PRACTICAS TABLERO, Ejercicios de Fisiología de las Plantas

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PRACTICAS

DE

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

INDICE

1. MICROPROPAGACIÓN 1.1. Medios de cultivo. 1.1.1. Medio de Cultivo de Murashige y Skoog. 1.1.1.1. Elaboración de Soluciones Madre del medio de cultivo Murashige y Skoog. 1.1.1.2. Preparación del medio de cultivo Murashige y Skoog. 1.1.2. Otros medios de cultivo. 1.2. Establecimiento in vitro. 1.2.1 Asepsia superficial de material vegetal. 1.3. Proliferación 1.3.1. Desarrollo de material vegetal in vitro 1.4. Enraizamiento in vitro 1.5. Aclimatación
2. CULTIVO DE MERISTEMOS 2.1. Microinjerto
3. CULTIVO DE CALLO
4. SUSPENSIONES CELULARES 4.1. Viabilidad de células aisladas
5. EMBIOGÉNESIS SOMATICA
6. SEMILLAS ARTIFICIALES 6.1 Encapsulación en gel de alginato
7. MICORRIZACIÓN CONTROLADA IN VITRO 7.1. Aislamiento y cultivo de hongos micorrícicos 7.2. Plantas micropropagadas 7.3. Inoculación de plantas micropropagadas con hongos ectomicorrícicos
8. BIBLIOGAFÍA

1.1.- MEDIOS DE CULTIVO

Antes de realizar la asepsia del material vegetal que se va a introducir in vitro , es necesario disponer de Medios de Cultivo esterilizados y dosificados en recipientes adecuados. Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento.

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.

Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente gelificante como el agar.

1.1.1.-MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG.

El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) se realiza con las siguientes sustancias:

Macronutrientes mg/L (NH 4 )NO 3 1650 MgSO 4 .7H 2 O 370 KNO 3 1900 KH 2 PO 4 170 CaCl 2 .2H 2 O 440

1.1.1.1.- ELABORACIÓN DE SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG

Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes soluciones Madre:

Soluciones stock de nutrientes: ⁻ Stock de macronutrientes, ⁻ Stock de Calcio, ⁻ Stock de micronutrientes ⁻ Stock de hierro y EDTA,

Soluciones Stock de vitaminas

Soluciones Stock de Reguladores

Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua del volumen final deseado, y sobre ella se van añadiendo uno por uno todos los componentes hasta su completa disolución. Posteriormente se ajusta el volumen final con agua y se almacenan.

Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Vitaminas mg/L myo - Inositol 100 Tiamina HCl 0, Acido nicotínico 0, Glicina 2, 0 Piridoxina HCl 0,

Micronutrientes mg/L FeSO 4 .7H 2 O 27, Na 2 EDTA 37,

H 3 BO 3 6, MnSO 4 .4H 2 O 22, ZnSO 4 .7H 2 O 8, Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0, CuSO 4 .5H 2 O 0, CoCl 2 .6H 2 O 0, KI 0,

g/L Sacarosa 30 Agar 7.

Stock de Macronutrientes MS (x 10) g/L KNO 3 19. NH 4 NO 3 16. MgSO 4 .7H 2 O 3. KH 2 PO 4 1.

Stock de Calcio (x 10) CaCl 2 .2H 2 O 4.

Stock de reguladores de crecimiento. El stock de reguladores de crecimiento se puede hacer a una concentración de 1 mg/

⁻ Soluciónes de IAA de 1mg/ml ⁻ Solución de Kn de 1 mg/ml

⁻ Solución de GA 3 de 1 mg/l ⁻ Solución de BAP de 1mg/l

Las auxinas de pueden disolver primeramente en una pequeña cantidad de etanol al 95%, KOH o NaOH 1 M. Una vez disueltas, se añade agua destilada suavemente, procurando que las auxinas no precipiten, hasta alcanzar el volumen deseado.

De la misma forma. el ácido abscisico se puede disolver previamente en NaOH 1 N y las giberelinas en el atanol al 95%.

Las citoquininas se disuelven previamente en una pequeña cantidad de HCl 0,5 N. Se puede calentar suavemente para favorecer la disolución y posteriormente se enrasa al volumen deseado.

1.1.1.2.- PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG

La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma concentración de algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como los reguladores de crecimiento. Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de carbono de Murashige y Skoog se pueden realizar múltiples medios de cultivo variando los reguladores de crecimiento o su concentración. Por ejemplo, se pueden realizar los siguientes medios de cultivo:

• MS-0: medio MS sin reguladores
• MS-K: MS con 0.3 mg/L de ácido indol-acético y 1 mg/L de kinetina
• MS-R: MS con 1 mg/L de AIB

Para preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso: Colocar en un agitador magnético una jarra de 1 L de capacidad con unos 400 ml de agua destilada y añadir los elementos minerales y las vitaminas:

• 100 ml del stock de macronutrientes.
• 100 ml del stock de Ca,
• 1 ml del stock de micronutrientes,
• 10 ml de la solución hierro EDTA (ó 0.2g/L de secuestrene)
• 10 ml del stock de vitaminas.
• Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de fitohormonas.
• 30 g sacarosa y esperar a que se disuelva.
• Añadir agua destilada hasta un volumen de 1L
• Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pHmetro, el pH del medio (con KOH, NaOH ó HCl) hasta 5.8.
• Añadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en microondas.
• Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar las tapas.
• Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120oC y 1 Kg/cm^2 de presión.
• Dejar enfriar el medio antes de su utilización

Si algún componente fuera termolábil habría que esterilizarlo por filtración con una jeringuilla y un filtro de un tamaño de poro menor de 0.22 μm. Este proceso habría que realizarlo en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril.

plagas. Si el material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar los tratamientos adecuados.

Una vez seleccionado el material vegetal, y previamente a la introducción in vitro, es conveniente someterle a una serie de tratamientos para reducir al máximo los microorganismos superficiales. Por ejemplo se pueden realizar aplicaciones periódicas de fungicidas y bactericidas sistémicos. Algunos microorganismos pueden tener una alta capacidad saprofítica que les permite colonizar rápidamente el medio de cultico e imposibilitar el desarrollo del material vegetal.

El paso previo a la instalación in vitro de un material vegetal es la asepsia superficial. El protocolo de este proceso dependerá de las características del tejido empleado. Para trabajar en condiciones asépticas, es recomendable realizar este proceso en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril. El ambiente debe mantenerse limpio con la superficie de trabajo desinfectada con etanol al 70% antes y después de usarla. Se debe usar bata de laboratorio y lavarse bien las manos.

1.2.1.- ASEPSIA SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL

Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explanto que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas.

Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los siguientes pasos: ⁻ Realizar una asepsia superficial del órgano con etanol al 70 %. ⁻ Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el explanto. ⁻ Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O

Dentro de este grupo de explantos podemos considerar a numerosas semillas y a los embriones.

Como se citó anteriormente, los explantos en contacto con el ambiente exterior han de estar en óptimas condiciones sanitarias gracias a la aplicación regular de productos fitosanitarios. Por ejemplo, para introducir in vitro plantas de patata se colocan tubérculos en una bandeja con papel de filtro humedecido con acaricida, fungicida y bactericida, hasta que se desarrollen pequeños brotes.

Con un material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo:

⁻ Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento activo y de un tamaño ligeramente

superior al deseado. Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en un recipiente con agua destilada.

⁻ Esterilización de los explantos en un recipiente estéril con lejía comercial al 20%, durante

15 minutos.

⁻ Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre papel de filtro para

eliminar el exceso de agua.

⁻ Cortar una pequeña porción del extremo del explanto (por donde se cortó inicialmente) y

clavar verticalmente la parte basal (inferior) en el medio de cultivo.

⁻ Etiquetar los recipientes con un código adecuado que identifique el medio de cultico, el

vegetal y la fecha

⁻ Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o a 25 ºC y 16 h de

fotoperiodo.

Una ver establecido in vitro, es necesario hacer un seguimiento del material vegetal para detectar las posibles contaminaciones y sacar de la cámara de cultivo los recipientes contaminados.

Ejemplos de algunos materiales vegetales establecidos in vitro Material vegetal Vegetal origen

Naranjo

(Citrus

(^) si nensis)

semillas

Laurel

(Laurus.

Nobilis

Nogal

(Juglans regia)

Embrión

Patata

(Solanum tuberosum

Brotes

1.4.- ENRAIZAMIENTO IN VITRO

La siguiente fase de un proceso de Micropropagación (etapa III) consiste en inducir el enraizamiento de microtallos obtenidos en el apartado 1.3.

Para inducir el enraizamiento se suele emplear el medio de cultivo MS sin citoquininas y con auxinas. Por ejemplo un medio MS con 1 mg/L de AIB

1.5.- ACLIMATACIÓN

La última fase de una cadena de Micropropagación consiste en la aclimatación a condiciones ambientales de las plantas obtenidas in vitro.

Las microplantas enraizadas in vitro se siembran en un sustrato humedecido de turba/vermiculita (1:1) y se colocan en una cámara de aclimatación con una humedad relativa del 90 %. Durante dos semanas la humedad relativa va disminuyendo hasta alcanzar los valores del ambiente exterior.

Abedul Begonia

Plantas

Productor de humedad

Extractor de aire

3.- CULTIVO DE CALLO

El callo es una masa de células indiferenciadas, coherente y amorfa que se multiplica de una manera desorganizada. Se puede inducir in vitro mediante la transferencia de órganos vegetales establecidos in vitro a medios de cultivo adecuados, que frecuentemente posen la auxina 2,4 D.

En el medio de cultivo UM5 realizado con las sales minerales del MS, 5 mg/l de 2,4-D y 0,25 mg/l de Kinetina se pueden inducir callos en numerosas especies.

El procedimiento de la inducción de callo es el siguiente:

• Tomar las hojas establecidas in vitro y realizar cortes tangenciales al nervio central.
• Colocarlas en una placa Petri con medio de cultivo UM5.
• Mantener el cultivo durante 30 días en oscuridad a 25 ºC.
• Una vez formado el callo, retirar una pequeña porción y subcultivar en medio UM nuevo.

Proceso de inducción de callo a partir de hojas cotiledonares obtenidas en semillas de naranjo

4.- SUSPENSIONES CELULARES

Los cultivos o suspensiones celulares suelen iniciarse colocando un callo friable en un medio de cultivo líquido y en agitación.

Para obtener una suspensión celular se introduce un callo en un matraz con medio de cultivo UM5 líquido y se coloca en un agitador orbital a 150 rpm durante varios días a 25 ºC. hasta que se obtengan células libres. La suspensión celular obtenida se pasa a través de un filtro de 250 m y se añade nuevamente a un matraz con nuevo medio de cultivo. Se vuelve a dejar en agitación a 120 r.p.m. y 25 ºC. durante varios días. La suspensión resultante se puede filtrar y dividir en varias partes para iniciar nuevos cultivos celulares siguiendo los

pasos anteriores. Normalmente las suspensiones celulares se pueden subcultivar cada 10 días.

4.1.-VIABILIDAD DE CELULAS AISLADAS

La viabilidad de las células obtenidas se determina tratando las células con diacetato

de fluoresceína (FDA) según el método de Widholm (1972):

• En frasco se prepara una solución diluida de FDA añadiendo 10 ml medio de cultivo líquido y 1 ó 2 gotas de FDA al 0,1% (p/v) en acetona. Esta solución de FDA se ha mantenido almacenada a 4 ºC hasta su uso.
• En un portaobjetos se coloca una gota de la solución de FDA diluida y otra gota de una suspensión celular.
• Se deja 3 minutos en oscuridad y se mira la preparación en un microscopio con equipo de fluorescencia. Las células vivas presentan un color amarillo verdoso intenso.
• Observando y contando las células con luz ultravioleta y con luz visible se puede calcular el porcentaje de células viables. Para este cálculo se recomienda contar unas 200 células.

5.- EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

La embriogénesis somática consiste en la formación de embriones a partir de estructuras de origen somático.

Células de naranjo obtenidas a partir de callo procedente de cotiledones

suavemente el tubo para que el alginato impregne completamente los embriones. Con una pipeta Pasteur de 2 ml estéril se aspira la solución de alginato conteniendo los embriones y se deja caer gota o gota dentro de la solución de calcio 100 mM. Procurar que la pipeta no toque la solución de calcio Las bolas de alginato cálcico que se han formado se dejan en la solución de calcio durante 45 min para completar el proceso de gelificación. Escoger las bolas con los embriones y secarlas posándolas sobre un papel de filtro esteril.

Los embriones encapsulados se pueden emplear directamente o almacenarlos a bajas

temperaturas o incluso crioconservar.

7. MICORRIZACIÓN CONTROLADA IN VITRO

El cultivo in vitro también es una importante herramienta para el estudio de la relación que se establece entre las plantas y los microorganismos ya que permite un mayor control de diversos factores que pueden afectar a esa interacción. Entre las distintas relaciones planta-microorganismo podemos destacar la que se establece entre las raíces de los vegetales y los hongos micorrícicos.

Se entiende por micorrización controlada la puesta en contacto de un determinado hongo micorrícico con las raíces de una planta concreta, sin la presencia de otros organismos puedan interferir la interacción. Esta micorrización controlada in vitro sería un “cultivo dual”, por existir dos organismos en el mismo recipiente o “cultivo monoxénico” por existir un organismo en contacto con otro.

Para poder realizar una micorrización controlada in vitro es necesario disponer de plantas enraizadas in vitro procedentes normalmente de una cadena proliferativa ( y aislamientos puros del hongo micorrícico.

7.1. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HONGOS MICORRÍCICOS.

La forma más fácil de realizar un aislamiento es retirar, en condiciones asépticas, una pequeña porción del interior de una seta en buen estado y colocarlo en un medio de cultivo adecuado como el Medio Melin Norkans Modificado (MMN). Este medio está compuesto por los siguientes ingredientes:

7.2.- PLANTAS MICROPROPAGADAS

Para este ensayo se emplean microplantas establecidas y enraizadas in vitro en el medio MS-O (Apartado 1.4). Hay que procurar que un porcentaje de raíces no esté sumergido en el medio de cultivo.

7.3.- INOCULACIÓN CON HONGO ECTOMICORRÍCICO

En condiciones asepticas se pone en contacto una pequeña porción del micelio del hongo en crecimiento activo con las raíces de La planta dentro del recipiente de cultivo. El cultivo dual se mantiene en la cámara de cultivo hasta que se observe la formación de micorrizas. Transcurrido este tiempo las plantas micorrizadas se extraen del recipiente, manteniendo intactos los sistemas radicales, y se eliminan con cuidado los restos del medio adheridos. A la lupa se observan las características de las micorrizas formadas.

Nutrientes Minerales (mg/L) CaCl 2 2H 2 O 50 KH 2 PO 4 500 NaCl 25 (NH 4 ) 2 HPO 4 250 MgSO 4 7H 2 O 150 Fetrilon 13 * 100 Vitaminas ( g/l) Tiamina (HCl) 0, Fuente de Carbohidratos (g/L) Glucosa 10 Agar 15 g/L p 5,

Plantas de Abedul inoculadas con el hongo ectomicorrícico Paxillus filamentosus