Microscopia confocal
Principio de funcionamiento de microscopios fluorescentes y confocales
El corte óptico es el proceso mediante el cual un microscopio diseñado adecuadamente puede producir
imágenes nítidas de planos focales en el interior de una muestra gruesa. El buen seccionamiento óptico,
a menudo denominado buena profundidad o resolución z, es popular en la microscopía moderna ya que,
por ejemplo, permite la reconstrucción tridimensional (3D) de una muestra a partir de imágenes
capturadas en diferentes planos focales. En microscopía de fluorescencia, los objetos que se encuentran
fuera del plano focal solo interfieren con la imagen si están iluminados y emiten fluorescencia. Esto
agrega una forma adicional en la que el seccionamiento óptico se puede mejorar haciendo que la
iluminación sea específica solo para el plano focal.
En un microscopio confocal de barrido laser se usa iluminación puntual y un orificio en un plano
ópticamente conjugado en frente del detector para eliminar la señal desenfocada: el nombre "confocal"
proviene de esta configuración. La microscopía confocal usa un punto de escaneo o puntos de luz para
iluminar la muestra. Junto con un agujero estenopeico en un plano focal conjugado, este actúa para
filtrar la luz de las fuentes fuera del plano focal para mejorar el corte óptico. La intensidad de la luz
emitida por la muestra es detectada por un detector sensible, generalmente un tubo fotomultiplicador
(PMT) o fotodiodo de avalancha, transformando la señal de luz en una eléctrica que es finalmente
digitalizada para generar las imágenes. Los microscopios confocales trabajan según el principio de la
excitación puntual en la muestra (punto de difracción limitado) y la detección puntual de la señal
fluorescente resultante. De este modo, la microscopía confocal puede definirse como una técnica de
imagen óptica para aumentar la resolución óptica y el contraste de una micrografía, todo lo cual se
consigue mediante el uso de una pieza, denominada iris, diafragma o pinole, que bloquea la luz
desenfocada en la formación de imágenes. La captura de múltiples imágenes bidimensionales (2D) a
diferentes profundidades en una muestra permite la reconstrucción de estructuras tridimensionales (un
proceso conocido como sección óptica) dentro del objeto. Esta técnica se utiliza ampliamente en las
comunidades científicas e industriales y las aplicaciones son muy amplias desde ciencias de la vida hasta
ciencias de los materiales, en óptica cuántica e imágenes de nanocristales y espectroscopía.
Como solo se ilumina un punto de la muestra a la vez, las imágenes 2D o 3D requieren escanear sobre
una trama regular (es decir, un patrón rectangular de líneas de escaneo paralelas) en la muestra. El rayo
se escanea a través de la muestra en el plano horizontal utilizando uno o más espejos oscilantes
(servocontrolados). Este método de escaneo generalmente tiene una baja latencia de reacción y la
velocidad de escaneo puede variarse. Los escaneos más lentos proporcionan una mejor relación señal /
ruido, lo que resulta en un mejor contraste y una resolución más alta.
El grosor alcanzable del plano focal se define principalmente por la longitud de onda de la luz utilizada
dividida por la apertura numérica de la lente objetivo, pero también por las propiedades ópticas de la
muestra. Los cortes sucesivos forman una 'pila Z' que puede ser procesada por cierto software para
crear una imagen 3D o se fusiona en una pila 2D.
La microscopía confocal proporciona la capacidad para el seccionamiento óptico en serie directo, no
invasivo, de especímenes vivos, gruesos y vivos, con un mínimo de preparación de muestras y una
