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MICROSCOPIA

Huánuco – Perú

DEDICATORIA

Dedicamos este trabajo previamente a Dios, por habernos dado la vida y permitirnos llegar hasta este momento de nuestra formación profesional. A nuestros padres, a nuestra docente la Bióloga. Nilda Huayta Arapa y a la futura generación de los estudiantes de Medicina Humana.

1. Métodos de Disgregación de Células 51
2. Ventajas y Desventajas del Cultivo Celular 54 MICROSCOPÍA HISTORIA DE LA MICROSCOPIA El primer microscopio formado por dos lentes convergentes fue desarrollado por Zacharias Janssen (1608). Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células". Publica su libro Micrographia (1665). Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias por primera vez (1674). W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada (1828). Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio (1876). Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él, Cajal y otros histólogos desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica (1881). Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia (1908). Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia (1930). Ernst Ruska y Max Knoll , físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico (1937). Aparece el microscopio de efecto túnele, un instrumento para tomar imágenes de superficies a nivel atómico (1981). Su desarrollo en 1981 hizo ganar a sus inventores, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer (de IBM Zürich), el Premio Nobel de Física en 1986.

DEFINICIÓN

La microscopía es el conjunto de métodos que se utilizan para poder visualizar objetos muy pequeños que están fuera del alcance de resolución del ojo humano. La microscopía utiliza instrumentos especiales como lo es el microscopio. Microscopio , del griego: "mikro" = pequeño y "scopeõ" = mirar “para mirar cosas pequeñas” Un microscopio es un instrumento óptico compuesto de varias lentes que sirve para observar objetos muy pequeños. El microscopio permite magnificar el tamaño de estructuras imperceptibles, para lo cual emplea medidas de longitud que se detallan en la siguiente tabla. Toda la información y los conocimientos relacionados con el microscopio son piedra angular en el estudio de la microbiología. OBJETIVOS Y APLICACIONES El microscopio óptico se ha transformado en uno de los medios más importantes para el diagnóstico de las infecciones. Aun hoy, a pesar del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico, muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunológicos, la simple observación visual de la muestra clínica obtenida de un paciente es la forma más rápida y específica de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico. Muchos agentes infecciosos pueden ser identificados en forma fiable con sólo unas pocas coloraciones y un microscopio básico. La coloración de Gram aún es el método individual más eficiente y económico para el diagnóstico rápido y precoz de una infección bacteriana. MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL

aumentos menores, conviniendo para observaciones someras. Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revólver y el tubo del ocular.  Base o Pie : Generalmente en herradura o en Y, aunque también puede ser rectangular, con un peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de iluminación y puede contener un mecanismo para regular la intensidad luminosa. Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato.  Mecanismo de enfoque Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espécimen o ya sea el revólver donde están colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se está utilizando es ese momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rápido del tornillo macrométrico y segundo, otro lento del tornillo micrométrico. La cremallera que permite el movimiento rápido del tornillo macrométrico posee dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos rápidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado histológico. El tornillo micrométrico por el contrario posee una graduación tal que cada división de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta disposición permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos, considerando el número de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte más superficial y luego la más profunda. El movimiento del tornillo micrométrico tiene una extensión de 5mm aproximadamente y está limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento  La platina Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histológicas. Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador.

Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijación e inmovilización de la lámina porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo.  El revólver Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. El revólver está constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que está colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera, alojar un número variable de objetivos (dos, tres, cuatro o más).  El tubo Soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interior está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación de reflejos y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografía, hay un tercer tubo accesorio, generalmente más largo y vertical que sirve para conectar una cámara fotográfica sin necesidad de lente ocular.  Pinzas de sujeción Parte mecánica que sirve para sujetar la preparación. La mayoría de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación.  Brazo : Es una pieza metálica de forma curvada que puede girar; sostiene por su extremo superior al Tubo Óptico y en el inferior lleva varias piezas importantes. La columna puede ser inclinada; en su parte más inferior se dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el revólver y el tubo.

secos o de inmersión. Son objetivos secos aquellos que entre el objeto observado y el objetivo solamente existe el aire; en cambio se denominan objetivos de inmersión aquellos que requieren que entre la preparación y la lente frontal del objetivo se coloque una sustancia líquida, ésta puede ser agua, glicerina o un “aceite de inmersión”, natural como el “aceite de cedro” o aceites artificiales. Objetivos secos y objetivos de inmersión: Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1,515) casi idéntico al del vidrio. La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento. Otra clasificación de los objetivos se refiere al tipo de corrección al que deben someterse las lentes con la finalidad de disminuir o anular algunas aberraciones que se producen en las lentes, como las aberraciones cromáticas, de curvatura de campo, astigmatismo y de esfericidad. Dependiendo de las aberraciones corregidas los objetivos pueden ser:  Acromáticos. Estos objetivos corrigen los rayos luminosos azules y rojos haciéndolos coincidir en un solo plano focal. En tanto que los otros rayos coloreados se forman en otro plano focal generando una imagen cuyos bordes se observan levemente difusos (espectro luminoso secundario). Los objetivos de los microscopios “de estudiante” son acromáticos.  Semiapocromáticos. Se les conoce también como objetivos de “fluorita”, corrigen el espectro secundario dando como resultado imágenes de bordes más nítidos. Por la alta capacidad que tienen para transmitir las radiaciones luminosas de onda corta, se les considera como los objetivos ideales para microscopía de fluorescencia.

 Apocromáticos. En estos objetivos se hacen coincidir en un solo plano los rayos luminosos azules, rojos y verdes, obteniendo así una imagen de bordes sumamente nítidos, pero la corrección de esta aberración trae consigo la acentuación de otra, que es la de curvatura de campo, pues la superficie focal de la imagen es ligeramente curva, dando como resultado que, al observar la imagen y tratar de enfocarla en la zona central del campo microscópico se desenfoca la zona periférica y viceversa.  Planapocromáticos. Son los objetivos en los cuales se han corregido la mayor cantidad de aberraciones como la cromática, curvatura de campo, de esfericidad y de astigmatismo; por lo tanto se obtienen imágenes sumamente nítidas y el campo microscópico aparece totalmente plano, enfocado en toda su extensión. Son los objetivos que generan imágenes con mejor resolución, es preferible usarlos cuando se desea obtener imágenes fotográficas (fotomicrografía). La capacidad que tienen los objetivos de formar imágenes en donde se distingan más detalles del objeto examinado depende de una serie de factores como los que se mencionan a continuación Índice de refracción: Se denomina así a la relación existente entre la velocidad de la luz en el aire y su velocidad en el medio transparente utilizado. De la misma manera, se pueden obtener los índices de refracción de una serie de sustancias que se utilizan en la construcción y tallado de las lentes de los objetivos. El índice de refracción de un objeto o una sustancia transparente se expresa mediante la fórmula:

IR =

Velocidad de la luz en el aire

Velocidad de la luz en el medio

Angulo de apertura: Es la capacidad de un objetivo de captar los rayos luminosos refractados cuando éstos atraviesan un medio transparente. Cuanto mayor sea este ángulo, la lente frontal del objetivo aceptará una mayor cantidad de ellos. Dependiendo del índice de refracción del material transparente que forma la lente del condensador, o la interfase (aire o sustancia de inmersión) que exista entre el objeto y la lente frontal del objetivo, el ángulo de apertura será mayor o menor. Apertura numérica (NA): Es una medida que indica la capacidad del objetivo de poder captar los rayos refractados por las estructuras finas de las cuales está constituido el objeto que se observa. Esta capacidad se traduce en el poder 5 del microscopio de formar imágenes que muestren al observador una serie de detalles del objeto que se está examinando. Cuanto mayor sea la apertura numérica de un objetivo, éste tendrá una mayor capacidad de mostrar detalles finos en la imagen que forma. La apertura numérica de un objetivo se calcula empleando la formula matemática siguiente:

 OCULAR

Es otro componente óptico del microscopio, debe su nombre porque la imagen final se observa a través de él acercando el ojo a la lente “ocular” del componente. Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el objetivo. La imagen del ocular es de mayor tamaño, virtual y derecho. Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces a la imagen formada por el objetivo. No añade, por más aumentos propios que posea, ningún detalle a los generados por el objetivo. En la generalidad de los casos, los oculares están construidos por dos lentes convergentes (planos convexos). La primera lente se denomina “de campo o frontal”, está situada en la parte anterior del ocular y, es la encargada de recoger y ampliar la imagen generada por el sistema de lentes del objetivo. La lente posterior, en contacto estrecho con el ojo del observador, se denomina lente “ocular” y es la responsable de aumentar nuevamente la imagen y orientarla hacia el ojo del observador Clasificación :

- Oculares de Huygens : Están constituidos por dos lentes plano convexos, con la superficie convexa dirigida hacia abajo. Entre ambos se sitúa un diafragma anular, localizado en el plano focal de las lentes. En este diafragma se puede adherir un puntero o señalador que suele ser elaborado por una pequeña porción de una pestaña o pelo. Empleados con los objetivos acromáticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad está dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. También denominado ocular Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal.

negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy común en modelos de microscopios antiguos.

- Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre sí y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera óptima con los objetivos corregidos al infinito. - Oculares compensadores: Éstos consisten en que uno de ellos posee un sistema de lentes móviles que permite enfocar correctamente la imagen del objeto, después que el enfoque total del microscopio se ha realizado y se nota aún una imagen levemente desenfocada en uno de ellos, generalmente el izquierdo, porque al observar la imagen a través de cada ocular derecho e izquierdo se nota que una de ellas no está enfocada correctamente. Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos. - Oculares de proyección : Posee una lente que permite la proyección de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición. - Oculares aplanéticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo óptico. - Oculares peri-planáticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular. 4.3. Sistema de iluminación El sistema de iluminación está constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observación microscópica. Uno de los aspectos críticos a considerar en la Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c)

negro o a colores. También se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia).

- Láser: En los últimos años se ha incrementado el uso de láser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificación de Luz por Emisión Estimulada de Radiación), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con características de tamaño, coherencia, forma y pureza controladas. El láser de argón es uno de los más utilizados, cuya emisión está en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en microscopía confocal. - LED: De las siglas en inglés Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un dispositivo emisor de luz con características muy próximas a la luz monocromática (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente eléctrica pasa a través del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que están hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lámparas. En comparación con las bombillas incandescentes, son más interesantes porque permiten ahorro de energía con un mayor rendimiento lumínico. Para microscopía se emplean LED de larga duración que proveen una luz muy brillante y fría; esto último es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observación es más cómoda para el usuario. En la actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca. - Condensador Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El término condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono luminoso que a su vez forma una imagen más clara. El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen. El primer condensador que se fabricó en 1838 (por Dujardin) poseía tres lentes acromáticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y también producen aberraciones, sin embargo, éstas también pueden corregirse. Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones ópticas  Condensador de Abbe: Es el más simple, sin corrección de aberraciones y el más económico. Compuesto de dos o más lentes. Puede llegar a tener una apertura numérica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observación de rutina y

con objetivos de modesta apertura numérica y amplificación. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede producir.  Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad.  Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografía (blanco y negro o color).  Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es óptimo con inmersión y objetivos de mayor aumento.

- Diafragma o iris Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistían en un disco de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual se rotaba según la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo más elaborado y con un diseño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto. Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotónico. El medio de inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo.

Si se sustituye el ojo del observador por una cámara fotográfica se pueden obtener fotografías de la preparación histológica, a los mismos aumentos a los que se observa o a mayores aumentos si se amplía el negativo. El poder de resolución se mide utilizando como unidad la inversa del límite de resolución (poder de resolución = = 1/límite de resolución). El límite de resolución se define como la distancia mínima entre dos puntos para que éstos puedan distinguirse como tales. Se calcula por la fórmula de Abbe: Límite de resolución = = 0.61 × longitud de onda/apertura numérica. El microscopio óptico aumenta casi 1000 veces el poder de resolución del ojo. Lo importante es el poder de resolución. TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO Se denomina así porque la imagen que se forma está constituida por una serie de estructuras brillantes sobre un fondo oscuro. El principio óptico de este microscopio es el de aprovechar un conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observándose el campo microscopio totalmente oscuro... Para que esto ocurra se requiere en primer lugar que la apertura numérica del condensador sea mayor que la apertura numérica del objetivo. Esta condición facilita que los rayos luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean impedidos de entrar a la porción central de la lente del

condensador y solo penetren y emerjan de él, los rayos periféricos que al refractarse se hacen oblicuos. Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partícula, son desviados hacia la lente frontal del objetivo y la imagen de la partícula se observa brillante en medio de un fondo oscuro. Existen diversos tipos de condensadores diseñados y fabricados especialmente para la microscopía de campo oscuro. El microscopio de campo oscuro se emplea para ver células vivas (protozoarios, bacterias, células descamadas, etc.) en las cuales no se han aplicado sustancias fijadoras ni colorantes. También se observan partículas de un tamaño inferior a los 0.2 de micrómetro; esto se debe a que los rayos de luz oblicuos que inciden en ellas forman un halo luminoso brillante alrededor de las mismas. Mediante el empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la forma y el movimiento helicoidal que muestra la espiroqueta Treponema pallidum , una bacteria causante de la sífilis. Utilidad: Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran). Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar. Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.