LABORATORI
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INTEGRAT III
WESTERN BLOT
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Protocolo Gels Sds-Page, Apuntes de Microbiología
Asignatura: te, Profesor: , Carrera: Microbiologia, Universidad: UAB
Tipo: Apuntes
2012/2013
1 / 19
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LABORATORILABORATORI
INTEGRAT III^ WESTERN BLOT
PROTOCOLO GEL SDS-PAGE 1. Mezclar en un tubo eppendorf 10 ul de muestra con 2,5 ul de buffer de carga (5x).2. Aplicar el marcador de peso molecular y cada muestra a cada uno de los pocillos delgel SDS-PAGE.gel SDS PAGE.3. Rellenar la cubeta y la cavidad que queda arriba con
running buffer
(1x).
4 Conectar los cables a la fuente haciendo coincidir cada cable con la ranura de su color4. Conectar los cables a la fuente, haciendo coincidir cada cable con la ranura de su color.5. Separar las proteínas aplicando un voltaje de 200V. Esperar a que el frente salga delgel (el colorante azul indicará el frente de exclusión). 6. Recuperar la parte del gel correspondiente al
resolving
, separando con cuidado los
cristales y eliminando la parte de arriba (
stacking
7 Incubar con agua para eliminar los restos del
running
buffer
7. Incubar con agua para eliminar los restos del
running
buffer
8. Mantener la membrana con tampón de lavado hasta el revelado.
PROTOCOLO IMMUNODETECCIÓN 1. Colocar la membrana en un recipiente y bloquear con10 ml de tampón de bloqueo o/n a 4ºC, para evitar lasuniones inespecíficas de los anticuerpos.
Fosfatasa alcalina
2. Lavar durante 5 min (3x) con 10ml de tampón delavado en agitación a RT (temperatura ambiente) o37ºC.
anticòs secundari
3. Incubar con el anticuerpo primario (anti-His o anti-Rec) en
un
volumen
final de
10ml de
tampón de
bloqueo durante 1h a TA (o 30
a 37ºC) en agitación.
anticòs primari
4. Lavar durante 5 min (4x) con abundante tampón delavado y en agitación a TA o 37ºC.
Prot.
Prot.
5.^
Incubar
con
el
anticuerpo
secundario
diluido
en
tampón de bloqueo durante 1h a TA (o 30
a 37ºC) en
agitación. 6. Lavar durante 5 min (4x) con abundante tampón delavado y en agitación a TA o 37ºC. 7 Mantener la membrana con tampón de lavado hasta7. Mantener la membrana con tampón de lavado hastael revelado.
PROTOCOLO REVELADO
NBT/BCIP
1.^
Lavar 5 min con 10 ml de tampónde detección APB, en agitación aRT
Fosfatasaalcalina
anticòs secundari
RT
.
- Incubar con la solución de detección(NBT/BCIP 200
μ
L + 10 ml tampón
anticòs primari
(NBT/BCIP
200
μ
L^
+^
10
ml
tampón
APB).3.^ Parar
la
reacción
a
medida
que
Prot.
Prot.
q
aparezcan las bandas con dH
O. 2
Prot
Prot
Prot
.^
Prot.
GEL ELECTROFORESIS SDS-PAGE El gel que hacemos en este práctica es discontinuo, con una parte concentradora( stacking)
y otra separadora (
resolving)
STACKING
El
H
d^
l^
l^
li i
d^
i^
t^
d^
l
STACKING
El
pH es de 6.8, con lo que la glicina corre despacio, concentrando las
proteínas. Además la concentración de acrilamida es baja, con lo que no frena elmovimiento de las proteínas. RESOLVING
El
H
d^
l^
l^
t í
d^
lib^
t^
l
RESOLVING
. El pH es de 8.8, con lo que las proteínas pueden correr libremente en el
gel. La concentración de acrilamida es más alta, separando las proteínas por Pm.
TAMPÓN DE CARGA Tris
. Tampón que se usa para tamponar el tampón de carga a pH 6.8 (el mismo que el stacking). Dodecilsulfato
sódico
(SDS)
Dodecilsulfato
sódico
(SDS)
Azul de bromofenol
. Colorante utilizado como marcador de avance en electroforesis. Posee
carga negativa a pH superior a 4,6, de modo que migra al ánodo. Al ser una molécula pequeñase adelanta a la mayor parte de las proteínasse adelanta a la mayor parte de las proteínas. Glicerol
. Al tener una densidad alta, ayuda a que la muestra entre en los pocillos.
2 Mercaptoetanol
Agente
reductor
que
se
utiliza
para
romper
los
enlaces
disulfuro
y
2 -Mercaptoetanol.
Agente
reductor
que
se
utiliza
para
romper
los
enlaces
disulfuro
y
asegurarse de que la proteína está completamente desnaturalizada antes de ser cargada en elgel, y de ese modo garantizar que corre de manera uniforme. También se puede utilizar ditiotreitol (DTT)
. El uso de agentes reductores rompen algunas estructuras terciarias y la
estructura cuaternaria (en proteínas oligoméricas)estructura cuaternaria (en proteínas oligoméricas).
Tampón
de
lavado
:^
PBS
- Tween
TBS
1 x
(Tris
- buffered
saline)
SOLUCIONES
Tampón
de
lavado
:^
PBS
- Tween
(TPBS) o TBS-Tween 0,1% (TTBS) - 1 mL Tween-
TBS
1 x
(Tris
- buffered
saline)
Disover las siguientes sales en 800ml ddH2O:
-1000 mL PBS 1x o TBS 1x1L
es
suficiente
volumen
para
la
inmunodetección de 2 membranas
- 8g NaCl- 0.2g KCl- 0.24g KH2PO4- Añadir 10 ml de Tris-HCl 10M
inmunodetección de 2 membranas PBS 1x (Phosphate buffered saline)
Añadir
ml
de
Tris
HCl
M
Ajustar pH hasta 7.4.Ajustar el volumen hasta 1l con ddH2O.
Disover las siguientes sales en 800 ml ddH2O:- 8g NaCl
Autoclavar. Tampón
de
bloqueo:
PBS-Tween
leche 5%
-^8
g^ NaCl
-0.2g KCl- 1.44g Na2HPO4-0.24g KH2PO
leche
- 5 g. leche desnatada en polvo.- añadir70-80 ml tampón de lavado.Di
l^
l^
l^
h^
l^
d^
d
Ajustar pH hasta 7.4.Ajustar el volumen hasta 1l con ddH2O.Autoclavar
- Disolver la leche con la ayuda de una moscay un agitador y enrasar a 100 ml con tampónde lavado. 100
ml
es
suficiente
volumen
para
la
Autoclavar.
ml
es
suficiente
volumen
para
la
inmunodetección de 2 membranas.
SOLUCIONES:Alkaline
phosphatase
buffer
(APB):
Preparar
100ml
de
APB
‐^100
mM
Tris
‐Cl^
pH
‐^100
mM
NaCl
‐^5
mM
MgCl
NBT:
(nitroblue
tetrazolium)
mg/mL
in^
N<N,
‐dimethyl
formamide
BCIP:
bromo
‐^4 ‐chloro
‐^3 ‐indolyl
phosphate)
mg/mL
in^
formamide
ETAPA 1: TRANSFERENCIA ETAPA^ Hay tres métodos para transferir proteínas a las membranas:
1: TRANSFERENCIA
1.Transferencia capilar2 Transferencia por difusión2.Transferencia por difusión3.Transferencia electroforética (“electroblotting”). La más usada(l^
t^
f^
i^
h^
á^
f^
ti^
i^
li^
li^
d
(la transferencia es mucho más efectiva si se realiza aplicandouna diferencia de potencial entre gel y membrana).
Dos tipos:
-Transferencia “submarina”. -Transferencia semiseca.
ETAPA 2: BLOQUEO Sistema para evitar uniones inespecíficas yconseguir una mejorar la relación señal/ruido.L
h^
d^
t d
- Leche desnatada.- Albúmina sérica bovina(BSA)- Caseína, fosfoproteínas de la llet Problemas:-^ quenching
de la señal
- variaciones de lote a lotei^
tibilid d
l^
b^
i
- incompatibilidad con la membrana, enzimas,anticuerpo primario…
ETAPA 4
UNIÓN ANTICUERPO SECUNDARIO MARCADO
ANTICUERPO
SECUNDARIO
:^ con
especificidad
por
la
región
ETAPA
4: UNIÓN ANTICUERPO SECUNDARIO MARCADO
ANTICUERPO SECUNDARIO:
con
especificidad
por
la
región
constante de las inmunoglobulinas de la especie donde se hagenerado el anticuerpo pirmario y generado en una especiediferente. FOSFATASA ALCALINA: • hidroliza
ésteres
de
alcoholes
primarios
y
secundarios,
alcoholes cíclicos alifáticos, fenoles, aminas… • Hidroliza
pirofosfatos
inorgánicos
(a
un
pH
óptimo
aproximado de 8) y fosfatasas 5
´
-terminales de DNA o RNA
d^
d^
i^
l^
d bl
de cadena simple o doble. • no hidroliza fosfodiésteres (R-O-PO2-O-R'; R, R': alkyl grups)
ETAPA 5: REVELADO
Hay
tres
grandes
grupos
de
sistemas
de
revelado
usados en el Western blot: •enzimas, que catalizan una reacción en la cual se formaun
precipitado
con
color,
o
en
la
que
se
emite
quimioluminiscencia.q •radioquímicos, que emiten radiaciones ionizantes. •oro
coloidal,
que
acumulado
localmente
produce
un
color rojizo, y puede actuar como catalizador para ladeposición de plata incrementando así la señaldeposición de plata, incrementando así la señal.
MUESTRAS ANALIZADAS:
- Extracto total.2) Fracción no unida
MUESTRAS
ANALIZADAS:
Fracción no unida.
- Lavado.4) Eluido con mayor absorbancia de cada grupo. 1