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EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Limite de resolución: 0.61 λ / r sen θ Microscopio optico: 0.2 μ m Cuanto menor sea λ , más pequeñas serán las estructuras que se podrán observar λ depende de la “fuente de iluminación”: fotones, electrones
ELEMENTOS DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
- Similar en su diseño básico al M.O.
- Diferente:
4 Fuente de iluminación: haz de electrones
4 Lentes: electromagnéticas: bobinas que
generan un campo magnético que enfoca el
haz de electrones a través de un orificio
4 Medio: Alto vacío (limita las características
de las muestras: deshidratadas y no volátiles).
Lente electromagnética
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION
- Los electrones atraviesan la muestra: muy delgada
- Cañón de electrones: Filamento de tungsteno y ánodo. Calentamiento del filamento por corriente eléctrica: liberación de electrones de su superficie, los cuales son atraídos por el ánodo (+) y acelerados. En función de la diferencia de potencial entre el filamento y el ánodo λ= 0.005-0.003 nm
- Lentes condensadoras (condensador): Enfocan el haz de electrones sobre la muestra
- Lente objetivo (objetivo), lente intermedia y lente proyectora (ocular):
- Aumentan la imagen (1.000-300.000 X)
- Enfocan el haz de electrones sobre pantalla recubierta de cristales de fósforo que al ser bombardeados por el haz de electrones emiten luz visible)
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION
Convencional: 0.1 MV
Alto voltaje: 3 MV
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (Scanning) MES
• Útil para examinar la superficie de pequeños
organismos, células y orgánulos.
• Comparte algunas características con el MET
(cañón de electrones, lentes magnéticas).
• Sin embargo, su modo de funcionamiento es
muy diferente: El haz de electrones no atraviesa la muestra.
• En el MES un cañón produce un haz de
electrones que, mediante lentes condensadoras, es enfocado sobre un punto de la superficie de la muestra.
• Mediante deflectores (placas cargadas que
atraen o repelen el haz de electrones) se desplaza el haz de electrones haciendo barridos de la superficie de la muestra.
• Los electrones al impactar excitan las
moléculas de la muestra, desprendiéndose electrones secundarios que son detectados para formar una imagen de la superficie en un tubo de TV.
• También se trabaja en vacío.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN
• Requerimientos de las muestras:
4 finas
4 deshidratadas
4 no volátiles
• Tipos de muestras/preparaciones más frecuentes:
4 Cortes ultrafinos: análisis de la ultraestructura celular
4 Criofractura: estudio de partículas intramembranosas
4 Sombreado metálico y contraste negativo: estudio en ME de
proteínas, virus, etc.
CORTES ULTRAFINOS: Fijación: Se han de usar fijadores No coagulantes.
ALDEHIDOS: Buenos fijadores de proteínas (cross-linking). Fijadores primarios
* Formaldehido: gas. (1 grupo aldehido reactivo). Penetración rápida. Fijación lenta.
Formol (solución acuosa 37-40% en peso del gas en agua)
Paraformaldehido (polímero sólido).
* Glutaraldehido: 2 grupos aldehido reactivos.
Buena conservación ultraestructural. Endurece mucho.
Penetración lenta. Fijación rápida
* Mezclas tipo"Karnowsky": Paraformaldehido + Glutaraldehido en PB 0.1M
Concentraciones variables de GA y PFA:
1%GA+1%PFA 0.5%GA+2.5%PFA 0.1%GA+4%PFA
Necesidad de fijar los lípidos:
TETRAOXIDO DE OSMIO: Fija los lípidos y someramente las proteínas.
- Oxidación de dobles enlaces de los lípidos.
- Penetración pobre (0.5-1.0 nun). Fijación rápida.
- Empleado como fijador secundario (postfijación) tras fijación inicial con aldehidos.
- Además, el Os es un metal pesado que da contraste a las estructuras a las que se une (membranas).
CORTES ULTRAFINOS: Inclusión
- Propiedades de Secciones para ME:
Muy finas
Deshidratadas
Estables bajo el haz de electrones
- Inclusión en RESINAS EPOXY:
4 resinas monoméricas fluidas
4 se infiltran en los tejidos a temperatura ambiente
4 polimerizan con calor dando un bloque duro
Deshidratacion: Etanol o acetona: 30% 50% 70% 90º 100%
Baño intermediario: Óxido de Propileno
Infiltración con resina
Polimerización en estufa 60ºC
CORTES ULTRAFINOS: Montaje en rejillas
Rejilla de
mesh
Rejilla de ojal
(formvar)
CRIOFRACTURA
- Congelación de la muestra con nitrógeno líquido.
- Fractura. Se produce por las zonas de menor resistencia. Si hay membranas, se fracturan por el centro hidrofóbico de la bicapa lipídica.
- Metalización de la superficie de fractura con platino vaporizado. Se realiza con un cierto ángulo.
- Recubrimiento con una fina película de carbón.
- Eliminación de la muestra. Queda el molde o réplica de la muestra.
- Análisis de la muestra con el microscopio electrónico de transmisión.
