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abierto
Exploración de las respuestas del girasol a la
pudrición de la cabeza por Sclerotinia en las primeras
etapas de la infección mediante análisis de RNA-seq
Mónica I. Fass1,7 * , Máximo Rivarola1,7, Guillermo F. Ehrenbolger 1 , Carla A. Maringolo 2 , Juan F.
Montecchia 1 , Facundo Quiroz 2 , Francisco García-García 3 , Joaquín Dopazo Blázquez4,5, H.
Esteban Hopp1,6, Ruth A. Heinz 1 , Norma B. Paniego1,7 Y Verónica V. Lia1,
Pudrición de la cabeza por esclerotinia (SHR), causada por el hongo necrotróficoSclerotinia sclerotiorum, es una de las enfermedades más devastadoras de los cultivos de girasol. A pesar de su presencia en todo el mundo, los determinantes genéticos de la resistencia de las plantas aún se desconocen en gran medida. Aquí, investigamos el patosistema Sclerotinia‑ girasol mediante el análisis de cambios temporales en la expresión génica en una susceptible y dos líneas endogámicas tolerantes (IL) inoculadas con el patógeno en condiciones de campo. El análisis de expresión diferencial mostró poca superposición entre las IL, lo que sugiere un control específico del genotipo de las respuestas de defensa celular posiblemente relacionadas con las diferencias en las estrategias de resistencia a las enfermedades. Las evaluaciones de enriquecimiento funcional arrojaron un patrón similar. Sin embargo, las tres IL alteraron la expresión de genes implicados en el estado redox celular y la remodelación de la pared celular, de acuerdo con los conocimientos actuales sobre el inicio de las respuestas inmunitarias de las plantas. Notablemente, la sobrerrepresentación de ARN largos no codificantes (lncRNA) fue otra característica común entre los IL. Nuestros hallazgos destacan la diversidad de respuestas transcripcionales a SHR dentro de las líneas de reproducción de girasol y proporcionan evidencia de que los lncRNA juegan un papel importante en las primeras etapas de defensa.
El girasol es uno de los cultivos más importantes para la producción de aceite y semillas de alta calidad consumidos tanto por
humanos como por ganado. En los últimos años, la producción de girasol mostró un aumento constante impulsado por un
impulso en el consumo de aceite de girasol (FAO, 2017). Sin embargo, la expansión proyectada del mercado del aceite de girasol
requiere un manejo agronómico apropiado y mejores recursos genéticos para hacer frente a las tensiones abióticas y bióticas.
Entre estos últimos, se debe prestar especial atención a las enfermedades fúngicas, ya que tienen el mayor impacto en el
rendimiento y la calidad de la semilla. 1.
El hongo necrotróficoSclerotinia sclerotiorum es el agente causal de la pudrición de la cabeza de Sclerotinia (SHR) y del tallo (SSR) en girasol. En particular, SHR es una enfermedad recurrente en áreas de cultivo de girasol en todo el mundo. Afecta la calidad del aceite y, en condiciones favorables, puede provocar una pérdida total de producción.1,2. Los fungicidas químicos demostraron ser ineficaces y la reproducción de genotipos resistentes se ha convertido en la estrategia de control más prometedora. 3. Hasta ahora, no hay evidencia de que ningún gen importante controle la resistencia a SHR en girasol. En cambio, las líneas endogámicas (IL) muestran una amplia gama de respuestas de acuerdo con los patrones de resistencia cuantitativa a enfermedades (QDR) según el genotipo.4-8. Durante los últimos 20 años, se han utilizado técnicas de mapeo QTL para desentrañar la complejidad de la respuesta de defensa tanto a SHR como a SSR en girasol. El mapeo biparental ha llevado al descubrimiento de varios loci de efectos principales e interacciones epistáticas.9-11, mientras que el mapeo de asociación ha servido para identificar genes candidatos
1 Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria(INTA),
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Hurlingham B1686IGC, BuenosAires, Argentina. 2
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental AgropecuariaBalcarce, Balcarce, Argentina. 3
Unidad de Bioinfomática y Bioestadística, Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia,España. 4 Área de
Bioinformática Clínica, Fundación Progreso y Salud (FPS), CDCA, Hospital Virgen del Rocío, 41013 Sevilla, España. 5 INB-
ELIXIR-Es, FPS, Hospital Virgen del Rocío, 42013 Sevilla, España. 6 Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
(FBMC), Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FCEyN), Universidad de Buenos Aires (UBA), 1428, Ciudad Universitaria,
Buenos Aires, Argentina. 7 Estos autores contribuyeron igualmente:Mónica I. Fass, Máximo Rivarola, Norma B. Paniego y
Verónica V. Lia. *correo electrónico: [email protected]
INFORMES CIENTÍFICOS | (2020) 10: 13347 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-70315-4 1
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Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com
responsable deS. sclerotiorum resistencia12-14. A pesar de esto, se sabe poco sobre la arquitectura genética de la
resistencia cuantitativa y los componentes funcionales de la respuesta de defensa.
El hongo penetra en la cutícula del huésped por medios mecánicos y secretando un arsenal de enzimas que degradan la pared celular, pequeñas proteínas y toxinas de metabolitos secundarios, siendo el ácido oxálico el principal factor de virulencia. Las plantas enfermas desarrollan lesiones empapadas de agua, necrosis tisular y finalmente presentan esclerocios.15,dieciséisy, en respuesta al daño, pueden activar una serie de mecanismos de percepción y vías de transducción de señales que desencadenan la QDR. 17. La naturaleza polífaga deS. sclerotiorum, que se ha informado que infecta a más de 400 especies de plantas 18 , ha permitido la identificación de genes que responden a patógenos en una variedad de modelos y especies económicamente importantes. De acuerdo con el conocimiento actual de los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta inmune de las plantas, los estudios transcriptómicos enBrassica napus,Arabidopsis thaliana y Glycine max han demostrado que la defensa contraS. sclerotioruminvolucra a miembros de la familia de factores de transcripción WRKY, proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), así como genes relacionados con la transducción de señales, el estado redox celular, la composición de la pared celular y las vías de señalización hormonal19-24. Sin embargo, no hay informes sobre la respuesta transcripcional del girasol a SHR. Aunque la SHR causa constantemente lesiones empapadas de agua y necrosis, la histopatología y el tiempo desde la infección hasta el inicio de los síntomas difieren entre las especies.dieciséis. En particular, los girasoles no muestran síntomas visibles de SHR durante al menos diez días después de la inoculación. 6 , pero se han detectado lesiones microscópicas después de un período de incubación de 24 h en variedades susceptibles y tolerantes, mostrando estas últimas una progresión más lenta de la enfermedad. 25.
El perfil transcripcional en el sitio de la infección proporciona un medio eficaz para reflejar el ciclo epidemiológico natural y
constituye una alternativa atractiva para discriminar entre las respuestas de genotipos con comportamiento contrastante contra la
enfermedad. La secuenciación de ARN (RNA-seq) ha demostrado ser un método poderoso para detectar, mapear y cuantificar las
transcripciones en varias interacciones planta-patógeno, independientemente del tejido que se esté analizando o del conocimiento
genómico previo. 26. Algunos estudios realizados en girasol cultivado han aprovechado las ventajas y la sensibilidad de esta
metodología para identificar genes expresados diferencialmente en condiciones de estrés biótico o abiótico.27,28, y ninguno de
ellos se dirigió alS. sclerotiorum-Interacción de girasol. De hecho, solo dos estudios transcriptómicos de bajo rendimiento se han
centrado en este patosistema.29,30. Además, la mayoría de los análisis transcriptómicos deSclerotiniaLa infección se realizó con
datos obtenidos de plantas sintomáticas.20-22. Sin embargo, los cambios transcripcionales que tienen lugar durante el período
asintomático pueden proporcionar información sobre los mecanismos de defensa iniciales y sobre la diversidad de respuestas a la
enfermedad en diferentes cultivos.
El objetivo de este estudio fue investigar la respuesta transcripcional del girasol durante las primeras etapas de SHR.
Con este fin, los capítulos de control e inoculados de una IL susceptible y dos tolerantes se sometieron a RNA-seq a los 0,
4 y 8 días post-inoculación (dpi) para analizar sus patrones de expresión y obtener una visión integral de los mecanismos
involucrados en la inoculación. defensa contraS. sclerotiorum infección.
Resultados Evaluación de enfermedades. Los IL HA89, HA853 y RK416 se cultivaron en condiciones de campo durante la temporada 2010-11 en la estación experimental INTA Balcarce (Buenos Aires, Argentina). Después de tomar muestras para los experimentos de RNA-seq, se mantuvieron plantas adicionales de las diferentes IL en el campo para evaluar la evolución de la enfermedad y confirmar la eficacia de la inoculación. Los híbridos comerciales ACA861 y Dekalb 3820 se utilizaron como controles susceptibles y tolerantes, respectivamente. Los distintos síntomas de SHR se observaron en todos los casos. Las tres IL y los híbridos mostraron un aumento en los niveles de infección a lo largo del tiempo, como lo demuestran las puntuaciones de incidencia de la enfermedad (DI) y de gravedad de la enfermedad (DS). Los valores de DI exhibieron un incremento rápido en HA89 y ACA 861 y una escalada más lenta en HA853 y Dekalb 3820, mientras que RK416 mostró un comportamiento intermedio.
Descripción general del análisis de RNA-seq. Se asignaron entre 14,1 y 88,04 millones de lecturas por muestra al genoma
de girasol HanXRQ v1 (media 42,18 ± 12,62 millones de lecturas). Un promedio de 64,18 ± 5,91% y 17,62 ± 1,84% de las lecturas se
asignaron de forma única y no exclusiva a la referencia, respectivamente (Fig.1a), mientras que el 18,19 ± 7,33% del total de
lecturas no pudieron mapearse y se excluyeron del análisis (Tabla complementaria S1).
Los niveles de expresión de la transcripción se establecieron a 0, 4 y 8 dpi en capítulos inoculados (I) y control (N) de
IL de girasol HA89, HA853 y RK416 (Tabla complementaria S2). Las transcripciones con más de 1 CPM en la mitad de las
muestras se consideraron para análisis adicionales, que abarcan 31.673 de los 58.050 genes inferidos anotados en el
genoma de girasol HanXRQ v1. 31. De estos, 29.329 corresponden a genes codificadores de proteínas (mRNA) y 2.
corresponden a RNA no codificantes (ncRNA).
Se exploraron las similitudes generales entre las IL y las condiciones puntuales utilizando PCA. Tres muestras de RK
(4_18_RK416_0_I, 1_5_RK416_0_N y 2_11_RK416_8_I) se identificaron como valores atípicos y, por lo tanto, se eliminaron del análisis.
En el PCA final, los dos primeros componentes principales representaron el 57,82% de la variación total y las muestras agrupadas
principalmente por IL, separando las muestras RK416 de las de HA89 y HA853 (Fig.1B). Dentro de las líneas, las muestras se
agruparon según la etapa de desarrollo de la planta (0, 4 y 8 dpi), independientemente de la condición de inoculación, mostrando
las mayores diferencias entre 8 dpi y los puntos de tiempo anteriores. Estos resultados revelan grandes diferencias
transcriptómicas entre RK416 y las otras dos IL e implican un efecto de tiempo creciente, consistente con la progresión de los
síntomas de la enfermedad.
Análisis de genes expresados diferencialmente. Se estimaron los niveles de expresión de las 31.673 transcripciones
para cada tratamiento de inoculación y combinación de tiempo de IL-tiempo. Para validar estos resultados, evaluamos la
correlación entre las relaciones de transcripción (I / N) de RNA-seq y las obtenidas en los ensayos de qPCR a 4 y 8 dpi. Se
compararon entre seis y doce genes para cada IL y punto de tiempo. Solo tres genes estaban disponibles para
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Figura 2. Análisis de DEG. (a) Número de DEG regulados hacia arriba y hacia abajo entre las muestras I y N. (B) Proporción de DEG
en relación con todas las transcripciones expresadas en cada IL distribuidas en los cromosomas. (C) Frecuencia absoluta de DEG a
diferentes intervalos de valores de logFC para cada combinación de punto de tiempo IL (no se muestra 0 dpi).
ID de gen Descripcion funcional HA89_4 HA89_8 HA853_4 HA853_
HanXRQChr04g0102281 NcRNA empalmado - - 7,45 - 2,
HanXRQChr03g0066301 Factor de transcripción IBH1 - 2,35 - - 1,
HanXRQChr10g0282011 N / A - 7.38 - - 6,
HanXRQChr13g0407331 N / A - - 1,42 7.55 -
HanXRQChr11g0350011 Pol poly relacionado con retrovirus del transposón TNT 1-94 - 6,91 7,89 - -
Subunidad de translocasas de membrana interna de importación mitocondrial TIM14-
HanXRQChr13g0418051 - 7,66 - 6,91 - -
HanXRQChr10g0287891 N / A - - - 3,55 3,
HanXRQChr14g0449141 NcRNA empalmado - - 6,37 - 6,
HanXRQChr14g0435741 N / A - - - 7.00 - 6.
HanXRQChr11g0331821 Alcohol deshidrogenasa - - 9.32 - 9,
Tabla 1. Descripción funcional y valores de logFC de los DEG compartidos por las diferentes combinaciones de puntos de tiempo de IL y / o puntos de tiempo dentro de los IL.
Marcador molecular
(MM)
Funcional
DEG Punto de tiempo IL Chr Fuente de QTL Distancia a MM (bp) descripción de DEG
HanXRQChr03g0080031 HA89_4 3 HeAn_R_283.1 BM 106,548 N / A
HanXRQChr03g0080021 HA89_4 3 HeAn_R_283.1 BM 108,115 ncRNA
ATP de caja MUERTA ARN dependiente helicasa 40
HanXRQChr10g0296411 HA853_8 10 ORS437 BM 7.
HanXRQChr14g0449141 HA853_4-8 14 G34 SOY 469,108 ncRNA
Responde a la hipoxia familia
HanXRQChr14g0460321 HA89_8 14 HaCOI SOY 615,
Tabla 2. DEG ubicados en las proximidades de los QTL asociados con la resistencia a SHR mediante mapeo biparental
(BM) o de asociación (AM).
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Análisis funcional. La anotación funcional de DEG se compiló a partir del transcriptoma de girasol HanXRQ v1 31 (Cuadro
complementario S5). El análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) mostró que ningún término de GO estaba
significativamente sobrerrepresentado cuando se consideraba estrictamente la lista DEG. A pesar de la falta de términos
GO enriquecidos entre los DEG en las diferentes combinaciones de puntos de tiempo de IL, al menos un gen de cada
grupo se asoció con procesos de defensa. Estos incluyen glutatión S-transferasa DHAR3, similar al cloroplástico
(HanXRQChr13g0424161, HA89_4 dpi), probable serina treoninaquinasa similar al receptor de repetición rica en leucina
(LRR) At1g07650 (HanXRQChr04g0123251, HA89_8 dpi3, HA89_4 dpi), resistencia parcial similar a la norcoclaurina sintasa
(HanXRQChr13g0397881, HA853_8 dpi), relacionada con la patogenia 1 (HanXRQChr04g0109991, RK416_4 dpi) y alérgeno
principal similar a Pru ar 1 (HanXRQChr03g0090261, RK416_8 dpi), entre otros32-37. Además, se utilizó la ontología
MapMan para organizar los DEG en categorías funcionales principales y relacionarlos con los posibles procesos que
ocurren durante la respuesta de defensa a la infección (Tabla complementaria S6 y Figura complementaria S3). De las 34
categorías funcionales específicas (BIN) de la ontología, 23 estaban representadas por al menos un DEG. Sin embargo, la
mayoría de los DEG se incluyeron en la categoría "no asignados" (BIN 35). Los DEG restantes se relacionaron con mayor
frecuencia con "proteína" (BIN 29), "ARN" (BIN 27), "señalización" (BIN 30) y "transporte" (BIN 34), en los que los procesos
más comunes alterados fueron la degradación de proteínas. , regulación de la transcripción, así como la variación
transcripcional de las quinasas receptoras. Las categorías relevantes para la respuesta de defensa incluyeron "pared
celular" (BIN 10), "metabolismo hormonal" (BIN 17) y "estrés" (BIN 20), que estaban representados en todas las IL. En
general, nuestros resultados revelaron que, aunque había una modulación de procesos similares entre las IL, estaban
mediados por diferentes moléculas biológicas.
Para ampliar la exploración de los términos GO enriquecidos, se aplicó una regresión logística en todo el conjunto de genes,
indexado según los valores de logFC y el valor p ajustado. Este enfoque de análisis de enriquecimiento del conjunto de genes
(GSEA) arrojó un total de 1,128 términos GO sobrerrepresentados (proceso biológico (BP): 704; componente celular (CC): 227;
función molecular (MF): 197) (Tabla complementaria S7). RK416 presentó el mayor número de términos GO enriquecidos, seguido
de HA853 y HA89. Las últimas dos líneas mostraron solo unos pocos términos GO enriquecidos a 4 ppp (55 y 26, respectivamente),
pero estos aumentaron de tres a diez veces a 8 ppp. En comparación, RK416 mantuvo un número similar de términos GO
enriquecidos en ambos puntos de tiempo.
Hubo poca superposición de términos GO enriquecidos entre combinaciones de puntos de tiempo de IL. Solo el 15% de los términos GO fueron compartidos por al menos la mitad de las combinaciones, y solo unos pocos fueron compartidos por cinco o seis de ellos (es decir, fotosíntesis, BP; fotosíntesis, reacción a la luz, BP; biogénesis de ribosomas, BP; parte citosólica, CC; subunidad ribosómica, CC). Después de verificar la redundancia, se identificaron 699 términos GO únicos (BP: 455; CC: 114; MF: 130).
Figura 3 muestra el dendrograma derivado de la matriz de similitud de términos de GO obtenida con GoSemSim, con el LOR
correspondiente representado como un mapa de calor para cada combinación de IL-punto de tiempo. Los LOR de los diferentes
términos de GO fueron asignados por Multidimensional Gene Set Analysis 38 basado en los niveles de expresión de los genes
incluidos dentro de cada categoría. Es de destacar que las categorías funcionales sobrerrepresentadas en HA89 a 8 dpi y RK416 a 4
dpi se derivaron principalmente de genes regulados al alza, mientras que HA853 y RK416 a 8 dpi mostraron el patrón opuesto.
La clasificación de los términos GO según sus similitudes GoSemSim permitió la delimitación de módulos funcionales
(Fig. 3, Tabla complementaria S8). De esta manera, los términos GO aparentemente desconectados se agruparon en
procesos más generales, volviéndose así comparables entre las diferentes combinaciones de puntos de tiempo de IL. En
cuanto a la PA, "procesos metabólicos" fue el principal módulo funcional, es decir, el que incluía el mayor número de
términos relacionados con GO, y, en menor medida, "respuesta a estímulos" y "organización celular y biogénesis"
también estuvieron frecuentemente representados.. En la categoría CC, el módulo funcional principal eran los
"orgánulos", seguido de cerca por los "complejos que contienen proteínas" y los "complejos relacionados con la
membrana y la membrana". En cuanto a MF, el principal módulo funcional fue la “actividad catalítica”. Los módulos
secundarios incluían "vinculación" y "actividad de transporte". En general, los módulos funcionales consistían en términos
GO de todas las combinaciones de puntos de tiempo IL,
Un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes basado en la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de
Kyoto (KEGG) reveló dos identificadores de enzimas KEGG (EC) sobrerrepresentados en HA89 a 8 dpi, ambos pertenecientes a la
clase "Oxidorreductasas". Una CE de la clase “Hidrolasas” se identificó en HA853 a 8 dpi, mientras que ocho CE se identificaron en
RK416 a 4 dpi, la mitad de ellas “Transferasas” y la otra mitad “Hidrolasas”. Finalmente, se identificó una CE clasificada dentro de
“Oxidorreductasas” en RK416 a 8 dpi (Tabla complementaria S9). Aunque todos ellos pueden estar relacionados con procesos de
defensa, las reacciones enzimáticas identificadas en este análisis no fueron completamente concordantes entre los IL.
Estudio de ncRNAs expresados diferencialmente en respuesta aS. sclerotiorum infección. Teniendo en
Teniendo en cuenta que los genes ncRNA no forman parte de los términos GO, pero que con frecuencia estaban representados en
las combinaciones IL-punto de tiempo, se examinó su enriquecimiento en los diferentes grupos mediante pruebas de Irwin-Fisher
(Tabla complementaria S10). La proporción de ncRNA expresados diferencialmente en comparación con la de los ncR-NA
restantes fue significativamente mayor en HA89 en ambos puntos de tiempo, en HA853 a 8 dpi y en RK416 a 4 dpi (valor de p
<0.05) (Fig.4). Según la anotación HanXRQ v1, todos los ncRNA correspondían a la categoría de ncRNA de empalme. Se
consideraron ncRNA largos (lncRNA) en función de la longitud de las transcripciones identificadas (> 200 pb).
Debido a que los lncRNA están involucrados en la regulación transcripcional y postranscripcional de los ARN que codifican
proteínas, utilizamos el algoritmo LncTar para predecir los posibles objetivos de ARNm entre los DEG. Esta herramienta calcula la
energía libre de enlace normalizada (ndG) entre moléculas, estimando así una interacción putativa. Aquí, los genes que codifican
proteínas expresados diferencialmente y los lncRNA de la misma IL a 4 y 8 dpi se utilizaron como entrada para predecir su
capacidad de unión. Identificamos una posible interacción mRNA-lncRNA para RK416, nueve para HA89 y ninguna para HA
(Tabla3). De estos, seis pares se expresaron diferencialmente en diferentes puntos de tiempo y cuatro a 8 dpi. Además, solo cuatro
pares mostraron el mismo comportamiento de expresión.
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Figura 4. Análisis de enriquecimiento de ncRNA para los diferentes tratamientos; *: p <0,05.
lncRNA ARNm / diana
Línea endogámica ID de gen ppp Doblar-cambiar ID de gen ppp Doblar-cambiar ndG Descripción funcional del ARNm
RK416 HanXRQChr01g0005231 8 - 2,68 HanXRQChr14g0427881 4 - 4,46 - 0,4193 N / A
HA89 HanXRQChr08g0221721 4 2,44 HanXRQChr02g0038901 8 - 4,74 - 0,7460 N / A
HA89 HanXRQChr08g0226611 4 - 8,97 HanXRQChr08g0235441 8 - 6.13 - 0.2542 N / A
HA89 HanXRQChr08g0229491 4 5,07 HanXRQChr02g0038901 8 - 4,74 - 0.5924 N / A
HA89 HanXRQChr16g0506901 4 4,72 HanXRQChr17g0559391 8 - 6,99 - 0.2190 Homólogo de quinona oxidorreductasa 2
HA89 HanXRQChr02g0033591 8 - 2,00 HanXRQChr02g0046121 4 - 1,58 - 0,6558 N / A
HA89 HanXRQChr08g0226611 8 - 8,97 HanXRQChr10g0314321 8 3,06 - 0,1667 E3 UFM1- homólogo de ligasa 1
HA89 HanXRQChr13g0406311 8 3,64 HanXRQChr02g0041971 8 - 7,42 - 0,1620 Quinasa 16 activada por mitógenos, parcial
HA89 HanXRQChr13g0406311 8 3,64 HanXRQChr02g0046121 8 - 1,58 - 0,2095 N / A
PREVISTO: proteína no caracterizada LOC
HA89 HanXRQChr13g0406311 8 3,64 HanXRQChr10g0308951 8 2,28 - 0.
Tabla 3. Interacciones putativas de lncRNA-mRNA dentro de DEG.ndG energía libre normalizada,N / A No disponible.
Mediante el análisis transcriptómico de un IL de girasol susceptible y dos tolerantes a SHR, pudimos descubrir nuevos
determinantes moleculares de defensa en condiciones que imitan el proceso de infección natural.
En este estudio, establecimos los perfiles de expresión de más de la mitad de los genes anotados en el genoma del girasol a
través de IL, tratamientos de inoculación y puntos de tiempo. Sin embargo, el número de DEG identificados aquí fue relativamente
bajo en comparación con los que se informan generalmente en los análisis de secuencia de ARN realizados para otros
patosistemas (p. Ej., Gao et al., Kamber et al., Song et al., Wu et al.42-45). En las primeras etapas, SHR se restringe a una pequeña
porción de la inflorescencia. Por lo tanto, la extracción de ARN de todo el conjunto de floretes en cada capítulo puede haber diluido
la señal biológica, lo que limita nuestra capacidad para detectar la gama completa de cambios transcripcionales desencadenados
por el patógeno. Aunque nuestro enfoque puede haber evitado la detección de muchos de los pequeños cambios de expresión
esperados al inicio de la infección, cuando no hay síntomas visibles46,47, es probable que haya detectado variaciones de expresión
más fiables y fuertes. De hecho, se identificaron fácilmente varios DEG a 4 dpi en todas las IL, lo que indica una activación y
amplificación rápidas de las respuestas de defensa de las plantas.
Una comparación de la actividad genética provocada por la infección reveló puntos en común limitados entre las tres IL y entre
puntos de tiempo dentro de las IL. HA89 y HA853 fueron los únicos IL que compartieron DEG y el hecho de que estos tuvieran
expresión opuesta sugiere una ruta convergente que conduce a diferentes respuestas. De los cuatro genes, uno se describe como
un factor de transcripción (IBH1) involucrado en la modulación entre el crecimiento y la inmunidad enA. thaliana 48 , se infiere que
otro es un ncRNA, mientras que los dos restantes no tienen ninguna función conocida. El comportamiento singular de estos genes
puede ser indicativo de su relevancia en la vía de defensa, lo que los convierte en candidatos prometedores para mejorar la
resistencia.24,49. Por otro lado, aunque HA853 y RK416 se han caracterizado como tolerantes a SHR 6 , no tenían DEG en común. La
comparación de puntos de tiempo dentro de IL reveló dos y seis DEG a 4 y 8 dpi en HA89 y en HA853, respectivamente. La
expresión diferencial sostenida de estos genes sugiere una modulación a lo largo del tiempo, en contraste con la respuesta
específica de tiempo observada en la mayoría de los DEG. Contra lo esperado, se detectaron más DEG a 4 dpi que a 8 dpi en RK416,
lo que puede indicar una activación más temprana de los mecanismos de defensa. En conjunto, las líneas tolerantes parecen
desplegar diferentes respuestas al ataque de hongos.
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Este patrón diferencial de defensa es concordante con los diversos orígenes de las IL utilizadas en este estudio y con la
dinámica del proceso de domesticación del girasol, que incluyó una mayor cantidad de genes con un pequeño efecto
fenotípico que en otras especies de plantas domesticadas. 50. Aunque las tres IL examinadas aquí son líneas
mantenedoras, HA89 y HA853 se originaron en EE. UU., Mientras que RK416 se originó en Argentina. HA89 se deriva de la
variedad de semillas oleaginosas nacionales de Rusia "Vniimk 8931" 51 y HA853 del "1975 High Yield Composite", que a su
vez se generó a partir de 11 cultivares rusos con alto contenido de aceite 52. RK416 se desarrolló cruzando el compuesto
Ruso, derivado de las poblaciones de polinización abierta Smena, Arnavirsk, Peredovik y Vniimk, con la variedad Klein,
población argentina a base de variedades rusas, que fueron traídas por inmigrantes judíos como semillas de confitería
(Julio González, com. Pers. com.).
Se sabe queHelianthus Las especies poseen un amplio espectro de mecanismos de defensa no redundantes, muchos de los cuales fueron introducidos en el girasol cultivado a partir de sus parientes silvestres.53,54. El mapeo de QTL ha servido para confirmar la diversidad de fuentes de tolerancia a SHR dentro del germoplasma de mejoramiento.4,11,13,55, mientras que la combinación de datos de mapeo transcriptómico y QTL ha surgido recientemente como una herramienta poderosa para identificar genes candidatos24,56-58. Nuestro estudio transcriptómico mostró que los DEG se distribuían homogéneamente en todos los cromosomas, como se esperaba para un rasgo cuantitativo complejo. Curiosamente, la ausencia de un grupo de DEG también sugiere una introgresión escalonada de las respuestas de defensa, en lugar de grandes bloques de introgresión relativos a la naturaleza derivados de la reproducción moderna. Además, los resultados presentados aquí permitieron refinar la resolución de mapeo del análisis QTL reciente mediante la identificación de cinco DEG que se co- localizaban con las regiones QTL. Las anotaciones funcionales de estos DEG incluyen una ARN helicasa 40 dependiente de ATP de caja DEAD, una proteína de la familia que responde a la hipoxia y dos ncRNA, uno de los cuales se expresó diferencialmente a 4 y 8 dpi en HA853, y el otro no tiene función conocida. Las helicasas de caja MUERTA se han identificado como factores clave de las respuestas al estrés abiótico en las plantas. 59 , y las proteínas que responden a la hipoxia se han relacionado con los factores de respuesta al etileno del grupo VII, que a su vez comprende elementos que desempeñan un papel central en la defensa contra patógenos necrotróficos.60-62. Estas funciones putativas, junto con su relación con los QTL previamente identificados, resaltan el potencial de estos genes como candidatos para mejorar la resistencia.
En este trabajo, se llevaron a cabo diferentes enfoques funcionales para explorar las respuestas moleculares a SHR. Independientemente del método empleado, cada combinación de IL-punto de tiempo mostró una matriz única de términos GO y enzimas catalíticas sobrerrepresentados. Esto sugiere una contribución diferencial de las características específicas de IL a la tolerancia y la susceptibilidad, y la existencia de estrategias de control alternativas implicadas en la respuesta de defensa celular. El agrupamiento adicional de los términos GO en categorías funcionales amplias reveló que los IL compartían mecanismos comunes (es decir, respuestas a estímulos, procesos catalíticos o actividades de transporte alteradas).
Se han descrito dos tipos de resistencia en girasol: resistencia a la penetración y a la diseminación del micelio en los tejidos. 63.
Es probable que el tipo de resistencia esté modulado por las respuestas transcriptómicas provocadas por la infección, ya que
representan la primera línea de defensa y determinan el resultado. Las anotaciones funcionales de los DEG identificados aquí, así
como sus términos GO enriquecidos, pueden estar relacionados con ambos procesos de resistencia. En términos de QDR, muchos
genes causales son responsables de la respuesta de defensa y actúan más allá del reconocimiento de patógenos. 64. La percepción
del patógeno con frecuencia involucra quinasas similares al receptor LRR (RLK), que propagan señales externas a través de su
dominio quinasa.32,sesenta y cinco. Las vías de transducción de señales son luego mediadas por la actividad quinasa / fosfatasa y la
alteración de los flujos iónicos, como Ca2+66,67. Para contrarrestar la infección por patógenos, estas redes de señalización regulan la
actividad de los factores de transcripción, la maquinaria transcripcional, las enzimas y los compuestos antimicrobianos, incluidas
las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR).68-71. De acuerdo con este mecanismo general, se encontró un LRR RLK putativo
en HA89, mientras que en HA89 y HA853 se detectaron candidatos implicados en redes de señalización o factores de transcripción.
Además, se encontraron proteínas putativas PR1 y PR10 reguladas a la baja en RK416 a 4 y 8 dpi. Como lo sugirieron Cregeen et al.
y Upadhyay et al.72,73, la regulación a la baja de las proteínas PR puede ser responsable del retraso en la aparición de síntomas
observados en plantas tolerantes, al bloquear la propagación de hongos. Dado que la expresión de PR1 está relacionada con una
respuesta de ácido salicílico (SA), también se puede inferir que la vía SA se suprime tras la infección en el IL tolerante RK416 74.
De acuerdo con los conocimientos actuales sobre el inicio de las respuestas inmunitarias de las plantas, las tres IL alteraron la
expresión de genes implicados en el estado redox celular.75,76. Además, las IL estudiadas parecen reorganizar la composición de su
pared celular y utilizar compuestos extracelulares durante la defensa. También encontramos genes y términos GO directamente
asociados con las respuestas de defensa, particularmente en RK416 y, en menor medida, en HA853 (p. Ej., Un gen de resistencia
candidato 2 34 ; un gen similar a la S-norcoclaurina sintasa 35 ; o una proteína de estrés universal A 77 ). En general, el análisis funcional
refuerza la idea de la activación de vías de defensa específicas del genotipo. Basado en los términos DEG y GO enriquecidos en los
diferentes IL, RK416 exhibe el más amplio arsenal de recursos para resistir la penetración de hongos, al menos en el entorno en el
que se realizó nuestro experimento.
Cabe destacar que la señal más consistente en la respuesta de defensa del girasol a SHR parece estar relacionada con los
ncRNA. Dos de los cinco DEG encontrados en las proximidades de QTL previamente identificados son ncRNA, dos de cada diez DEG
compartidos por las diferentes combinaciones de puntos de tiempo de IL son ncRNA, y la categoría de ncRNA está
significativamente enriquecida en cuatro de los seis tiempos de IL combinaciones de puntos. Una encuesta de estudios de ARNnc
ha demostrado que los genes que codifican ARN, en lugar de proteínas, tienen funciones tanto estructurales como reguladoras.78,
79. En este estudio, solo pudimos evaluar ncRNAs empalmados de más de 200 nt (es decir, ncRNAs largos) debido a un sesgo hacia
la secuenciación de RNA poliadenilados. Los LncRNA están mal conservados y presentan diversas funciones de síntesis,
procesamiento y regulación. En las plantas, los lncRNA pueden funcionar como genes80-82, transcripción83-85, o reguladores
epigenéticos 86. Además, se sabe que participan en la defensa basal contra el estrés, incluida la respuesta a hongos patógenos,
donde actúan como precursores de ARNs, microARN (miARN) y / o ARN de pequeña interferencia (ARNip).87-91. Recientemente, se
descubrió queA. thaliana Las células secretan vesículas extracelulares similares a exosomas para entregar ARNs enBotrytis cinerea
, un patógeno necrotrófico fúngico afiliado aS. sclerotiorum. Los ARNs transferidos por el huésped inducen el silenciamiento de
genes fúngicos esenciales para la patogenicidad. 92.
Aunque los ncRNA parecen desempeñar un papel importante como primera línea de defensa contra SHR en girasol, aún no se
han determinado los mecanismos específicos por los que operan. El análisis de las interacciones ARN-ARN reveló
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ijkl = μ + GRAMOI + Dj + Tk + Ll + GDTjik + εijkl
que incluye la IL (G) i, el día postinoculación (D) j, el tratamiento de inoculación (T) k y el carril de secuenciación (L) l como factores, y la interacción entre G, D y T.
Para identificar los DEG, se realizaron pruebas de razón de verosimilitud genética entre muestras I y N utilizando el método
glmLRT para cada combinación de puntos de tiempo de IL. Las transcripciones se consideraron expresadas diferencialmente entre
los tratamientos inoculados con ascosporas y simulacros si el valor absoluto de logFC era ≥ 0,6 y el FDR era <0,05.
Validación del análisis de RNA-seq por qPCR. Los ensayos de qPCR, que se realizaron previamente para validar un
experimento de microarrays realizado en las mismas muestras que nuestros análisis de RNA-seq, se utilizaron para confirmar los
niveles de transcripción estimados aquí.
Brevemente, el cDNA para qPCR se sintetizó usando el sistema de síntesis de primera hebra Superscript III (Invitrogen, EE.UU.)
y cebadores hexámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la amplificación, se corrió una mezcla de
reacción de 25 μl que contenía 200 nM de cada cebador, 1 μl de muestra de ADNc y FastStart Universal SYBR Green Master (Roche
Applied Science, Alemania) en un termociclador de placa de 96 pocillos (ABI Prism 7000 Sequence Detection System y software, PE
Applied Biosystems, EE. UU.). Se determinaron las eficiencias de amplificación y los valores de Ct para cada transcripción utilizando
LinRegPCR 101. La expresión relativa de los genes se determinó mediante el "análisis de la comparación de expresiones génicas
relativas por RT-PCR" incluido en el software InfoStat 102. La actina se estableció como estándar interno después de la comparación
con el factor de elongación-1α y la tubulina utilizando el programa Bestkeeper. 103. Los pares de cebadores utilizados para los
ensayos de qPCR se enumeran en la Tabla complementaria S11.
Co-localización de DEG a QTL previamente identificados. Para investigar la correspondencia putativa
entre los QTL informados anteriormente y los DEG identificados aquí, 39 MM asociados con la resistencia a SHR11,
se asignaron al genoma HanXRQ v1 31 utilizando primersearch v6.6.0.0 para PCR in silico 104. Se consideró que los DEG que se
encontraban dentro de un tamaño de ventana de ± 1 Mbp alrededor del MM se co-localizaban con los QTL (Tabla complementaria
S4).
Perfiles funcionales de genes. Para evaluar la sobrerrepresentación de las categorías GO, se realizaron análisis de
enriquecimiento único en DEG de cada IL y punto de tiempo utilizando FatiGO 105.
Clasificación de Mapman 106 se utilizó para interpretar los DEG en el contexto de vías y procesos celulares organizados
jerárquicamente centrados en el metabolismo de las plantas107,108. Para permitir el mapeo, los genes predichos en la anotación del
genoma de girasol HanXRQ v1 se volvieron a anotar a través de la canalización de Mercator utilizandoA. thalianaanotación
funcional 109 , siguiendo a Moschen et al. 110.
Además, también se aplicó un GO GSEA basado en regresión logística a todo el conjunto de genes utilizando la función uvgsa
del paquete mdgsa R 38 , con transcripciones indexadas por logFC y el valor p ajustado. El enriquecimiento se consideró significativo
para p <0.05, después de Benjamini & Yekutieli 111 corrección para pruebas múltiples. Para evaluar las afiliaciones entre los
términos GO sobrerrepresentados, se calcularon las similitudes semánticas utilizando la función goSim del paquete GOSemSim R
112 basado en la anotación de todo el genoma paraArabidopsis 113. A los términos no identificados en esta base de datos se les dio
cero similitud con respecto a los otros términos. Los términos GO se trazaron en mapas de calor de acuerdo con sus valores LOR y
se agruparon por similitudes semánticas utilizando el método de agrupación jerárquica de enlace completo implementado en el
paquete R ComplexHeatmaps.
Finalmente, para explorar los sistemas y la información química recopilada en la base de datos de KEGG, también se realizó un análisis del conjunto de genes de KEGG utilizando la función uvgsa como se describió anteriormente.
Todos los análisis se realizaron basándose en la anotación del gen HanXRQ v1 de Badouin et al. 31.
Análisis de ARN no codificantes expresados diferencialmente. Para incluir ncRNAs en el funcional análisis de enriquecimiento, el número de ncRNA expresados diferencialmente de cada combinación de IL-punto de tiempo se comparó con el número total de ncRNA expresados mediante pruebas bilaterales de Irwin-Fisher utilizando InfoStat 102.
El software LncTar, versión del 10 de noviembre de 2015 114 se utilizó para predecir la interacción entre los ncRNA y los mRNA
expresados diferencialmente en cada IL. Se utilizó la línea de comando de tipo 1 para realizar todas las predicciones de ARNc
frente a todas las ARNm. Siguiendo las recomendaciones de los desarrolladores, se utilizó un límite de ndG de - 0,15 para obtener
predicciones de alta confianza.
Disponibilidad de datos
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado, sus archivos de información
complementaria o se depositan en el archivo de lectura de secuencias de NCBI (ID de envío: SUB5575431, ID de bioproyecto:
PRJNA561716).
Recibido: 6 de noviembre de 2019; Aceptado: 24 de julio de 2020
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Agradecimientos
Esta investigación contó con el apoyo del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (PNBIO 1131022, 1131043), la
Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica (PICT 2011 1365), la Agencia Española de Cooperación Internacional
para el Desarrollo (A1 / 041041/11) y el proyecto DEANN. Agradecemos a Silvio Giuliano y Carlos Antonelli por su
asistencia de campo en INTA Balcarce y a los criadores Julio González y Daniel Alvarez por proporcionar el pedigrí de los
IL. También estamos agradecidos a la Dra. Silvia Pietrokovsky, quien amablemente revisó el inglés del manuscrito.
Contribuciones de autor MIF, MR y FGG analizaron los datos de RNA-Seq. FOMIN, MR y JFM elaboraron las cifras. GFE realizó la prueba de campo, evaluó la progresión de la enfermedad, genotipificó las IL y aisló el ARN. CAM y FQ ayudaron con la prueba de campo. RAH, NBP y VVL concibieron y diseñaron el estudio. MIF, MR y VVL escribieron el manuscrito principal. HEH y JDB contribuyeron al trabajo mediante la interpretación y discusión de los datos. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Información adicional
Información suplementaria está disponible para este documento en https://doi.org/10.1038/s41598-020-70315-4.
Correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse al FOMIN Información sobre reimpresiones y permisos
está disponible en www.nature.com/reprints.
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INFORMES CIENTÍFICOS | (2020) 10: 13347 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-70315-4 13
Vol.:(0123456789)
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(2020) 10: 13347 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-70315-4 14
