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TEMA Nº 1
MICROSCOPIO OPTICO-COMPUESTO
OBJETIVO
Familiarizar al estudiante con los componentes del microscopio óptico compuesto Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado del microscopio. Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observación de especímenes con el microscopio. Manejar correctamente y con destreza.
El ojo humano sólo tiene los ojos humanos tienen alrededor de 576
megapíxeles de resolución , un poder de resolución de aproximadamente de
0.2mm (200 μm), entendiéndose como poder de resolución a la medida de capacidad para distinguir un objeto de otro; es la distancia mínima que debe haber entre dos objetos para que sean percibidos como objetos separados. Esta limitación del ser humano ha llevado a los científicos a desarrollar uno de los inventos más importantes de la historia como el Microscopio; este invento ha permitido el descubrimiento y observación de innumerables microorganismos y componentes de cuerpos vivos. El microscopio ha sido y es de gran utilidad, en diferentes campos de la ciencia, sobre todo en las ciencias biológicas como por ejemplo biología celular, microbiología, parasitología, citología, citogenética, histología y anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas y de investigación. Un microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Ello se consigue mediante un sistema óptico compuesto por lentes de cristal, que, al ser atravesadas por los rayos de luz reflejados por el objeto, forman una imagen amplificada de él. El microscopio es un instrumento óptico, que se utiliza con el fin de obtener una imagen amplificada de un objeto muy pequeño como por ejemplo una célula, un tejido etc. La imagen puede ser observada directamente por los oculares, o, puede ser recogida en una cámara fotográfica, en cámara lúcida, o recogida y cuantificada por fotocélula u otros receptores. La invención del microscopio se le atribuye a Zacarías Jansen en 1590, aunque el nombre fue dado por Jean faber en 1624.
1.1 Microscopio óptico o fotónico Este tipo de microscopios utilizan la luz como fuente de energía y las propiedades de los lentes ópticos que permiten aumentar el tamaño de los objetos observados. 1.1.1 El microscopio óptico Simples Es el más rudimentario porque utiliza apenas una lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta quince veces. 1.1.2 Microscopio Óptico Compuesto Un microscopio compuesto se denomina “compuesto” porque compone la luz haciendo que atraviese dos o más lentes para que aumenten el tamaño de la imagen. Encontramos una lente cerca del objeto a observar conocida como lente objetivo, que amplía naturalmente la imagen del objeto haciendo que la luz utilizada para observarlo atraviese un cristal curvo. En otra lente llamada lente ocular es donde ocurre el verdadero aumento con un microscopio compuesto. La lente ocular aumentará la imagen ya ampliada por la lente objetivo, haciendo que se vea aún más grande. Vale decir que consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentra en el punto focal del ocular. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. La longitud focal o distancia entre la lente y su foco es relativamente corta en un microscopio simple. Una lupa, por ejemplo, enfoca solamente un área y, para poder ver nuestra imagen aumentada, hay que mover la lente hasta que el objeto esté enfocado. Ocurre algo parecido con los microscopios compuestos, con la diferencia de que la imagen aumentada de la lente objetivo se convierte en el punto focal para la lente ocular, haciendo que la longitud focal total sea más larga y más precisa. En un microscopio compuesto, la imagen original aumentada se proyecta en algún punto en el interior del cilindro microscopio, dentro de la longitud focal de la segunda lente. Esto permite que la segunda lente vuelva a aumentar la imagen virtual de la primera lente y así proporcionar una representación aún más grande del objeto. El aumento de un microscopio simple es fijo aumenta el tamaño de la imagen al grado que permite la lente. El aumento de un microscopio compuesto puede
1.2.1.2 COLUMNA
Tiene la forma de una columna con base cuadrada que se articula en la parte inferior con el pie y en la parte superior con el tubo. La columna o brazo: llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo la inclinación del tubo para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción superior y por la parte media, mediante mecanismos de unión y desplazamiento a la platina, subplatina y a los mandos de enfoque. 1.2.1.3 TUBO El tubo soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interior está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación de reflejos y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografía, hay un tercer tubo accesorio, generalmente más largo y vertical que sirve para conectar una cámara fotográfica sin necesidad de lente ocular 1.2.1.4 REVOLVER El revólver es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo. 1.2.1.5 MANDOS DE ENFOQUE Sirven para colaborar en el enfoque de la preparación ya que acercan y alejan los objetivos de la preparación mediante el movimiento de los tornillos macro u micrométricos. Tornillo macrométrico El tornillo macrométrico o macroscópico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación.
Tornillo micrométrico El tornillo micrométrico o microscópico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm, que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. Una vuelta completa de giro de este tornillo sube o baja los objetivos medio milímetro. En algunos de los microscopios actuales, los tornillos macrométrico y micrométrico no se encuentran separados, sino presentan un solo tornillo macromicrométrico, este tornillo cumple con las dos funciones antes mencionadas. 1.2.1.6 PLATINA Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones microscópicas presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijación e inmovilización de la lámina porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo llamado el Carro Movil. La platina puede ser fijas o móvil: Las platinas fijas, están provistas de dos pinzas metálicas, que sirven para asegurar la preparación. Para desplazar la preparación adelante, atrás, la derecha o a la izquierda, se recurre a mover la preparación con las manos. Las platinas móviles, tienen dos pinzas metálicas que sujetan a la muestra, y para el desplazamiento de derecha a izquierda y de atrás adelante lleva un dispositivo llamado Carro móvil, es un tornillo que permite realizar dichos movimientos logrando un examen metódico y completo de la preparación. Algunas platinas tienen también movimientos de ascenso y descenso por medio de los tornillos macro y micrométrico. Otra pieza, el vernier (denominado así gracias al nombre de su inventor en 1631), también llamado nonius, consiste en dos pequeñas reglas graduadas en milímetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura determinada en la preparación. 1.2.1.7 SUBPLATINA
y la distorsión Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos. Oculares de proyección: Posee una lente que permite la proyección de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición Oculares aplanéticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo óptico Oculares peri-planáticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular Figura Nº 1 Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Uno de los diseños de oculares más avanzados es el ocular Periplan fig. 4 que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromáticas, la curvatura de campo y su empleo óptimo es en combinación con objetivos de gran poder de aumento.
Figura Nº 2 Diagrama de la constitución del ocular Periplan. Es un ocular negativo. Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (1). Los modelos de microscopios más simples poseen un solo ocular (mono- oculares), sin embargo, hay microscopios binoculares y algunos modelos más modernos son trinoculares, especiales para la microfotografía. CAMPO DEL MICROSCOPIO Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante, el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de coprología o hematología, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observación de la preparación, lo cual se dificulta con un campo circular clásico al quedar zonas superpuestas. El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 5x, 10x, 15x, 20x. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en milímetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm. Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus características: UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio. H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la
Los objetivos se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Son la parte más importante del microscopio, ya que proporciona la mayor parte del aumento. La imagen que dan es real invertida y aumentada (RIA) Consiste de un sistema centrado de lentes convergentes ubicado en un cilindro hueco. La lente inferior, la que está en relación con el objeto, se llama lente frontal y es la responsable del aumento total de la imagen, las otras lentes, que pueden ser de 1 a 4, de acuerdo al tipo de objetivo, corrigen las aberraciones (cromática, esférica, curvatura de campo). Significado de las inscripciones de los objetivos Los objetivos pueden tener diversas inscripciones, como Phv, Pol, Planachromat, Planapochromat, Semiplan, etc. Pero las cuatro inscripciones más importantes son las siguientes: a) El aumento del objetivo:3.2 - 4 - 10 - 40 - 100 b) La abertura numérica del objetivo: 0,1 - 0,2 - 0,65 - 1. c) La longitud del tubo, es decir la distancia que existe entre el ocular uy el objetivo expresado en milímetros: 160 ó 170 d) El espesor máximo del cubre objeto a utilizarse: 0,17. mm. CLASES DE OBJETIVOS Los objetivos se los puede clasificar, de acuerdo al medio que existe entre la lente frontal y la preparación y de acuerdo a las aberraciones que corrigen. a) De acuerdo al medio que existe entre la lente frontal y la preparación Se clasifican en objetivos: en seco y de inmersión. Objetivos en seco. Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
Objetivo de inmersión. En este objetivo se debe interponer una capa de líquido entre la lente frontal y la preparación. Generalmente se utiliza aceite de cedro, aceite de inmersión que es un aceite sintético con un índice de refracción de 1,51. Los objetivos de inmersión tienen un arco o anillo distintivo pintado de Color rojo o negro. b) De acuerdo a las aberraciones que corrigen Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromático cuando no posee ninguna denominación. Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados para la microfotografía en colores. Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo. Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan-apocromáticos. Los objetivos están insertados en el revolver generalmente en un número de 4. Los lentes objetivos más comunes son los de 4X o 5X, 10X, 40X y 100X. El lente de 100X se usa únicamente con aceite de inmersión por lo que es llamado lente de inmersión y los demás se llaman lentes en seco. La lente del objetivo situada cerca de la preparación tiene por función ampliar la imagen y la amplificación total o magnificación total resulta de la acción combinada del ocular y objetivo, se calcula multiplicando estos dos valores. Ej.: ocular 10X, objetivo 10X, amplificación total 100X. A medida que el poder de amplificación o la magnificación del microscopio
vez forma un cono luminoso necesario para la visualización con objetivos de mayor aumento. 1.2.3.2 CONDENSADOR El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. En el interior del condensador existe un diafragma-iris cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados, es decir corregir la divergencia de los rayos emitidos por una fuente de luz puntual y así crear haces paralelos tales que iluminen de una forma uniforme las superficies objeto El término condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono luminoso que a su vez forma una imagen más clara. El condensador tiene una lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia. Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones ópticas. Condensador de Abbe: Es el más simple, sin corrección de aberraciones y el más económico. Compuesto de dos o más lentes. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede producir. Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad. Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografía (blanco y negro o color). Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es óptimo con inmersión y objetivos de mayor aumento.
Figura Nº 4 Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. 1.2.3.3. DIAFRAGMA O IRIS Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. La apertura del diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto. Figura Nº 5 Diafragma o iris 1.3 DEFINICIONES EN MICROSCOPIA El poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. En el microscopio viene limitado por la longitud de onda de la radiación empleada; en el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de la luz azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 Å. Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la
firmemente sujeto por las pinzas metálicas que están en la platina
- Bajar el condensador y cerrar el diafragma.
- Para iniciar el enfoque, lo primero es acercar la preparación lo máximo posible a la lente del objetivo para ello utilizamos el tornillo macrométrico mirando desde el exterior, no mirando a través del ocular. Si lo hacemos a través del ocular corremos el riesgo de que acerquemos demasiado, incluso que forcemos el objetivo contra la preparación pudiendo dañar tanto el objetivo como la muestra.
- Luego poner los ojos sobre el ocular y mirando a través del procedemos a realizar el enfoque grueso. Moviendo el tornillo macrométrico lentamente vamos separando la preparación del objetivo. Llegará un momento en que veamos la muestra de forma más o menos nítida; en este momento si fuera necesario se utilizará el tornillo micrométrico para dar nitidez.
- Pasar al objetivo de (10X ,40X) con la ayuda del revólver, y utilizar solo el micrométrico para el enfoque correspondiente. En algunas ocasiones puede ocurrir que al pasar a un objetivo de mayor aumento se pierda por completo la imagen; en este caso se volverá nuevamente al inicio del enfoque. Cuando el objetivo es de mayor aumenta, el objetivo enfoca de forma más cercana a la preparación, por ello hay que tener cuidado de que el objetivo no toque la muestra, pues se puede estropear tanto la lente del objetivo como la propia preparación. Cómo usar el objetivo de inmersión: El objetivo de inmersión del microscopio óptico se sumerge en un aceite, llamado aceite de inmersión (comúnmente aceite de cedro). Para utilizar el objetivo de inmersión hay que seguir estos pasos:
- Primero realizar el enfoque ya mencionado con el objetivo en seco de 10x
- Girar el revolver a un espacio vacío o al objetivo de 4x para facilitar el colocado de una gota de aceite de inmersión a la muestra
- Hacer girar el revólver y colocar el objetivo de 100x en posición de observación.
- Subimos el condensador todo lo que podamos para que sevisualice de forma clara y nítida el círculo que se ilumina en la muestra.
- Luego con el tornillo micrométrico proceder al enfoque.
- Cuando terminemos de observar la preparación y para retirar la muestra, primero bajamos la platina y luego giramos el revólver para dejar el objetivo de menor aumento en posición de trabajo.
- Luego retirar la preparación con menor riesgo de dañar algún objetivo y de forma más cómoda.
- Por último, antes de guardar el microscopio, limpiamos el objetivo de
inmersión y los oculares con papel especial que no raye las lentes y que absorba el aceite. 1.6 PARTE PRÁCTICA El objetivo de la preparación de muestras para microscopía óptica es permitir que las estructuras de los materiales se revelen con suficiente contraste de modo que las características de interés sean descritas, grabadas y caracterizadas en detalles visibles a una escala menor que la agudeza visual del ojo humano. Existen diversas técnicas de preparación del material para su observación bajo el instrumental óptico. Fundamentalmente, se requiere que los portaobjetos y cubreobjetos se encuentren perfectamente limpios, preferentemente enjuagados con dilución de agua con alcohol y secos. La preparación del material se debe realizar sobre una superficie limpia y plana. Preparado en fresco Consiste en utilizar un porta objeto colocar la muestra en estudio y cubrir la misma con un cubre objeto Squash Consiste en la disgregación de la muestra mediante el aplastamiento del material entre el porta y cubreobjetos. Para realizarlo se siguen los siguientes pasos: Se disgrega el material con la ayuda de pinzas y alfileres o agujas. Si se requiere, se lo somete a coloración durante el tiempo necesario. Se cubre el material con un cubreobjetos. Se apoya el portaobjetos sobre una superficie dura y completamente plana. Se coloca sobre el cubreobjetos un papel secante o un papel de filtro doblado y se aplasta con el dedo pulgar sin deslizar ni rotar el cubreobjetos. Se debe operar con precaución, pero con firmeza para evitar la rotura del material. Con el microscopio óptico compuesto se observarán La forma general de la mayoría de las células procariontes La forma general de las células eucariontes Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleólos, cromosomas, mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilios, centriolos, vacuolas, pared celular.
