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PRÁCTICA No. 2 INSULINA Y DIABETES
Es vital para la regulación de los niveles sanguíneos de glucosa porque capacita a las células corporales para transportar glucosa desde el torrente circulatorio. La glucosa absorbida puede entrar a las células (generalmente en las hepáticas o musculares) donde se utiliza su exceso para formar glucógeno. Se estima que el 75% de la glucosa que se ingiere en una comida es almacenada en esta forma. Como se considera a los humanos “comedores discontinuos”, esta producción de glucógeno tras una comida asegura que existirá glucosa disponible varias horas después de la ingesta. El organismo tiene que mantener un cierto nivel de glucosa en sangre para mantener la homeostasis. Cuando los niveles de glucosa en sangre producen entonces glucagón. La función de esta hormona es escindir el glucógeno almacenado en glucosa, para ser liberada a la sangre.
Cuando el páncreas no produce insulina conduce a la diabetes mellitus tipo I. Cuando el páncreas sí produce insulina, pero el organismo no responde a ella, el resultado es la diabetes mellitus tipo II. En ambos casos, la glucosa permanece en la sangre, incapaz de ser incorporada por las células del organismo para ser utilizada como principal combustible para el metabolismo. El exceso de glucosa sanguínea es entonces filtrado por el riñón. Como la recaptación de la glucosa filtrada implica un número finito de receptores en las células renales, parte del exceso de glucosa no será reabsorbida hacia el organismo y, en su lugar, se perderá con la orina. La ausencia de insulina para el transporte de glucosa también afecta al músculo y tiene como resultado el catabolismo proteico de las células, de forma que los aminoácidos liberados pueden formar glucosa en el hígado. Esta acción expone al organismo a un equilibrio negativo respecto al nitrógeno, debido al agotamiento proteico y al consumo tisular resultante. Este trastorno también está asociado a una deficiente resistencia a las infecciones.
En el siguiente experimento se estudiarán los efectos del tratamiento con insulina
sobre la diabetes tipo I. El experimento está dividido en dos partes. En la parte I se
Figura 2.1 Pantalla de inicio del experimento de Insulina y Diabetes, parte 1. En el lado derecho de la pantalla que aparece hay un espectrofotómetro el cual es un equipo de investigación muy utilizado en biología. Se usa para medir las cantidades de luz de diferentes longitudes de onda absorbidas y transmitidas por una solución coloreada. En el interior del espectrofotómetro hay una fuente de luz blanca, que es escindida en varias longitudes de onda (colores) por un prisma. El usuario selecciona una longitud de onda y la luz de este color se hace pasar a través de un tubo o cubeta, que contiene la muestra a ensayar. (Para este experimento, la fuente de luz de espectrofotómetro se preseleccionará a una longitud de onda de 450 nm). La luz transmitida por la muestra pasa a un tubo fotoeléctrico que convierte la energía luminosa en una corriente eléctrica. La corriente es medida. Alternativamente, la luz puede ser medida antes de que la muestra se coloque en su trayectoria, y después puede medirse la cantidad de luz absorbida (densidad óptica). Utilizando cualquiera de los métodos, el cambio en la transmitancia luminosa o la luz absorbida, se puede medir la cantidad de una determinada sustancia en la muestra a ensayar. En la parte II se usará el espectrofotómetro para determinar cuánta glucosa hay en muestras de sangre que se habrán tomado de dos ratas. Pero antes se obtendrá una curva estándar de glucosa, de forma que se tenga un punto de referencia para convertir las lecturas de densidad óptica en lecturas de glucosa (mg/dl). Para esto se preparan cinco tubos de ensayo que contengan cantidades conocidas de glucosa: 30, 60, 90, 120 y 150 mg/dl, respectivamente. Se determinará en el espectrofotómetro, las lecturas de densidad óptica correspondientes a cada una de estas cantidadesconocidas de glucosa.
En la pantalla también hay tres botellas cuentagotas, un lavador de tubos de ensayo, un aparato distribuidor de tubos de ensayo (sobre el lavador) y una unidad incubadora de tubos de ensayo.
1.- Arrastrar el tubo de ensayo (de encima del lavador de tubos de ensayo) a la ranura 1 de la unidad de incubación. Se verá ascender otro tubo de ensayo del aparato distribuidor. Arrastrar este segundo tubo de ensayo hasta la ranura 2 de la unidad de incubación. Repetir esta operación hasta haber arrastrado un total de
cinco tubos de ensayo a las 5 ranuras de la unidad de incubación.
2.- Pulsar sobre el tapón cuentagotas de la botella de Glucosa Estándar. Arrastrar el tapón sobre el tubo No. 1 y verter la glucosa. Se verá que cae una gota de la solución glucosada en el tubo y que eltapón vuelve automáticamente a su botella.
3.- Repetir el paso 2 con los 4 tubos restantes. Observar que cada tubo recibirá automáticamente una gota adicional de glucosa estándar.
4.- Añadir Agua Desionizada al tubo No. 1 (automáticamente se añaden 4 gotas).
5.- Repetir el paso 4 con los tubos 2, 3 y 4. Notar que cada tubo recibirá una gota menos de agua que el anterior.
6.- Mezclar, en unidad de incubación para agitar el contenido de los tubos.
7.- Centrifugar. Los tubos descienden a la unidad de incubación y serán centrifugados. Durante la centrifugación, los tubos giran alrededor de un punto central a una velocidad elevada, de forma que cualquier partícula de materia del tubo se posará en su parte inferior, formando el sedimento.
8.- Cuando los tubos vuelvan a la superficie, eliminar el sedimento ( Remove Pellet ).
9.- Añadir al tubo 1 el Reactivo Enzimático para Colorear ( Enzyme-Color Reagent ). Se añaden 5 gotas.10.- Repetir el paso 9 con los tubos restantes. 11.- Incubar. Los tubos descienden a la unidad de incubación donde serán agitados para mezclar completamente el reactivo de color en el tubo, se incubarán y volverán a la superficie.
12.- Ajustar ( Set Up ) del espectrofotómetro. Esto calienta el instrumento y lo deja listo para usarse. Ajustar también incluye fijar el punto “cero”, de forma que el espectrofotómetro leerá exactamente la cantidad de material contenido en cada tubo.
13.- Arrastrar el tubo 1 al espectrofotómetro justo encima del botón Ajustar.
14.- Analizar. Aparecerá un punto en la pantalla y los valores aparecerán en los indicadores deDensidad Óptica y Glucosa.
Figura 2.2 Pantalla de inicio del experimento de Insulina y Diabetes, parte 2.
En este experimento se inyectará solución salina a la rata control y aloxona a la experimental. Tras la administración de solución salina y de aloxona, se obtendrán muestras de sangre de las dos ratas. Se inyectará, entonces, a ambas con insulina y se obtendrá de nuevo muestras de sangre. Finalmente se analizarán todas las muestras en el espectrofotómetro para comparar las cantidades de glucosa presente en ellas. 1.- Arrastrar la jeringuilla de Solución Salina hasta la rata Control e inyectarla. 2.- Arrastrar la jeringuilla de Aloxona hasta la rata Experimental e inyectarla. 3.- Colocar un tubo de ensayo nuevo (del aparato distribuidor) sobre el rabo de la rata Control. Se observará que caen tres gotas de sangre desde el rabo al tubo. A continuación arrastrar el tubo hasta el soporte No. 1 de la unidad de incubación de tubos de ensayo. 4.- Arrastrar otro tubo nuevo sobre el rabo de la rata Experimental para obtener 3
gotas de sangre. Colocar el tubo en el soporte No. 2. 5.- Arrastrar la jeringuilla de Insulina hasta la rata Control y aplicársela. 6.- Repetir el paso 5 con la rata Experimental. 7.- Repetir de nuevo los pasos 3 y 4, obteniendo muestras de sangre de cada rata y colocándolas sobre los soportes No. 3 y 4. 8.- Obtener Reactivos de encima del estante que muestra las jeringuillas. Las jeringuillas y las ratas desaparecerán y, en su lugar, se verán cuatro botellas cuentagotas. 9.- Aplicar Agua Desionizada en el tubo No. 1. Se verá que se vierten al tubo 5 gotas de agua. El agua se añade para que todos los tubos contengan el mismo volumen. 10.- Repetir el paso 9 con los restantes tubos de ensayo. 11.- Añadir 5 gotas de Hidróxido de Bario al tubo No. 1. El hidróxido de Bario se utiliza para aclarar proteínas y células, de forma que se puedan obtener lecturas limpias de glucosa. 12.- Repetir el paso 11 con los restantes tubos de ensayo. 13.- Con el tapón cuentagotas, verter Heparina (anticoagulante) en el tubo No. 1. 14.- Repetir el paso 13 con los con los tubos de ensayo restantes. 15.- Activar Mezclar, de la unidad de incubación. 16.- Centrifugar. Los tubos descenderán a la unidad de incubación y luego volverán a la superficie. 17.- Eliminar sedimento. Se eliminará el sedimento formado durante la centrifugación. 18.- Arrastrar el tapón del Reactivo Enzimático para Colorear hasta el tubo No. 1, verter la enzima. 19.- Repetir el paso 18 con los tubos de ensayo restantes. 20.- Incubar una vez más. 21.- Ajustar el espectrofotómetro. 22.- Activar Gráfica Estándar de Glucosa. Aparecerá en el monitor la gráfica de la parte 1. 23.- Arrastrar el tubo No. 1 al espectrofotómetro. 24.- Activar Analizar. Aparecerá una línea recta horizontal en la pantalla y un valor en el indicador de Densidad Óptica.
Tubo de ensayo No. 2 131 mg/dl de glucosa
Tubo de ensayo No. 3 87 mg/dl de glucosa Tubo de ensayo No. 4 97 mg/dl de glucosa. Comparar los resultados: Dar una explicación de estos resultados. ¿Qué trastorno se ha producido en la rata que se le administró aloxona?
- Oscilaciones o diferencias en los niveles de glucosa.
Dar una explicación de este resultado.
- Esto sucede debido a que esta sustancia tiene un efecto diabetógeno provocando un aumento de la glucemia
¿Cuál es el nivel de glucosa en el tubo 4 comparado con el del tubo 2?
- El del tubo número 4 es más baja la glucosa Dar una explicación de este resultado.
- La sangre que contenía el tubo de ensayo número 4 llevaba insulina la cual tiene un efecto regulador de glucosa de la sangre.
¿Cuál fue el efecto de la administración de insulina sobre el animal control?
- Debido a que este no se le aplicó alaxona pues no tenía un nivel tan elevado de glucosa a diferencia del segundo ratón por lo que al momento de inyectar la insulina no pudo verse un gran descenso de esta variable.
¿Cuál fue el efecto de la administración de insulina sobre el animal experimental?
- A diferencia del ratón al que solo se le administró solución salina, este si tuvo una diferencia marcada en cuanto a los valores de glucosa con alaxona y cuando se le administró insulina, ya que, el valor sin este solución era de 131 mg/dl de glucosa y con la insulina bajó hasta 4 97 mg/dl de glucosa.
