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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
MEDIOS DE CULTIVO
Medios de cultivo normalmente indefinidos o naturales ya que no se conoce su composición química exacta. El más utilizado es el medio de caldo común o su versión solidificada con agar. Algunos medios son diferenciales en tanto que inhiben el crecimiento de algunos géneros bacterianos. Otros son medios indicadores de cambios de pH ya que cambian de color al producirse una determinada actividad metabólica.
CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO
1.- AGAR DE McCONKEY: contiene lactosa y un indicador de pH de color rojo neutro
que vira hacia rojo cuando la lactosa es fermentada. Inhibe el crecimiento de las bacterias GRAMPOSITIVAS debido a las sales biliares.
2.- AGAR AL VERDE BRILLANTE (AVB): contiene lactosa, sacarosa y una elevada
concentración de aminoácidos. Rojo de fenol como indicador del pH y verde brillante como inhibidor del crecimiento. ORGANISMOS OXIDATIVOS PRODUCEN AMONIO Y GENERAN UN COLOR ROSA MIENTRAS QUE LOS ORGANISMOS FERMENTATIVOS NO CRECEN O SI LO HACEN GENERAN COLOR AMARILLO.
3.- AGAR DE LOS TRES AZÚCARES E HIERRO (TSI): contiene lactosa, sacarosa,
glucosa, citrato férrico, tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Las bacterias se inoculan en picada para generar condiciones de anaerobiosis y en extensión superficial. FERMENTADORAS GENERAN COLOR AMARILLO (solidificación) Y LAS DATIVAS ROSA EN SUPERFICIE (basificación). BACTERIAS SULFITO REDUCTORAS GENERAN PRECIPITADO NEGRO DE SULFURO DE HIERRO (zona anaerobia)
4.- AGAR EOSINA-AZUL DE METILENO (EMB): medio rico lactosado con dos
colorantes: eosina y azul de metileno, QUE SON INHIBIDORES DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS. E. COLI CRECE CON COLONIAS CON BRILLO VERDE
METÁLICO
5.- CALDO DE UREA-INDOL: medio bastante tamponado que contiene una gran
concentración de urea (2%). Si la bacteria es UREASA POSITIVA genera
amonio (basificación) y vira a amarillo el indicador.
6.- MEDIO PARA CLOSTRIDIOS: medio rico que incluye diversos criterios de
selección para distintos antibióticos y en el que las sulfito-reductoras generan
un precipitado negro de FeS.
7.- AGAR PEPTONA: medio rico con elevada concentración de aminoácidos que es
ideal para organismos proteolíticos. Si se adiciona almidón también sirve para
comprobar la capacidad amilolítica.
8.- AGAR MALTA: medio cuya fuente de carbono es extracto de malta.
Aislamiento de levaduras y esporas. POBRE PARA EL CRECIMIENTO DE
BACILLUS SP. PERO SIRVE PARA IDENTIFICAR ALGUNAS CEPAS.
9.- GELATINA NUTRITIVA: determinación de la actividad gelatinasa por
microorganismos proteolíticos. Contiene extracto de carne y peptona y una
elevada cantidad de gelatina.
ESTERILIZACIÓN
La esterilización se define como la completa eliminación de toda forma de vida o ser acelular de un objeto o un lugar. Como método principal se usa el calor, tanto húmedo como seco.
AUTOCLAVE
Se utiliza para esterilizar medios acuosos mediante calor húmedo. El vapor de agua que contiene esta máquina se calienta hasta alcanzar 121ºC (2 atm) o 111ºC (1, atm)
Una vez preparados los medios se esterilizan a 1 atm de sobrepresión a 121 o^ C durante 15-20 mins salvo en el caso en el que los medios tengan componentes que sufran tal alteración que los haga inadecuados para el crecimiento bacteriano, por ejemplo, en los azúcares usados en los ensayos de fermentación , que se esterilizan a menor presión (0,5 atm a 111 oC).
MATERIAL DE VIDRIO
Calor seco en el horno PASTEUR. Material se envuelven aluminio y se introduce en un contenedor 2 HORAS A 160 O^ C.
PORTAINÓCULOS ESTERILIZADIS AL CALOR DIRECTO DE LA LLAMA DEL MECHERO BUNSEN, que sirve para flambear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc…
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
Siembra: proceso mediante el cual se lleva una porción de una población bacteriana (inóculo) de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento.
ADVERTENCIA: TRABAJAR SIEMPRE PRÓXIMOS A LA LLAMA DEL MECHERO (crea corrientes de convección que genera un campo estéril en la zona próxima).
Instrumento portainóculos más frecuente es el asa de siembra. Se pueden coger inóculos en medio liquido ya que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. En medio sólido se hace un recorrido extenso sobre la superficie salvo en el TSI que hay que realizar la siembra en picado y en extensión superficial.
Se usan pipetas para trasladar grandes volúmenes de inóculos.
FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Fermentación: reacciones de mantenimiento que no requieren de cadena de transporte electrónico, aunque pueden jugar un papel auxiliar.
La capacidad de fermentar azúcares es una características diferenciales en taxonomía.
3.- ELIMINAR EL CRISTAL VIOLETA VOLCANDO EL PORTA Y TRATAR CON LUGOL
DURANRE 1 MINUTO (MORDIENTE) refuerzo de interacción entre colorante y pared celular. 4.- LAVAR CON ALCOHOL POR GOTEO CONTINUADO DURANTE 20-30 s. AÑADIR INMEDIATAMENTE AGUA PARA EVITAR EL ARRASTRE COMPLETO DEL COLORANTEdecoloración diferencial de bacterias Gram- 5.- TRATAR DURANTE 1 MINUTO CON SAFRANINA (COLORANTE DE CONTRASTE) 6.- LAVAR CON AGUA ABUNDANTE, SECAR AL AIRE Y OBSERVAR CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN (100x)Gram- se tiñen de color rojo y Gram+
3. TINCIÓN DE ESPORAS: tinción diferencial en la que se comprueba si la bacteria produce esporas
o no. Se suele utilizar a Bacillus subtilis , que se sabe que forma esporas. Proceso:
1.- SE HACEN 2 FROTIS DE CULTIVOS PROCEDENTES DE MEDIO SÓLIDO Y SE FIJAN
POR CALOR COMO EN LA TINCIÓN DE GRAM
2.- SE COLOCA EL PORTA SOBRE EL TRÍPODE Y SE CUBRE LA PREPARACIÓN CON 3
PAPELES DE FILTRO PREPARADOS
3.- AÑADIR VERDE DE MALAQUITA HASTA QUE LOS PAPELES QUEDEN
EMPAPADOS. SE COLOCA EL MECHERO EN LA BASE DEL TRÍPODE Y SE DEJA
CALENTAR HASTA QUE SE SALGA UN VAPOR BLANQUECINO. MANTENER ESA
EMISIÓN DURANTE 5-7 MINUTOS SIN DEJAR QUE LA MUESTRA SE SEQUEse tiñen las formas vegetativas y las esporas 4.- COGER EL PORTA Y LAVARLO INTENSAMENTE CON AGUA FRÍA HASTA QUE SE OBSERVE MUY POCA COLORACIÓNlavado diferencial del agua arrastra el colorante de las formas vegetativas (interior de esporas se mantiene debido a enfriamiento de envolturas) 5.- SE TIÑEN DURANTE 1 MINUTO CON UN COLORANTE DE CONTRASTE (SAFRANINA)solo tiñe formas vegetativas 6.- DESTEÑIR CON AGUA FRÍA Y DEJAR SECAR AL AIRE. OBSERVAR CON EL OBKETIVO DE INMERSIÓN (100x) ESPORASVERDES FORMAS VEGETATIVASROJO
ANTIBIOSIS
Consiste en la difusión de un determinado compuesto sobre una placa de medio a partir de un punto central. Al absorberse el agua del medio por el papel impregnado se inicia el proceso de difusión del antibiótico por el medio. Esto genera unos halos, en los cuales la concentración de antibiótico es lo bastante alta como para impedir el crecimiento de las bacterias, los cuales tienen bordes bastante definidos y cuyo diámetro varía en función de la concentración de antibiótico del disco y de la sensibilidad de la bacteria
ANTIBIÓTICO ABREVIATURA DOSIS EFECTO INHIBIDOR BACTERIA
PROBLEMA
Cloranfenicol C 30 Síntesis de proteínas Sensible Cefalotina CF 30 Síntesis de peptidoglicano Resistente Tetraciclina TE 30 S. de proteínas Sensible A. Nalidíxico NA 30 Replicación Resistente Eritromicina E 15 S. de proteínas Resistente Estreptomicina S 10 S. de proteínas Intermedio Trimetoprim TMP 5 S. ácido fólico Resistente
El antibiograma es una prueba CUALITATIVA que determina si la bacteria en cuestión es resistente (diámetro inferior a 13 mm), sensible (diámetro mayor de 15 mm) e intermedio (13-15 mm).
En el ENSAYO CUANTITATIVO se representa el diámetro del halo frente al log. de la concentración del antibiótico.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA: concentración necesaria para generar un halo de 15 mm.
ACTIVIDAD CATALASA
Se trata de la determinación de la capacidad de la bacteria en cuestión para degradar el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), el cual es uno de los principales agentes oxidantes producidos como consecuencia de las reacciones metabólicas aerobias.
La enzima catalasa es la encargada de catalizar este proceso y constituye una característica diferencial entre microorganismos aerobios o anaerobios.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
ESPECIES IMPLICADAS:
- Escherichia coli
- Salmonella typhimurium
- Proteus morganii
- Enterobacter aerogenes Se realizaron una serie de diluciones decimales del agua contaminada en solución fisiológica:
1.- RECUENTO DE BACTERIAS TOTALES: extraer 0.1 mL de las diluciones de 10 -5, 10 -4, y 10 -3^ sobre 3 placas de agar común y se incuban a 37 0 C en posición invertida. 2.- DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES: extender 0.1 mL de las diluciones 10-5^ y 10- sobre 2 placas de agar MacConkey. Tras 24 horas se cuentan las colonias rojas y rosáceas y se multiplican por el factor de dilución. Efectuado el recuento se inoculan las colonias rojas en placas de agar EMB. Agar EMB confirma si es E. coli (colonias negras con reflejos verdes metalizados) o Enterobacter (colonias rosáceas y sin reflejos). 3.- DETERMINACIÓN DE SALMONELLA Y PROTEUS : extender 0.1 mL de diluciones 10 -5^ y 10 -4^ en placas de agar verde brillante y se incuban a 37 0 C durante 24-48 horas. Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosas , mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo.
2 H 2O 2 2 H 2O + O 2
