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PRÁCTICA N° 01
BIOSEGURIDAD
DEFINICIÓN:
La bioseguridad es el conjunto de medidas de sentido común a ser adoptadas, con el fin de reducir o eliminar los riesgos para el personal, la comunidad y el medio ambiente, que pueden ser producidos por agentes infecciosos, físicos, químicos y mecánicos. La bioseguridad se realiza en conjunto; el personal que debe cumplir las normas de bioseguridad, las autoridades que deben hacerlas cumplir y la administración que debe dar las facilidades para que estas se cumplan. COMPETENCIAS Conoce y aplica correctamente las normas de bioseguridad para el trabajo experimental. Conoce e interpreta la simbología relacionada con la bioseguridad en el laboratorio de Microbiología. ACTUACIÓN EN CASO DE UN ACCIDENTE LABORAL. En caso de que ocurra un accidente en el ámbito de trabajo, lo ideal es contar con una guía detallada de actuación, un manual de procedimientos. Librar a la persona que sufrió un accidente de improvisar una actuación resulta de suma importancia debido a que no todos podemos superar hechos y tomar decisiones razonables en circunstancias traumáticas. Pasos a seguir:
- Reconocer que surgió un accidente.
- Informar a su supervisor inmediato.
- El supervisor debe: tomar nota de fecha, hora, lugar, nombre y apellido de persona/s involucradas, hacer una breve descripción de lo sucedido.
- Contactarse con la aseguradora de riesgos del trabajo y derivar al hospital para comenzar tratamiento preventivo y análisis.
- Con respecto a la herida, dejar sangrar y lavar con abundante agua y jabón.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
- Las áreas en las que exista riesgo biológico deben estar perfectamente señalizadas y con avisos de advertencia para el ingreso exclusivo al personal autorizado.
- Es imprescindible el uso de guardapolvo en el laboratorio.
- Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
- No ingerir o guardar cualquier tipo de alimento o bebida en el local del laboratorio, sobre todo en los refrigeradores donde se guardan muestras infecciosas, cultivos de microorganismos, agentes químicos o soluciones.
- No fumar ni maquillarse en los ambientes del laboratorio.
- Manipular las muestras biológicas con guantes. No llevarse las manos a la cara, los ojos, ni la boca durante el trabajo, para evitar la autoinoculación.
- No llevarse objetos a la boca.
- Prohibir el pipeteo bucal. Utilizar pipetas automáticas o emplear peras de goma u otro dispositivo similar.
- Cambio de guantes según lo requiera el trabajo y en caso de accidente.
- Al finalizar cualquier tipo de actividad y durante su estancia en el laboratorio, lavarse bien las manos de manera frecuente.
- No extraer el vestuario del laboratorio sin antes descontaminarlo.
- Usar equipos de protección cuando el trabajo lo requiera (careta, respirador, gorro, gafas protectoras, etc.).
- Desinfectar el área de trabajo antes de comenzar su labor.
- Mantener el laboratorio limpio y retirar de este cualquier material que no tenga relación con el trabajo.
- Mantener las puertas cerradas durante el trabajo.
- En caso de derramamientos accidentales se debe informar inmediatamente al docente y se procederá a abandonar el área y esperar un lapso de tiempo antes de limpiar con agua y detergente, y proceder posteriormente a la desinfección de la superficie sobre la que tuvo lugar.
- Establezca la diferencia entre: Limpieza, Desinfección, Esterilización y Eliminación.
- Esquematice los símbolos de Bioseguridad en el laboratorio, no incluidos en la presente guía. SÍMBOLOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
LAVADO DE MANOS
Debe ser ejecutada de inmediato, antes y después de cada procedimiento y del contacto con el paciente. Se debe usar: Jabón neutro de preferencia liquido. Jabón con detergente anti- microbiano o con agente ante-sépticos en situación específica (brote epidémico, procedimiento invasivo, unidades de alto riesgo). Secuencia de la Técnica del lavado de manos: o Subirse las mangas hasta los codos. o Retirar reloj y alhajas. o Mojarse las manos con agua. o Aplicare 3 a 5 ml de jabón. o Friccionar la superficie de la palma de la mano y puño durante 10- 15 segundo. o Enjuagar con agua de arrastre. o Secar con toalla de papel. o Cerrar la llave con la toalla. EL GUANTE NO REEMPLAZA AL LAVADO DE MANOS
PRÁCTICA N° 2
MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio de Microbiología, especialmente en el desarrollo de las prácticas es esencial la utilización de instrumentos y equipos para el manejo de sustancias químicas y biológicas para lo cual existe una serie de instrumentos diseñados para facilitar el trabajo en el laboratorio, así como hacerlo seguro y práctico. Por tal razón se hace necesario de que antes de la realización de un trabajo experimental el alumno conozca tanto el material como los equipos a utilizar en el laboratorio de Microbiología, la función y utilidad de de cada uno de ellos así como su correcta manipulación para reducir el riesgo de accidentes en el laboratorio. COMPETENCIAS Reconoce el material de uso en el laboratorio de Microbiología y adquiere habilidad en el manejo del mismo. Reconoce equipos de uso en el Laboratorio de Microbiología, aprende su uso, calibración y cuidado. Prepara y/o acondiciona el Material de Laboratorio de Microbiología para su esterilización. Material de Vidrio Embudo de vidrio Es un instrumento empleado para canalizar líquidos y materiales sólidos granulares en recipientes con bocas estrechas. Es utilizado en el filtrado de sustancias. Vaso de Precipitación Recipiente cilíndrico de vidrio fino que se utiliza muy comúnmente en el laboratorio, sobre todo, para preparar o calentar sustancias y traspasar líquidos. Probetas graduadas Son recipientes cilíndricos, graduados, de vidrio grueso, de boca ancha, abierta y con pico, y las hay de distintos volúmenes. Es un instrumento volumétrico, que permite medir volúmenes considerables con un ligero grado de inexactitud. También sirve para contener líquidos.
Matraz de Erlenmeyer Son recipientes de vidrio de forma cónica, base ancha y cuello angosto. Tienen muchas aplicaciones, por ej. En volumetría para hacer titulaciones, facilitando una mejor agitación del líquido y evitando pérdidas por salpicaduras. Para preparar soluciones y medios de cultivo. Tubos de ensayo Son tubos de vidrio de diferentes anchos y longitudes. Tienen forma cilíndrica y es utilizado para contener muestras líquidas, realizar reacciones bioquímicas y calentar sustancias. Láminas Porta objetos Es una fina placa de cristal sobre el cual se disponen objetos para su observación en el microscopio, ya sea en fresco o coloreadas. Laminillas cubre objetos Son finas laminillas de vidrio, de forma cuadrada, sirven para cubrir muestras frescas para la observación microscópica. Mechero de Alcohol Los mecheros de alcohol son de uso corriente en el laboratorio; se emplean para temperaturas no muy elevadas. Sirve para calentar sustancias utilizando como combustible alcohol o ron. Se utiliza para mantener un ambiente de esterilidad y evitar la contaminación de los medios de cultivo. Placas de Petri Es un recipiente circular, de cristal, con una cubierta de la misma forma que pero de mayor diámetro, para un cierre no hermético. Son de diversos tamaños y se utilizan para colocar medios de cultivo sólido. Pipetas graduadas Son tubos cilíndricos, estrechos con un extremo terminal cónico graduadas en ml. Se emplean para medir cantidades variables de líquido. Pueden ser terminales , cuando la medición se realiza hasta la punta o no
Trípode Se utiliza cuando no se tiene el soporte universal para sostener objetos con firmeza. Su principal uso es como herramienta de sostén a fin de evitar el movimiento. Sobre la plataforma del trípode se coloca una malla metálica para que la llama no dé directamente sobre el vidrio y se difunda mejor el calor. Mechero Bunsen Utilizado para esterilizar, calentar muestras y sustancias químicas. Constituido por un tubo vertical que va enroscado a un pie metálico con ingreso para el flujo de gas, el cual se regula a través de una llave. En la parte inferior del tubo vertical existen orificios y un anillo metálico móvil o collarín también horadado, los cuales permiten regular el flujo de aire que aporta el oxígeno necesario para llevar a cabo la combustión . Espátulas Es una lámina plana angosta que se encuentra adherida a un mango de madera o metal. Se utiliza para tomar pequeñas cantidades de sustancias o compuestos químicos que van a ser pesados. Asas Bacteriológicas Están constituidas por una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en aro o en punta, este instrumento de laboratorio nos ayuda transportar o trasplantar microorganismos de un medio a otro, así como para la realización de frotis. Asas Micológicas Está formada de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento más grueso que el asa bacteriológica termina en un ángulo de 45º o forma de “L”, este instrumento de laboratorio nos ayuda transportar o trasplantar hongos de un medio a otro medio para su adecuado desarrollo, así como para la realización de frotis.
Equipos de Laboratorio Microscopio Es un equipo constituido básicamente por un conjunto de lentes superpuestos que nos permite visualizar directamente, por el aumento de la imagen, cuerpos no visibles al ojo humano. Balanza analítica Son instrumentos de precisión, utilizados para pesar los medios de cultivos y reactivos que se preparan en un laboratorio de Microbiología. Baño María Equipo de laboratorio de Clínico, fabricado en acero inoxidable, utilizado para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua llevar con el fin de mantener una muestra a una temperatura específica. Por regla general se utilizarán 37°C para reacciones enzimáticas. Incubadoras Equipos indispensables en la sección de bacteriología, por lo general son de acero inoxidable. Se utilizan a una temperatura de 37ºC para realizar cultivos de bacterias, hongos a una temperatura similar a la del cuerpo humano. Horno esterilizador También llamado “Horno Pasteur” o “estufa Poupinel”; es un equipo utilizado para esterilización a calor seco (por corrientes de aire caliente). El vapor saturado es el método de esterilización por excelencia y la opción de referencia para esterilizar material inerte que tolera las altas temperaturas. Tabla de relación Temperatura-Tiempo en el Horno Pasteur Autoclave Equipo fijo de acero inoxidable, que se emplea para la esterilización de material de laboratorio empleando calor húmedo. Es un medio en el que se emplea vapor saturado para producir hidratación, coagulación e
Contador de colonias Equipo utilizado para el recuento de colonias bacterianas y mohos en placas de cultivo con agar. Se utilizan para estimar la densidad de microorganismos en un cultivo líquido. Una dilución adecuada, o varias diluciones en serie dentro del rango estimado apropiado, los cuales han sido propagados mediante técnicas de siembra estériles a una placa con medo de cultivo. Conservadoras y congeladoras Equipos de refrigeración, cuya utilidad es la mantención o conservación de los medios de cultivos a temperaturas para de entre 4 – 8 °C. La temperatura ideal de congelación para conservación es a - 20°c. Cabinas de bioseguridad Equipo para manipular muestras biológicas bajo una atmósfera microbiológicamente controlada. Gabinete de seguridad biológica con ventana frontal deslizable y alarma que indica el nivel de apertura de la ventana. Flujo de aire vertical y recirculación de aire filtrado. De acero inoxidable. Con filtros absolutos de eficiencia del 99.99% (HEPA) y retención de partículas de 0.3 micras. Con llave para toma de oxígeno. Se utiliza para la manipulación de muestras biológicamente infecciosas, evitando la contaminación de la misma así como de operador. Jarra de anaerobiosis (Jarra de Brewer) Fabricada en policarbonato de alta transparencia que facilita el control de las placas con soporte acero inoxidable en su interior. Recipiente ideal para realizar incubaciones en anaerobiosis ya que en su soporte de acero inoxidable se pueden instalar las bolsas de generación de atmósfera libre de oxígeno. pH metro Es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentración de protones. Vortex El agitador vórtex para tubos está diseñado para mezclar de modo intenso células de bacterias y hongos, permitiendo la homogenización de suspensiones celulares. Centrífugas Son equipos rotatorios, utilizados en los laboratorios clínicos y otros, para la separación de los solutos y sus solventes mediante el aprovechamiento de la fuerza centrífuga.
Balanza analítica Baño María Incubadora Horno Pasteur Autoclave Conservadora Contador de colonias Jarra de Brewer pH metro
Criterios a considerar para el correcto uso, conservación y control de calidad de los equipos de Laboratorio de Microbiología. Los equipos de Laboratorio deberán encontrarse fijos en lugares específicos dentro del laboratorio, sobre superficies niveladas y resistentes, evitando su movilización debido a que esto puede causar su descalibración y/o accidentes. Deben estar conectadas a fuentes de energía estables, ya que los cambios bruscos de tensión eléctrica pueden afectar su funcionamiento y/o dañarlos. Debe realizarse periódicamente la limpieza de ellos, para lo cual éste no debe encontrarse en funcionamiento y siguiendo las especificaciones técnicas del fabricante. El personal responsable del Laboratorio deberá realizar la “Programación anual para mantenimiento preventivo” de los diversos equipos para verificar que se encuentren en óptimas condiciones de funcionamiento. Cada uno de los equipos deberá contener en lugar visible las correctas instrucciones de encendido y uso del equipo. Los equipos de incubación, conservación y congelación deberán contener una hoja de registro de temperaturas en un lugar visible, el cual deberá ser llenado diariamente por el personal al momento del ingreso y salida del Laboratorio. Los equipos de esterilización: a calor seco (horno Pateur) y Autoclave deberán tener un registro de control de ciclos de esterilización y autoclavado de material, el cual deberá ser llenado cada vez que se utilice el equipo. Así mismo deberán utilizarse indicadores químicos o biológicos que permitan la verificación de un adecuado proceso de esterilización. Cuestionario
- ¿Cuantos tipos de cabinas de Bioseguridad existen y cuál es la aplicación de cada una de ellas?
- Defina: Limpieza, Desinfección, Esterilización, Descontaminación, Eliminación y establezca la importancia de cada una de ellas.
- Realice un esquema de la adecuada distribución de los ambientes un laboratorio de Microbiología.
- Indique qué equipos de microbiología automatizados y semiautomatizados existen en la actualidad en el laboratorio de microbiología y en qué consiste su funcionamiento.
- Mencione otros equipos de uso en el laboratorio de Microbiología,
PRÁCTICA N° 3
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS: MANEJO, USO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO
INTRODUCCIÓN
Los organismos vivos pueden ser unicelulares o multicelulares. La mayoría de las células no son visibles a simple vista. Para observar y estudiar las células y los tejidos, se usan diferentes tipos de microscopios. El microscopio de disección, se utiliza para el estudio de objetos relativamente grandes, de aproximadamente 0.05 a 20 milímetros. Los microscopios electrónicos, son utilizados para el estudio de objetos muy pequeños, hasta menos de un nanómetro (1 nanómetro = 0,000000001 metros. Es decir, es la mil millonésima parte de un metro, o millonésima parte de un milímetro. 1 milímetro = 1.000.000 nanómetros). El microscopio compuesto, se utiliza principalmente para el estudio de objetos de aproximadamente uno a 2000 micrómetros (μm), aunque se pueden ver cosas aún más pequeñas con el empleo de técnicas especiales. En el microscopio compuesto, la propiedad de hacer que las imágenes de las cosas se vean más grandes se conoce como ampliación o magnificación, y la capacidad de distinguir detalles entre dos puntos muy cercanos se conoce como poder de resolución o poder de separación. El poder de resolución determina los límites prácticos a los que puede ser llevada la ampliación de la imagen. La resolución es más importante que la ampliación, debido a que es indispensable observar con claridad los detalles finos. El poder de resolución máximo de un buen microscopio óptico de laboratorio, es aproximadamente 0, 25 μm. El poder de resolución del ojo humano es de 0,25 mm. El microscopio compuesto es un instrumento valioso en el laboratorio de Biología: con el que se obtienen imágenes dimensionales del objeto observado al ser atravesado por la luz mirando a través de los oculares: de un lado el microscopio provee aumento y permite ver detalles de objetos tan pequeños que no son visibles a simple vista (menores de 0.1 mm). El estudio de células vivas, se realizan en preparaciones frescas de organismos o células en su estado natural. Se utilizan colorantes vitales que no hacen daño durante el corto tiempo que se analizan. Las preparaciones frescas son muy fáciles de hacer, se prepara una disolución acuosa donde se introducen los microorganismos, se pone una gota en un porta objetos, se tapa con una laminilla cubre objetos y se observa al microscopio. El estudio de células muertas, pasa por proceso de fijación y coloración. Las preparaciones fijadas y teñidas son las más utilizadas, la fijación conserva las células y tejidos en un estado lo más parecido posible en morfología y composición química al estado vivo, y la tinción facilita la visualización de la morfología y estructura interna de las células y tejidos. Por otra parte, es necesario conocer el significado de las unidades de medición para entender la importancia de los resultados de experimentos y expresarlos correctamente. En este sentido, se utilizan oculares micrométricos y micrómetros de platina para calibrar los microscopios. La presente practica pretende que el estudiante se familiarice con el manejo del microscopio compuesto, a la vez que observa células y microorganismos, y utilice algunos colorantes para diferenciar estructuras; además, aplicará una técnica sencilla para medir algunos objetos bajo el microscopio compuesto.
PROCEDIMIENTOS
EXPERIENCIA 1: ESTRUCTURA, MANEJO, USO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO
FOTONICO.
SISTEMA MECÁNICO: Comprende los siguientes dispositivos
- Base: da soporte y estabilidad
- Columna o brazo: Sostiene los oculares y objetivos
- Platina: Superficie para colocar la lámina portaobjeto.
- Ajuste mecánico de la platina: Ajusta y mueve el porta objeto para su exploración.
- Revólver: Anillo que gira sobre su eje, contiene los objetivos de diferentes aumentos
- Cabezal: Contiene los oculares.
- Anillo de enfoque del ocular izquierdo: Se usa para compensar la diferencia de visión que existe entre los dos ojos
- Ajuste de distancia interpupilar: Adapta la distancia lateral de los oculares según la distancia de los ojos del observador
- Tornillo macrométrico: Sirve para hacer ajustes gruesos, para subir y bajar la platina rápidamente; se usa solamente con los objetivos de 4x y 10x.
- Tornillo micrométrico: Sirve para hacer ajuste fino, para subir y bajar la platina muy lentamente; se usa con todos los objetivos para perfeccionar el enfoque de la imagen
- Cordón eléctrico: Conecta el microscopio a la fuente de energía eléctrica
- Interruptor: Enciende y apaga la lámpara de luz SISTEMA ÓPTICO: Comprende los lentes oculares, los lentes objetivos y los dispositivos de iluminación.
- Oculares: El microscopio binocular, tiene dos lentes oculares; el aumento puede ser de 6x, 10x, 15x y 20x; para determinar la magnificación de la imagen que se observa a través del microscopio, multiplica la magnificación de los oculares por la del objetivo en uso.
- Objetivos: Lentes principales del microscopio; son parafocales, pues al cambiar de un objetivo a otro, la imagen queda casi en foco y sólo es necesario un leve ajuste; en este caso, hay tres objetivos:
- Rastreo: cuatro magnificaciones o 4x
- Baja potencia: 10x
- Alta potencia: 40x
- Objetivo de inmersión: son aquellos que usan aceite de cedro entre la lente frontal y el objeto a observar. Son los más poderosos y hacen que la imagen de los objetos se vea 100 veces más grandes SISTEMA DE ILUMINACIÓN: Comprende dispositivos que regulan la intensidad de iluminación.
- Condensador: Lente que condensa la luz en el plano de la laminilla
- Tornillo para ajuste del condensador: Sirve para subir y bajar el condensador; para nuestro uso el condensador debe estar un poco por debajo de su posición más alta
- Diafragma: Sirve para controlar el diámetro del cono de luz que llega al objetivo, no para controlar la intensidad de iluminación; al disminuir la apertura del diafragma se aumenta el contraste y la profundidad de foco, pero se disminuye la resolución; para lograr la mejor imagen posible es necesario cambiar la apertura del diafragma al cambiar el objetivo
- Lámpara de iluminación: Proporciona la luz que llega al objeto por estudiar y el sistema óptico del microscopio
- Filtro azul: Absorbe el exceso de luz roja y amarilla del iluminador para que la iluminación sea más similar a la luz natural MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
- Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.
- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
- Comenzar la observación con el objetivo de 4 aumentos (4x) o colocar el de 10 aumentos (10x), y seguir cambiando a más aumentos, si el análisis de la preparación lo requiere.
- Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Luego, mirando, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando la imagen de la muestra se observe nítida, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
- Si se quiere observar la muestra a mayores aumentos, pasar al siguiente objetivo, girando solamente el revólver. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino.
- Solamente cuando se usa el objetivo de inmersión (100x), debe usar aceite de inmersión. Este aceite se coloca entre la muestra y la lente frontal del objetivo. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO El microscopio es un equipo óptico de alta precisión y como tal debe ser tratado con mucho cuidado tanto en el aspecto mecánico como óptico. La inspección del microscopio antes de su uso y la limpieza después de su uso son hábitos que contribuyen a la buena conservación de este equipo.
