Tema 8: DNA recombinant
ESQUEMA CLONAJE:
•PURIFICAR EL DNA A CLONAR Y EL VECTOR CORRESPONDIENTE.
•CORTAR ADEQUADAMENTE EL DNA. (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN)
•UNIR FORMANDO EL DNA RECOMBINANTE (LIGACIÓN)
•TRANSFORMACIÓN/TRANSFECCIÓN (CELULA HUESPED)
•SELECCIÓN CLONES RECOMBINANTES
•UTILIZACIÓN DE ESTE CLON
LLIGACIÓ.
Enzims de restricció
Tallen el DNA en un lloc específic de seqüència.
• Extrems: protuberants/cohesius
• Extrems roms:
Aquests enzims es poden classificar en:
• Amb dianes diferents però compatibles: diferents enzims que tallen diferents dianes donen extrems
compatibles entre ells. Els extrems formats, es podran tornar a unir però no formaran la mateixa diana
• Isoquizomers: reconeixen exactament la mateixa diana però tallen entre pb diferents. Poden generar dianes
compatibles o incompatibles.
• Dianes múltiples no compatibles: la diana es la mateixa però els extrems no son compatibles.
T4 DNA_Ligasa
Forma enlaces fosfodiéster
Acción inversa a les endonucleasas
Requiere ATP y un fosfato en el 5’ y un OH en el 3’
Más eficiente con extremos cohesivos pero también puede unir extremos romos
No son específicos de secuencia
Problemas reacción ligación.
1-extremos no compatibles (imposibilidad de usar enzimas compatibles)
–Generación extremos romos,
–Unión linkers,
–Formación de colas homopolimericas,
2-Uniones de extremos no deseadas:
-estudiar la cinética de la reacción. Determinar la relación inserto/vector (normalmente 3:1)
-evitar la religación del vector
Utilitzant una fosfatasa per carregar-te els fosfats del teu plasmid ja tallat, així no es pot recircularitzar per la lligasa
(necessita extrems fosfat). Així només es lliga el teu insert amb el plasmid.
Unión de linkers sintéticos
DNAs linkers son fragmentos de DNA doble cadena sintetizados químicamente que incluyen una diana para un
enzima de restricción repetida varias veces.
Síntesis de colas homopoliméricas
