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Trabajo de laboratorio, practica de laboratorio, donde se conoce por el microscipio los diferentes microorganismo que se encuentra en nuestras vidas diarias. skskskskskskskskkkkkssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
Tipo: Ejercicios
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Guía de Laboratorio Laboratorio de Biología II Biología celular Temas: Diversidad celular: Procariotas y Tinción de Gram Objetivo general Conocer la composición de las células procariotas Objetivos específicos Conocer algunos representantes de los procariotas. Identificar las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Aplicar alguna técnica de coloración para la observación de microorganismos a través del microscopio. Introducción En la antigüedad los científicos dividieron en dos reinos al mundo animal: Plantas y animales. La introducción del microscopio trajo consigo resultados que evidenciaron que existen microorganismos que no pueden ser considerados en ninguno de los dos reinos ya mencionados.
De otro lado entre las células procariotas se distinguen las bacterias y cianobacterias, estas se distinguen porque: no poseen organelos membranosos internos que asistan las estructuras intracelulares.; el DNA tampoco está unido a proteínas y tienen su propio sistema de duplicación adosado a la membrana plasmática; presentan una pared celular de composición química específica, distinto de la composición de las células vegetales y los hongos. Las bacterias cobran gran importancia debido a las funciones que cumplen en diversas áreas como la industria, la medicina y la agricultura. La mayoría de las células bacterianas son unicelulares, pero son propensas a la agregación. Las bacterias se pueden clasificar de acuerdo a su morfología o su tinción de Gram. En cuanto a la morfología las formas más características son BACILOS , cuando poseen forma de bastón, COCOS cuando su forma es redonda, ESPIRILOS , cuando tiene forma espiral, VIBRIÓN cuando posee forma de coma, si existen agregaciones con una disposición lineal entre los cocos se denominan ESTREPTOCOCO, y si la agregación se
dispone es forma de racimos de denomina ESTAFILOCOCOS. Para la observación de las bacterias, las tinciones se preparan en soluciones acuosas y orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una gran variedad de colores a los microrganismos. Los colorantes no solo funcionan para realizar la tinción directa, sino que también suelen ser útiles para mostrar las funciones fisiológicas de los microorganismos con el empleo de tinciones supravitales. Tinción de Gram La tinción de Gram fue desarrollada por Christian Gram en 1884. A pesar de los años transcurridos desde entonces, la técnica apenas se ha modificado, y es de los primeros eslabones que se tienen en cuenta para la identificación bacteriana. Esta técnica tiene la capacidad de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram Positivas (+), Gram negativas (-). La tinción de Gram requiere de cuatro soluciones
1. Primer colorante : Es un colorante básico que, en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta. 2. Solución mordiente : Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, p.ej., el Lugol. 3. Agente decolorante : es un disolvente orgánico, p.ej. alcohol-acetona (1:1). 4. Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, p.ej., la safranina o la fucsina. Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram+ se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram- perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las Gram+ poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las Gram-, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula. Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. P.ej. las bacterias Gram+ en fase estacionaria pueden aparecer como Gram-.
Figura 3. Secado de la muestra por calentamiento. Tomado de Google Parte 2 Técnicas para la coloración de las bacterias. Cada una comprende varios pasos como se explica a continuación: Coloración simple: Preparar un frotis según la técnica antes descrita. Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones. Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno y dejar enfriar 1 min (o cristal violeta y dejar 30s). Lavar con agua. Secar con papel filtro o encima del mechero. Figura 4. Adiciones de colorantes durante procedimiento. tomado de Google Observar al microscopio y determinar forma, disposición y relación de tamaños de las distintas bacterias.
Coloración de Gram (técnica de Hucker) Preparar un frotis según la técnica antes descrita. Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones. Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua del grifo. Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95%( decolorante de Gram) y dejar 30 seg moviendo suavemente la lámina. Seguir lavando hasta que éste no arrastre más colorante. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina o Fucsina de Gram y dejar 1 min. Lavar y secar. Observar con los objetivos y determinar forma, disposición y relación de tamaños de las distintas bacterias. Describa sus observaciones.
Las bacterias Gram + se observarán de color azul- violeta y las Gram- rosadas. Determinar forma, disposición y tamaño relativo y reacción al Gram de las diferentes bacterias presentes. Podrá detectar dos tipos de
bacterias: Streptococus thermophilus , el cual forma largas cadenas de células esféricas alineadas, este es el responsable de la acidificación de la leche y Lactobacilus bulgaricus compuesto por las células bacilares largas y finas, el cual genera la trasformación de la leche a yogurt. Figura 5. Resumen de tinción de Gram. Tomado de Google. Relación de células procariotas y eucariotas. Tomar un palillo de dientes y realizar un frotis sobre el epitelio interno de la mejilla y colocarlo sobre un portaobjetos haciendo zigzag sobre el y teñir con azul de metileno. Salir del laboratorio y consumir un poco de yogurt. Esperar dos minutos y realizar un frotis de la mejilla interna. Esparcir la muestra sobre un portaobjetos; dejar secar y teñir con azul de metileno Secar y observar las células procariotas adosadas sobre las células del epitelio escamoso de la mejilla. Describir sus observaciones
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS ¿Porque se debe utilizar coloraciones para observar los microorganismos?
¿Para qué se emplea la coloración de azul de metileno?
**¿Según Gram como se dividen las bacterias?
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