Técnicas y Métodos Inmunológicos: ELISA, Inmunofluorescencia y Citometría de Flujo - Prof., Resúmenes de Biología Molecular Computacional

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TÉCNICAS DE

LABORATORIO USADAS

CON FRECUENCIA EN

INMUNOLOGÍA

SESIÓN 11

Objetivos: Describir las principales técnicas inmunológicas utilizadas en investigación y diagnóstico clínico. Comparar las ventajas y desventajas de diferentes métodos inmunológicos. Explorar aplicaciones clínicas de las técnicas inmunológicas en enfermedades infecciosas, auto inmunes y cáncer. Demostrar cómo se interpretan los resultados de pruebas inmunológicas en distintos contextos. Explicar el principio de técnicas específicas como ELISA, inmunofluorescencia, entre otras. Analizar la evolución de las técnicas inmunológicas y su impacto en la biotecnología y la medicina.

Base de los métodos inmunoquímicos modernos: Se necesita un antígeno o anticuerpo puro cuya cantidad pueda medirse. Se usa una molécula indicadora (marca) para cuantificarlo. Introducido por Rosalyn Yalow. Usa un radioisótopo como marcador. Se cuantifica con instrumentos que detectan desintegración radioactiva. Ej. Endocrinología: Para medir hormonas como la insulina, el cortisol o la hormona tiroidea. Oncología: Detección de marcadores tumorales como el antígeno prostático específico (PSA). Radioinmunoanálisis (RIA)

-Marcaje con enzima. Se une de forma covalente una enzima al antígeno o anticuerpo.

- Reacción enzimática. La enzima convierte un sustrato transparente en un producto coloreado. - Cuantificación. Se mide la intensidad del color con un espectrofotómetro. Más color = más cantidad de antígeno o anticuerpo en la muestra. Ejemplos: diagnostico de enfermedades infecciosas, autoinmunes, detección de IgE específicos de alergenos, etc. ELISA (Enzimo-inmunoensayo de adsorción).

Identificación y purificación de proteínas Dos de los metodos empleados para identificar y purificar proteinas son la inmunoprecipitacion y cromatografia por afinidad.

Wester Blotting El Western blot es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una proteína específica dentro de una mezcla de proteínas. Se basa en tres pasos principales:

1. Separar las proteínas por tamaño
2. Transferirlas a una membrana.
3. Detectar la proteína de interés usando anticuerpos.

Separar las proteínas por tamaño

1. Preparación de la muestra
2. Adición de SDS
3. Electroforesis en gel
4. Migración de proteínas.
5. Separación por tamaño Resultado: Se forman bandas de proteínas ordenadas por tamaño.

Detectar la proteína de interés usando anticuerpos. Anticuerpo primario: Se une a la proteína de interés.

Anticuerpo secundario: Se une al primario y tiene una marca (fluoróforo).

3. Detección: a. Fluoróforo —> Fluorescencia Esto permite visualizar la proteína y aproximar el tamaño de esta.

Citometría de flujo. Es una técnica de laboratorio que permite analizar células individuales en suspensión, midiendo diferentes características como:

• Marcadores de superficie o internos (usando anticuerpos fluorescentes).
• Tamaño y complejidad celular (mediante dispersión de luz).

Flujo de células a través del citómetro La muestra fluye a través de una boquilla, donde las células pasan una por una en un chorro de líquido. Un láser incide sobre cada célula cuando pasa por el flujo.

Dependiendo de los fluorocromos usados, emiten señales fluorescentes detectadas por el aparato.

• También se mide cómo la luz del láser se dispersa al atravesar la célula:
• Dispersión anterógrada → Indica el tamaño de la célula.
• Dispersión lateral → Indica la complejidad interna (ej. si tiene gránulos citoplasmáticos).

Análisis informático de datos Los datos de fluorescencia se analizan en un gráfico de dispersión (dot plot), que muestra: Eje Y (vertical): Intensidad de fluorescencia 1 (rojo). Eje X (horizontal): Intensidad de fluorescencia 2 (verde).

Análisis de citocinas con microesferas. Es una técnica basada en citometría de flujo.

1. Preparación: Se usan microesferas de distintos tamaños, cada una con un anticuerpo específico contra una citocina y marcadas con fluorocromos.
   2. Interacción con la muestra: Las citocinas en la muestra se unen a sus respectivas microesferas.