFÕA PLUMER, D.T. IntroducciÛn a la bioquÌmica pr·ctica. Mexico. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A. CONN, E y Stumpf, P.K. BioquÌmica F. LOPEZ, E y ANZOLA, C. GuÌas de laboratorio de BioquÌmica. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota
Separar algunos constituyentes de la leche Identificar la presencia de vitaminas y minerales en la leche Reconocer la vitamina A presente en la mantequilla.
TEORÕA RELACIONADA
Algunas enzimas requieren para su funciÛn la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la cat·lisis. Estas sustancias se llaman en general cofactores. Los cofactores de naturaleza org·nica se suelen denominar coenzimas. Hay coenzimas que no pueden ser sintetizadas integralmente en el organismo, sino que algunos de sus componentes o precursores debe ser incorporado a partir de la dieta. Entre los precursores exÛgenos necesarios para el normal desarrollo, crecimiento y reproducciÛn de una gran variedad de seres vivos se encuentra un grupo de biomolÈculas org·nicas llamadas vitaminas, adem·s de otras sustancias de car·cter inorg·nico frecuentemente conocidas como minerales.
MATERIALES Y REACTIVOS Vaso de precipitados de 400ml Probeta de 50ml Erlenmeyer de 100ml Pipetas de 5 y 10ml Agitador de vidrio Tubos de ensayo (5)
Gradilla Embudo de vidrio Esp·tula Vitamina A (traer) Leche (traer)
Acido acÈtico al 10% Ferrocianuro de potasio al 1% KCL NaOH al 10% Alcohol isobutilico
Oxalato de amonio al 4% Acido molibdico (SOLUCI”N) Acido 1,2,4 aminonaftolsulfonico Cloroformo
