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Teóricos de Anatomía e Histología
1er teórico de Anatomía: Microscopía
Autólisis: En el momento en que un preparado se extrae (hígado por ejemplo se extrae de una rata), este órgano comienza a degradarse, a deteriorarse. Para eso se debe que fijar (detengo proceso de autólisis) y después sigo con todo el procedimiento. Si una célula tiene un gran desarrollo del REG su principal función es la síntesis proteica. Si una célula tiene un tipo específico de mitocondria produce lípidos o sustancias parecidas (ej: hormonas esteroides). Microscopios Microscopio óptico (óptico porque el sistema de visualización está dado por lentes de cristal) de campo claro (porque el campo que se observa está iluminado). Componentes fundamentales de este tipo de microscopios: ● Estructura mecánica ● Estructura óptica ● Tienen una base, metálica ● Estativo ● Distintas lentes con las que se ve el preparado ● Lámpara, la cual se enciende para utilizar el microscopio; por encima de ella comienzan las primeras lentes del sistema óptico. ● Platina: lugar donde se apoya el preparado a observar; tiene un agujero => la luz que sale de la lámpara. ● Las lentes son de dos tipos:
- Lente Ocular: pegada al ojo. (Ocular o binocular)
- Lentes Objetivos: varias lentes, cercanas al preparado (están cerca del objeto)
S i t r a z o u n l í n e a a l m e d i o = > α e s e l á n g Aumentos del M.O ∼ Una de bajo aumento: en general tiene 10X, algunos tienen de 5X (se le llama lupa porque tiene poco aumento) ∼ Una de aumento intermedio: de 40 o 45X ∼ Una de 100X: el máximo de aumento que se puede tener con un microscopio óptico.
- Para ver cual es el aumento total observado hay que multiplicar el aumento del ocular por el del objetivo. Si miro, por ejemplo, un preparado con un objetivo de 10X tengo un aumento total de 100X; así con todas las lentes objetivo. 1000X es el máximo aumento que se puede obtener con un microscopio de este tipo. Unidades: Cuando uso un microscopio óptico la más utilizada es el micrón o micrómetro => 1 micrón es la milésima parte de un milímetro. -Cuando utilizo un microscopio electrónico: Logra un mayor aumento, puedo medir tamaño de un núcleo, de una mitocondria, de un lisosoma. Se utiliza el nanómetro (le sigue al micrón), el armstrong y el picómetro (el más pequeño de todos). Límite de resolución: Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para discriminarlos por separado. Se calcula con una fórmula: d= [0,61 (cte.). λ (longitud de onda de la luz con la que se ilumina el preparado)]/ AN (apertura numérica). Límite de resolución depende de dos cosas : De la longitud de onda de la luz que está reflejado a lo que veo (mayoría de las veces es la luz visible) y la apertura numérica (es una condición del microscopio), distintos microscopios tienen distintas aperturas numéricas. La luz que sale de la lámpara atraviesa la lente condensadora, se condensa en ese agujero que hay debajo de la platina, atraviesa la platina y el preparado y llega al lente objetivo. No todos los rayos de luz que atraviesan el agujero y el preparado llegan al lente objetivo, eso depende de la distancia a la que estén separadas las cosas.
son los rayos que pasan por el costado de la lente condensadora. Esto hace que, sobre un fondo oscuro, las células (o lo que se esté viendo en el momento) se vea como con relieve porque la muestra que se tiene está iluminada solamente con rayos tangenciales sobre un fondo oscuro. Estos microscopios son muy útiles para observar células vivas y cristales que aparecen en sedimentos urinarios. Microscopio de contraste de fases: Tiene también la lámpara, la lente condensadora, el espécimen en la platina, se interponen (primero entre la lámpara y la lente condensadora, y después entre la lente objetiva y el ocular) unas estructuras llamadas anillos ópticos. Estos anillos tienen un circulo en el medio. Permite que haya contraste de fases porque la luz se desfasa y permite ver en forma más oscura las zonas más gruesas, y distinguirlas de las más finas en un preparado. Utiliza las diferencias en el índice de refracción de los rayos de luz. *Pueden detectar fácilmente células vivas y se utilizan mucho para ver movimiento celular. Son microscopios ópticos, λ es la misma que en un microscopio óptico común, la resolución también es la misma. Microscopio de interferencia: Es un estudio realizado para ver cuál era la velocidad de desplazamiento de una célula de un cultivo de tejido. Tanto en el microscopio de contraste de fases como en el de interferencia no se ven colores, solo se ven zonas más claras y más oscuras, los núcleos se ven bien marcados en el centro.
La diferencia fundamental del microscopio de interferencia, con respecto al de contraste de fase común, es que se pueden hacer cuantificaciones. En general, se emite una serie de rayos que atraviesan el preparado y, paralelamente, se emite otro rayo que es como si fuera un rayo patrón, como si fuera el estándar, se puede medir cuánto se retrasa el rayo que atraviesa el preparado con respecto al rayo patrón, se puede llegar a calcular la masa de la célula observada. ☼ Microscopio de luz UV : Se utiliza para el estudio de los ácidos nucleicos. No es un microscopio óptico común; en lugar de tener lentes que tiene un microscopio óptico común, tiene unas lentes hechas con cuarzo, las cuales emiten luz UV. Esta luz UV posee un λ que oscila entre 200 y 250 nanómetros, se obtiene una mayor resolución que con un λ de la luz visible. Sirve solamente para aquellas moléculas que tienen la capacidad de absorber la luz UV. No se puede utilizar con observación directa por 2 razones:
- La luz UV es invisible al ojo humano
- UV daña el ojo Se debe captar lo que se quiere ver con (generalmente) una película fotográfica o en una computadora, no se puede observar directamente, no tiene ocular para ver. Las sustancias que absorben, en general, la luz UV son ácidos nucleicos porque las bases púricas y pirimidínicas absorben este tipo de luz. Además, hay algunos aminoácidos que tienen un anillo carbónico que también tienen la capacidad de absorben la luz UV.
Hay sustancias que son fluorescentes por naturaleza, las puedo iluminar, generalmente con un haz de luz UV, y emiten fluorescencia. Hay otras que no y hay que agregarles un compuesto fluorescente para estudiar algo específicamente. Por ejemplo, la vitamina A tiene autofluorescencia. Microscopio confocal: Tiene una base parecida al microscopio de fluorescencia; lo que se detecta es, generalmente, la fluorescencia. Pero, tiene un sistema en el cual es como si escaneara distintos niveles de un tejido, normalmente, con un microscopio de fluorescencia, veo algo en 2D ≠ este tipo de microscopio tiene un sistema, unido a un software de una computadora, donde se escanean distintos niveles de ese preparado. Luego, la computadora junta todos esos resultados y se logra observar una estructura 3D de la célula, es un aparato que siempre está unido a una computadora. Fundamento: La fuente luminosa no es luz solar, no es luz visible, sino que es un láser que ilumina y dos lentes fundamentales (uno objetivo y otra llamada lente del fototubo). El láser manda rayos que atraviesan la lente del fototubo y pasan por un orificio (llamado puntiforme). El camino de los rayos de luz: El rayo de luz atraviesa el orificio puntiforme, da hacia un espejo (llamado espejo separador de haces), el cual manda rayos al lente objetivo, los cuales llegan al preparado. Con un plano de foco vuelven los rayos, siguen por un camino inverso hasta arriba, pasan por el segundo orificio puntiforme y llegan al detector. Se hace todo un escaneo de varios planos. Tipos de microscopios (electrónicos): Tienen límite de resolución enorme porque no utilizan luz solar ni luz UV, sino que, como luminosidad, utilizan un haz de electrones, el cual tiene una λ de 0,005 nanómetros. Principio: Transporte de electrones entre el cátodo y el ánodo. Lo que se hace es utilizar un filamento (minuto 51:10 aprox) como cátodo que libera una cantidad de electrones que son los que después son atraídos por el ánodo. Jamás se va a poder observar un preparado vivo con este tipo de microscopios porque todo este sistema ocurre en el vacío absoluto. Y se ve todo en tonos grises.
∮ Microscopio electrónico de transmisión: Con este tipo de microscopio se ve la ultraestructura de una célula: Núcleo, citoplasma y organelas. Como tiene una resolución tan grande que no da una visión panorámica. Tiene mucho aumento. Las mitocondrias están en el límite de resolución del microscopio óptico; se pueden apreciar con el verde Jano (colorante) como si fueran pequeños filamentos. ∮ Microscopio electrónico de barrido Límite de resolución un poco menor al MET: 1 nanómetro Diferencia que tiene con el MET : Haces de electrones no atraviesan la célula (o el preparado), sino que hacen un escaneo, un barrido por su superficie, se puede observar una imagen 3D (en el MET es en 2D). En este caso, se pueden ver las células tridimensionalmente, pero no se puede observar su estructura interna. *Microscopio de Fuerza Atómica: Último tipo de microscopio desarrollado. Siempre está acoplado a una computadora. No es un microscopio óptico ya que no tiene lentes de ningún tipo. El principio sobre el cual trabaja es que tiene una sonda que pasa por la superficie del preparado que se está viendo. Esta sonda tiene la capacidad de detección. Tiene una estructura con un brazo que tiene una punta. Esta punta “barre” la superficie; hay dos formas en las que puede actuar:
- Por barrido: la punta va pasando.
- En lugar de escanear todo, hace como golpes (más interrumpido) intermitentes
- Fijación: Proceso que detiene la autólisis, es decir, evita que el preparado se vaya deteriorando. Además, tiene función bactericida, impidiendo que bacterias y/o virus ataquen al órgano. (Se utiliza formol)
- Deshidratación: ¿Por qué? Porque las moléculas de agua interfieren en la acerlo, se utilizan concentraciones crecientes de etanol.
- Aclaración: Luego, se lleva a otro compuesto orgánico: xileno o xilol, para sufrir el proceso de aclaración. Se llama así porque se permite visualizar mejor lo que tengo.
- Inclusión: Luego, incluyo el preparado, el proceso de endurecimiento se llama inclusión. Sirve para que no se rompa el preparado. La inclusión se realiza en parafina,
- Se corta con aparatos especiales: micrótomos (cuando actúan a temperatura ambiente) y criostatos (cuando se trabaja a 4°). El micrótomo tiene cuchillas que van cortando en fetas. Las rodajas que salen, al ser todas finitas, salen arrugadas, entonces se las ablanda con agua a 37°. *Coloración: Se utiliza la técnica histológica, en general, la coloración se hace con dos colorantes: se pone un colorante básico y uno ácido. Los más comunes: Hematoxilina y Eosina (H-E). Una vez coloreado el preparado (primero se pone con un colorante, se deja un tiempo, se enjuaga, después se deja el otro) se deshidrata nuevamente para que las moléculas de agua no interfieran en la visión. *Una vez coloreado, (ya se tiene sobre un portaobjetos de vidrio) se le pone arriba un cubreobjetos , el cual protege al preparado. Ortocromasia corresponde a lo que hay que colorear. Pero, hay células que tienen sustancias que modifican la estructura del colorante; hay componentes celulares (por ejemplo, los proteoglucanos: en matriz del cartílago; mastocitos). En general, la metacromasia se da en los colorantes básicos que tienen cargas positivas.
Metacromasia Cuando un colorante cambia su estructura debido a una sustancia que está en esa célula o en ese tejido. En general, se da cuando tengo un colorante en forma monomérica (por ejemplo, azul) y, al polimerizarse, da otro color. Metodologías más específicas (técnicas histológicas histoquímicas o citoquímicas) Sirven para hacer determinaciones de sustancias específicas.
- Métodos basados en la reacción de Schiff para aldehído : El reactivo de Schiff es una leucofucsina (blanca) que se une a los grupos aldehídos y modifica su color, y se convierten en color fucsia. Dos métodos que utilizan este reactivo (este leucofucsina decolorada):
- Método de PAS.
- Método de Feulgen : También utiliza el reactivo de Schiff, con la diferencia de que sirve para detectar ácidos nucleicos, específicamente ADN.
- Métodos histoquímicos para lípidos : Se utiliza para determinar lípidos porque estos, si se hace una técnica histológica común, todos los solventes orgánicos en los cuales se va sumergiendo el preparado disuelve los lípidos, desaparecen las vacuolas lipídicas y queda un hueco blanco donde estaban ubicados los lípidos. Se utilizan los colorantes sudanes. ● Métodos inmunohisto (o cito) químicos: Se utilizan para determinar proteínas específicas. a) Directos: Aquellos en los cuales, por ejemplo, quiero determinar una hormona de la hipófisis, se inyecta vasopresina de rata en un conejo, el conejo la reconoce como extraña y forma anticuerpos anti-vasopresina de conejo, puedo utilizar este anticuerpo para ver en qué célula de la hipófisis se produce la vasopresina, se tiene que identificar cuál es la célula específica que produce la hormona y
Para la microscopia electrónica, el proceso es semejante pero no es igual a para microscopia óptica:
- La fijación se hace con glutaraldehído y tetróxido de osmio, sirve para fijar y “colorear” al mismo tiempo
- Se deshidrata, se aclara con xileno; en vez de incluirse en parafina se incluye en una resina hipoxi (que es más dura) porque los cortes son todavía más finos que para la MO.
- Luego, en vez de cortarse con un micrótomo común, se corta con un equipo llamado el ultramicrótomo, el cual tiene cuchillas que son con filo de cristal o de diamante. *Las muestras, luego de cortadas con este ultramicrótomo, son tan finitas que, en vez de ponerse en un portaobjetos de vidrio, se recogen en una grilla, un entramado de cobre, el cual es el que se pone en el microscopio para poder observarlo.
