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Microbiología industrial o biotecnología microbiana es el ámbito de la microbiología orientado a la producción de elementos de interés industrial mediante procesos en los cuales intervenga, en algún paso, un microorganismo.
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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Producción y cuantificación de Penicilina V por distintas cepas de Aspergillus nidulans
La penicilina es un antibiótico producido a nivel industrial por el hongo Penicillium chrysogenum , del cual se han conseguido cepas superproductoras mediante ciclos de mutación-selección, así como por la modificación del medio y de las condiciones de cultivo. No obstante, existen determinadas especies de Aspergillus , como A. nidulans , que también producen penicilinas, aunque aún no se utilizan a nivel comercial. Debido a que su manipulación genética es más sencilla y a un mayor conocimiento de su genoma, estas cepas están siendo utilizadas como modelo para el estudio de la ruta biosintética de las penicilinas, con el objetivo final de mejorar su productividad. Una de las penicilinas producidas en condiciones naturales es la benzil penicilina o penicilina G, que es producida por el hongo sin la adición de precursores y que tiene como cadena lateral el ácido fenilacético. La adición al medio de cultivo de precursores de la cadena lateral, tales como el ácido fenoxiacético, conlleva que durante el proceso de biosíntesis de penicilina se forme la penicilina V (fenoximetilpenicilina), que fue la primera penicilina biosintética obtenida y que es estable a pH ácido. Las penicilinas más utilizadas actualmente son las denominadas semisintéticas, que tienen como estructura básica el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), obtenido a partir de penicilinas naturales o biosintéticas, y al que se unen artificialmente distintas cadenas laterales. Las penicilinas semisintéticas presentan entre otras ventajas clínicas, un mayor espectro de acción, una mejor absorción a través del tubo digestivo y una mayor resistencia a las -lactamasas.
El objetivo de la práctica es estudiar la producción de penicilina V en cuatro cepas de Aspergillus nidulans : R- 21 (cepa silvestre), B- 13 (cepa mutante) y E- 21 (cepa mutante). Distribución de las cepas por mesa de trabajo: Aspergillus nidulans R- 21 Aspergillus nidulans R- 21 Aspergillus nidulans B- 13 Aspergillus nidulans E- 21 Aspergillus nidulans B- 13 Aspergillus nidulans E- 21 Aspergillus nidulans B- 13 Aspergillus nidulans E- 21 Aspergillus nidulans B- 13 Aspergillus nidulans E- 21
Medio de cultivo ▪ Agar nº 3 Oxoid: 15 g ▪ Caldo de triptona-soja (Sigma): 30 g ▪ Extracto de levadura (Sigma): 1 g ▪ Agua destilada: 1 L .
1. Esterilizar en autoclave y cuando el medio esté a 60 °C aproximadamente añadir la cepa indicadora termófila Geobacillus stearothermophilus. 2. Verter en placa Petri grande. Hacer pocillos en el agar con sacabocados (pipeta Pasteur) e
*Placas Petri se os entregarán preparadas. Debéis hacer los pocillos para inocular el sobrenadante. VIDEO : realización placas Petri y pocillos (carpeta de prácticas). Además, se realizará como control un bioensayo con concentraciones crecientes de Penicilina V ( 2 .5, 1, 0. 5 , 0. 1 , 0.0 5 y 0.01 mg/ml). *Debéis preparar los patrones de penicilina.
3. Incubar las placas de bioensayo a 55 °C para ver al día siguiente la presencia de halos de inhibición. *Sellar la placa con cinta termorresistente. 4. Medir el tamaño de los halos con una regla. 5. Finalmente, realizar una curva patrón de penicilina V representando en el eje Y el log [penicilina V] en mg/ml y en el eje X, el diámetro en cm del halo de inhibición. Con esta curva patrón se determinará la concentración de penicilina V producida por cada cepa.
Concentración de Penicilina V (μg/ml) Ø halo de inhibición (mm) 2 , 5 1 0, 0, 0, 0,
Ø halo de inhibición (mm) Concentración Penicilina V (μg/ml) A. nidulans R- 21 A. nidulans B- 13 A. nidulans E- 21
Detección de actividades bioquímicas en bacterias
Algunos microorganismos producen enzimas capaces de degradar moléculas complejas tales como polisacáridos, proteínas o lípidos. Estas enzimas son secretadas al medio de cultivo (extracelulares), produciendo la rotura de sus respectivos sustratos vía hidrólisis. Las polisacaridasas (amilasas, celulasas, xilanasas, mananasas…) hidrolizan los polisacáridos a azúcares de menor tamaño; monosacáridos, disacáridos y trisacáridos principalmente. Las proteasas degradan proteínas a pequeños péptidos y aminoácidos. Finalmente, las lipasas hidrolizan lípidos generando glicerol y ácidos grasos. La detección de estas actividades se lleva a cabo fácilmente en medios de cultivo sólidos apropiados que contienen el sustrato de la enzima de interés. El análisis comparativo entre microorganismos productores de una determinada actividad enzimática se realiza de forma visual en el medio utilizado, otras veces, se requiere un rápido revelado de la prueba. Los microorganismos con mayor interés biotecnológico producen elevados niveles de la actividad enzimática.
Amilasas:
Obtención de vinagre de bebidas alcohólicas fermentadas (cerveza). Observar bacterias acéticas y levaduras de la flor del vinagre.
El vinagre es un producto resultante de la conversión del etanol de bebidas alcohólicas fermentadas (vino, cerveza, sidra, sake…) en ácido acético por acción de bacterias acéticas, entre las que destacan los géneros Acetobacter y Gluconobacter. Las bacterias acéticas cultivadas en medio agar-etanol-carbonato cálcico forman colonias blancas rodeadas de un halo transparente como consecuencia de la disolución del carbonato cálcico por el ácido acético que producen.
La cerveza es una bebida que se considera con baja carga de microrganismos debido a que se pasteuriza antes de comercializarse. Para elaborar un vinagre de cerveza se vierte el contenido de una botella en un matraz de 2 l. A continuación, se inocula un cultivo puro o mixto de bacterias acéticas manteniendo el matraz abierto a temperatura ambiente (25 oC aproximadamente). Tras 1- 2 semanas de incubación las bacterias acéticas forman la flor del vinagre, indicativo del comienzo de la acetificación de la cerveza.
